Süüfilise seroloogiline diagnoos. Tserebrospinaalvedeliku analüüs. Valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused

Süüfilise seroloogiliseks testimiseks, Wassermanni reaktsioon kolme antigeeniga ja Colmeri reaktsioon. Nende reaktsioonide positiivsuse astet näitab plusside arv: + + + + (järsult positiivne), + + + (positiivne), ++ või + (nõrgalt positiivne), ± (kahtlane), - (negatiivne). Wassermani ja Kolmeri reaktsioonide järsult positiivsete tulemustega viiakse läbi reagiinide kvantitatiivne määramine (vastavalt Boasi meetodile), mis võimaldab hinnata ravi efektiivsust ja aitab eristada varajast ja hilist latentset süüfilist. Reagiinide tiitri langus näitab ravi terapeutilist efektiivsust ja varajase latentse süüfilisega patsientidel tuvastatakse tavaliselt kõrge reagiinide tiiter.

Tänu ennetavate uuringute suurele mahule ja CSR-i läbiviimise keerukusele on see nüüd laialt levinud ekspressmeetod süüfilise serodiagnostikaks, mida kasutatakse sõeltestina. Reaktsioon viiakse patsiendi verega.

Sel eesmärgil kasutatakse seda ka VDRL reaktsioon(Suguhaiguste uurimislabor). Sel juhul võetakse patsiendi vereseerum ja lipoidne antigeen. VDRL suudab kvantifitseerida ringlevaid antikehi (1:2:4:8:16).

Mõnel juhul võivad tekkida seroloogilised reaktsioonid valepositiivne. Valepositiivseid seroreaktsioone täheldatakse malaaria, tüüfuse, korduva palaviku, pidalitõve, brutselloosi, kopsupõletiku, sarlaki, pahaloomuliste kasvajate korral, menstruatsiooni ajal, 2 nädalat enne sünnitust ja 3 nädala jooksul pärast sünnitust, pärast alkoholi, rasvase toidu, teatud ravimite võtmist, krooniliste püogeensete protsessidega, maksahaigustega jne. Patsientide vanusega suureneb mittespetsiifiliste valepositiivsete tulemuste arv vastavalt standardsetele seroreaktsioonidele.

Täpsemad reaktsioonid süüfilise diagnoosimiseks on kahvatu treponema immobilisatsioonireaktsioon (RIBT) ja immunofluorestsentsreaktsioon (RIF). Nende abiga on võimalik eristada valepositiivseid standardseid seroloogilisi reaktsioone tõeliselt positiivsetest, need võimaldavad tuvastada süüfilise infektsiooni hilise vormiga patsiente, mis esinevad negatiivsete klassikaliste reaktsioonidega. RIBT roll on hindamatu seroloogiliste reaktsioonide valepositiivsete tulemuste äratundmisel rasedatel, kui on vaja otsustada lapse nakatumise üle.

Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon(RIBT). Uuringu materjaliks on patsiendi seerum. Reaktsiooni olemus seisneb selles, et immobilisiinide, uuritava seerumi ja aktiivse komplemendi juuresolekul kaob kahvatute treponeemide liikuvus. G-klassi immunoglobuliinide hulka kuuluvad immobilisiinid ilmuvad patsientide vereseerumis hiljem kui teised antikehad. Seetõttu muutub see positiivseks hiljem kui standardsed seroreaktsioonid ja RIF. Reaktsiooni hinnatakse kuni 20% kahvatu treponema immobiliseerimisega - reaktsioon loetakse negatiivseks; immobilisatsiooniga 21-50% kahvatutest treponeemidest - nõrgalt positiivne; immobilisatsiooniga 50 kuni 100% - positiivne. RIBT on positiivne troopiliste treponematoosidega patsientidel. Mõnikord on reaktsioon valepositiivsed tulemused sarkoidoosiga, erütematoosiga, tuberkuloosiga, maksatsirroosiga, ateroskleroosiga jne. Eakatel on valepositiivsete tulemuste protsent veidi suurenenud. Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF). Põhimõte põhineb fluorokroomiga märgistatud ja vastavate antigeenidega kombineeritud fluorestseeruvate antikehade tuvastamisel. Saadud kompleks helendab hästi fluorestsentsmikroskoobi sinakasvioletsete kiirte all. Reaktsioon on väga tundlik, säilitades samas kõrge spetsiifilisuse. See muutub positiivseks 3-4. nädalal pärast süüfilisega nakatumist. Selle reaktsiooniga tuvastatud antikehad kuuluvad immunoglobuliinide A rühma.

Reaktsioonil on mitu modifikatsiooni: RIF-10, RIF-200, RIF-abc. Esimest reaktsiooni peetakse tundlikumaks, kahte viimast spetsiifilisemaks. Seetõttu on RIF-10 ette nähtud süüfilise infektsiooni varajaseks diagnoosimiseks, RIF-200 CSR-i mittespetsiifiliste tulemuste tuvastamiseks, samuti muude haigusvormide, sealhulgas latentse süüfilise diagnoosimiseks. Treponema pallidum'iga absorptsiooni immunofluorestsentsreaktsiooni peamised eelised on selle üsna kõrge ja kiiresti arenev reaktiivsus.

Selle reaktsiooni antigeen on süüfilise poolt mõjutatud küüliku munandite kahvatute treponeemide suspensioon, mis on kinnitatud atsetooniga klaasklaasile. Kasutada võib isotoonilises naatriumkloriidis suspendeeritud lüofiliseeritud treponema pallidum'i. Inaktiveeritud seerumit inkubeeritakse sorbendiga (Reiteri treponema), et absorbeerida rühma mittespetsiifilisi antikehi. Reaktsiooni edasine kulg viiakse läbi RIF meetodil.

Treponema pallidum immuunadhesioonireaktsioon(RIPBT). See põhineb süüfilisehaige seerumi poolt sensibiliseeritud virulentsete kudede treponeemide võimel kleepuda viimase pinnale komplemendi ja erütrotsüütide juuresolekul. Erütrotsüütidega segu tsentrifuugimisel sadestuvad kleepunud kahvatud treponeemid ja kaovad supernatandist. RIP-i kasutatakse süüfilise vormide diagnoosimisel, kui anamneesi andmete, kliiniku ja CSR-i tulemuste põhjal ei ole võimalik haiguse diagnoosi kinnitada, mittespetsiifiliste CSR-i tulemuste eristamisel ja jälgimisel pärast ravi lõppu. Spetsiifilisuse ja tundlikkuse poolest on RIPBT lähedane RIBT-le ja RIF-ile.

Passiivne hemaglutinatsiooni reaktsioon(RPGA). Meetodi põhimõte seisneb selles, et formaliseeritud toonis lambaliha erütrotsüüdid kombineeritakse patogeense treponema pallidum'i ekstraktiga ja saadud kompleks fikseeritakse erütrotsüütidele. See on korpuskulaarne antigeen. Kui see interakteerub homoloogsete antikehadega, tekib immuunkompleks, mis põhjustab erütrotsüütide aglutinatsiooni.

===================================

Kui süüfilist ei ravita, hakkavad patsiendi siseorganid mõne aasta pärast kokku kukkuma. Inimene võib kannatada aastakümneid ja surm on valus. Süüfilise analüüs võimaldab teil haigust õigeaegselt diagnoosida ja määrata ravi, eelkõige antibiootikumravi. Kui kaua ravi kestab, sõltub haiguse staadiumist ja õigest ravist: algstaadiumis saab haigust kõrvaldada kolme kuni nelja kuuga. Süüfilist ei saa iseseisvalt ravida.

Süüfilist põhjustab bakter nimega Treponema pallidum. See on võimeline kehasse pääsema ka väiksemate kahjustuste kaudu ja kuigi see levib peamiselt sugulisel teel, võib inimene nakatuda ka majapidamistarvete kaudu. Tõsi, peaksite teadma, et üle 48 kraadise temperatuuri juures sureb bakter poole tunni pärast. Seetõttu on steriliseerimine oluline.

Süüfilisel on esmane, sekundaarne, latentne ja tertsiaarne staadium. Haiguse esimesteks tunnusteks on haavand nahal, mis kaob umbes 5 nädala pärast.. Kaks kuud hiljem ilmnevad sekundaarse süüfilise nähud lööbe, haavandite ja sõlmede kujul. Üks selle vormi rasketest tüsistustest on neerukahjustus. Selle seisundiga kaasneb proteinuuria - suurenenud valgusisaldus uriinianalüüsis (üle 2-3 g / l). Lööve kaob tavaliselt mõne nädala pärast ilma ravita.

Kui haigust ei ravita, areneb tertsiaarne süüfilis. See avaldub viis aastat hiljem, kui toimub hävitamine siseorganid. Närviline on mõjutatud südame-veresoonkonna süsteemid, seljaaju ja aju. Neerud, maks, magu, sooled ebaõnnestuvad.

Olukord on eriti ohtlik, kui inimene on HIV-nakkusega. Sarnaselt süüfilisega levib HIV kõige sagedamini sugulisel teel ja seda on raske ravida. Samal ajal on süüfilisega patsientidel oht nakatuda HIV-i ja HIV-i haigetel süüfilisesse. Kui süüfilise tabab HIV-nakatunud inimene, sõltub ravi efektiivsus haiguse staadiumist: mida pikem mees HIV-nakkusega, seda suurem on süüfilise raskete tüsistuste tekkimise oht (eriti kui HIV-nakatunud inimest ei ravita).

Kuidas analüüsi võtta

Kui rääkida sellest, kust süüfilise jaoks verd võetakse, siis vastus on järgmine: HIV määramiseks võetakse materjal veenist. Mõnikord võib arst tellida sõrmeproovi, kuid ainult mittespetsiifiliste kiirtestide jaoks. See on tingitud asjaolust, et venoosse vere jaoks on välja töötatud palju standardeid: sõrmest võetud veres on näitajad erinevad. Lisaks saab sõrmest uuringuks vähem materjali kui veenist. Kui süüfilise tuvastamiseks on vaja võtta proov sõrmest, kasutatakse sama laboratoorset tehnikat, mis täieliku vereanalüüsi jaoks.

Kui sõrme vereanalüüs näitas kahvatu treponema tõenäosust, on vajalik üksikasjalikum, laiendatud uuring. Sel juhul võetakse süüfilise verd ainult veenist: ainult sel juhul on võimalik saada õige negatiivne või positiivne tulemus.

Selline analüüs, nagu määrdumine, on süüfilise ja ka HIV-i puhul ebaefektiivne. Määrimisel puudub haiguse põhjustaja kõigil haiguse etappidel.

Uurimistüübid

Kahvatu treponema antikehade määramiseks veres kasutatakse järgmisi teste:

• RIF või FTA (immunofluorestsentsreaktsioon) - määratakse fluorestseeruvate antikehade absorptsioonireaktsioon.
• TPHA või TPHA (passiivne hemaglutinatsiooni test) - süüfilise analüüs, mis tuvastab IgM antikehad ja IgG.
• ELISA või ELISA - nimi tähistab ensüümi immuunanalüüsi, määrab IgG ja IgM antikehade kvantitatiivse sisalduse.

Süüfilis suudab tuvastada treponemaalseid ja mittetreponemaalseid teste. Esimese süüfilise testiga tuvastatakse veres Treponema pallidum'i antigeenide vastased antikehad. Teine tuvastab antikehad kudede vastu, mille bakter on hävitanud.

ELISA on tõhus testimismeetod, mida tehakse mitte ainult infektsiooni olemasolu kindlakstegemiseks, vaid ka haiguse staadiumi määramiseks. Lisaks suudab ELISA vastata küsimusele, kas antud inimesel on kunagi olnud süüfilis. ELISA tundlikkus võib ulatuda 90% -ni.

ELISA analüüs võimaldab teil määrata Pale treponema antikehi: immunoglobuliinid - G, M, A. Nende kontsentratsioon võimaldab jälgida haiguse kulgu selle dünaamikas.

Vahetult pärast nakatumist toodab immuunsus bakteriga võitlemiseks IgA antikehi, kaks nädalat hiljem - IgM. Kuu aega hiljem ilmuvad IgG. Kui haiguse kliinilised sümptomid hakkavad ilmnema, näitab süüfilise veri piisavas koguses kõigi kolme tüüpi antikehi.

Uuringud näitavad, et süüfilisespetsiifilised IgM antikehad vähenevad pärast tõhusat ravi dramaatiliselt. IgG antikehade eripära seisneb selles, et süüfilise test tuvastab need ka pärast pikka aega pärast paranemist ja kogu patsiendi eluea jooksul. Seetõttu ei tähenda positiivne ELISA tulemus alati süüfilise põhjustaja olemasolu. Positiivse testiga saab määrata nii haiguse arengustaadiumi kui ka selle, et hiljuti on tehtud tõhus ravi ning seetõttu ringlevad veres endiselt antikehad. Negatiivne ELISA tulemus võib tähendada nii haiguse puudumist kui ka selle algust.

Passiivne hemaglutinatsiooni reaktsioon

RPHA viitab spetsiifilistele treponemaalsetele meetoditele patogeeni tuvastamiseks kahvatu treponema. TPHA analüüsimisel antikehade ja erütrotsüütide reaktsiooni käigus kleepuvad viimased kokku ja sadestuvad. Kui palju sadestunud erütrotsüüte RPHA käigus moodustub, on otseselt võrdeline treponema antikehade hulgaga.

RPGA tundlikkus on palju efektiivsem süüfilise sekundaarsel ja tertsiaarsel perioodil - 99%, samas kui esmases analüüsis on analüüsi usaldusväärsus 85%.

RPHA spetsiifilisus võimaldab seda kasutada teiste testide (nt RPR või MRI) diagnoosi kinnitamiseks. Samal ajal ei ole RPHA süüfilise staadiumite suhtes nii tundlik kui ELISA. Seetõttu tuleks RPHA-d ja ELISA-d käsitleda koos. RPHA valepositiivne tulemus on võimalik 2,5% juhtudest. See on võimalik tänu immunoglobuliinide sarnasusele teiste antikehadega, mis vabanevad mõnes teises haiguses, näiteks autoimmuunhaiguses.

Wassermani reaktsioon

Seroloogiliste reaktsioonide kompleks (CSR), millest üks on tuntud kui Wassermanni reaktsioon, on väärtuslik diagnostiline meetod. See võimaldab teil tuvastada infektsiooni ja määrata haiguse staadiumi. Süüfilise DAC-i vereanalüüsi tuleb tingimata täiendada treponemispetsiifiliste analüüsimeetoditega (RIBD ja ELISA). CSR testiks kasutatakse veiste südamelihasest ekstraheeritud antigeene, mis on oma omadustelt sarnased kahvatu treponema antigeenidega.

CSR ei ole spetsiifiline süüfilise test: positiivne CSR on võimalik tuberkuloosi, malaaria, autoimmuunhaiguste, onkoloogia, raseduse ja muude seisunditega patsientidel. Süüfilise analüüs raseduse ajal on kohustuslik, kuna selle haiguse esinemine rasedal naisel võib põhjustada raseduse katkemist või kaasasündinud vaevusega lapse sündi.

Ekspressmeetod on Wassermani reaktsiooni kiirendatud versioon. Süüfilise kiirtesti läbiviimisel kasutatakse ka kardiolipiidantigeeni, mis segatakse spetsiaalse klaasplaadi süvendis seerumiga.

Kui kaua testi sooritamiseks kulub, sõltub sageli kasutatud tehnikast. Tavaliselt on kiirmeetodi täitmisaeg umbes pool tundi.

Ekspressmeetodi reaktsiooni tulemust hinnatakse samamoodi nagu CSR-i, positiivsete arvudega vahemikus 0 kuni +4. Ekspressmeetodi tundlikkus, ehkki parem kui CSR, võib anda valepositiivse tulemuse mõne muu haiguse tõttu.

ORS ja UMSS on Wassermani reaktsiooni või ekspressmeetodi teine ​​variant. Lühendi UMSS dešifreerimine tähistab latentse süüfilise kiirendatud meetodit. ARS tähistab süüfilise skriinimisreaktsiooni. ORS-i läbiviimisel kasutatakse samu reaktiive, mis Wassermani reaktsioonis.

Kuidas tulemust hinnata

Täpsete andmete saamiseks tuleb süüfilise verd võtta tühja kõhuga. Tühja kõhu kontseptsioon tähendab, et söögikordade vahel peaks olema vähemalt kaheksa tundi. Kui patsient tuli analüüsi tegema tühja kõhuga, kuid viimati sõi vähem kui kaheksa tundi, peab ta ootama. Paastumise mõiste tähendab ka seda, et enne analüüsi ei tohi juua ühtegi jooki, välja arvatud gaseerimata vesi. Analüüsid võetakse tühja kõhuga mitte ainult süüfilise diagnoosimiseks: see on üldreegel.

Süüfilise testi negatiivset tulemust näitab märk "-". Aga negatiivne tulemus ei tähenda alati, et organismis pole patogeeni. Sagedamini tekib Wassermani reaktsioonil põhinevate kiirtestide dešifreerimisel valenegatiivne tulemus. Seetõttu saate lõõgastuda ainult siis, kui kõigi analüüside andmed annavad negatiivse tulemuse.

Süüfilisega patsientide kõrgeim usaldusmäär on PCR-i tulemus. Kui PCR on positiivne, tähendab see, et see on tõepoolest positiivne. Kui tõlgendus on negatiivne, siis on see negatiivne. Kuid PCR suudab näidata positiivset tulemust isegi pärast edukat ravi, kuna see suudab määrata nii elusate kui ka surnud bakterite olemasolu. Teised testid võivad pärast edukat ravi anda vale tulemuse.

Ravi anonüümsus

Inimesed, eriti mehed, väljendavad harva soovi regulaarselt arsti poolt läbi vaadata. Mis puutub süüfilisesse, siis selle põhjuseks võivad olla nii loiu haiguse sümptomid, mis ei avaldu, kui ka häbi, soovimatus haigusest teistele teada anda.

Seetõttu on paljud inimesed sageli nõus läbima anonüümse läbivaatuse, samas soovivad nad saada garantiid, et ravi on ka tõeliselt anonüümne. Loomulikult ei teki probleeme süüfilise analüüsi anonüümselt edastamisega. Need tekivad siis, kui patsient soovib, et teda ravitaks anonüümselt. Fakt on see, et inimene on ohtliku suguhaiguse kandja ja võib nakatada nii oma lähedasi kui ka kõrvalseisjat. Seetõttu ärge mingil juhul kõhklege ja ravi ajal on hädavajalik järgida kõiki arsti juhiseid.

Piirkondlike lümfisõlmede punktsioon

Seroloogiline diagnoos

• Wassermani reaktsioon (RV),
• Kahni ja Sachs-Vitebsky settereaktsioonid (tsütokoolsed),
• reaktsioon klaasile (ekspressmeetod),

• Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (RIBT),
• immunofluorestsentsreaktsioon (RIF).

Wassermani reaktsioon (RV)

Tavaliselt asetatakse RV kahe või kolme antigeeniga. Kõige sagedamini kasutatakse ülitundlikku kardiolipiini antigeeni (kolesterooli ja letsitiiniga rikastatud veise südameekstrakt) ja treponemaalset antigeeni (anatogeense kultiveeritud treponema pallidum'i ultraheliga töödeldud suspensiooni). Koos patsiendi vereseerumi reaginidega moodustavad need antigeenid immuunkompleksi, mis on võimeline komplementi adsorbeerima ja siduma. Moodustunud kompleksi (reagins + antigeen + komplement) visuaalseks määramiseks kasutatakse indikaatorina hemolüütilist süsteemi (jäära erütrotsüütide segu hemolüütilise seerumiga). Kui komplement on seotud reaktsiooni 1. faasis (reagins + antigeen + komplement), hemolüüsi ei toimu - erütrotsüüdid sadestuvad kergesti märgatavaks sademeks (PB positiivne). Kui komplement ei ole 1. faasis seotud reagiinide puudumise tõttu testitavas seerumis, kasutab seda hemolüütiline süsteem ja toimub hemolüüs (PB negatiivne). Hemolüüsi raskusastet RV taustal hinnatakse plusside järgi: hemolüüsi täielik puudumine ++++ või 4+ (RV järsult positiivne); vaevu alanud hemolüüs +++ või 3+ (PB positiivne); oluline hemolüüs ++ või 2+ (PB nõrgalt positiivne); arusaamatu pilt hemolüüsist ± (RV kahtlane); täielik hemolüüs - (Wassermanni reaktsioon on negatiivne).

Lisaks RV kvalitatiivsele hindamisele on olemas kvantitatiivne koostis erinevate seerumi lahjendustega (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reagiinide tiiter määratakse maksimaalse lahjenduse järgi, mis annab siiski teravalt positiivse (4+) tulemuse. RV kvantitatiivne koostis on oluline süüfilise infektsiooni mõnede kliiniliste vormide diagnoosimisel, samuti ravi efektiivsuse jälgimisel. Praegu on Wassermani reaktsioon lavastatud kahe antigeeniga (kardiolipiini ja treponemaalse kõlaga Reiteri tüvi). Reeglina muutub RV positiivseks 5-6 nädalat pärast nakatumist 25-60% patsientidest, 7-8 nädalat - 75-96%, 9-19 nädalat - 100%, kuigi viimased aastad mõnikord varem või hiljem. Samal ajal suureneb reagiinide tiiter järk-järgult ja saavutab maksimumväärtuse (1:160-1:320 ja rohkem) üldiste löövete (sekundaarne värske süüfilis) ilmnemisel. Kui RV on positiivne, diagnoositakse esmane seropositiivne süüfilis.
Sekundaarse värskega ja sekundaarse korduva süüfilise korral on RV positiivne 100% patsientidest, kuid immuunpuudulikkusega alatoidetud patsientidel võib täheldada negatiivset tulemust. Seejärel väheneb reaginide tiiter järk-järgult ja sekundaarse korduva süüfilise korral ei ületa see tavaliselt 1:80-1:120.
Tertsiaarse süüfilisega RV on positiivne 65–70% patsientidest ja tavaliselt täheldatakse madalat reagiini tiitrit (1:20–1:40). Süüfilise hiliste vormide (siseorganite, närvisüsteemi süüfilis) korral täheldatakse positiivset RV-d 50-80% juhtudest. Reagiini tiiter on vahemikus 1:5 kuni 1:320.
Latentse süüfilisega positiivset RV-d täheldatakse 100% patsientidest. Reagiini tiiter on vahemikus 1:80 kuni 1:640 ja hilise latentse süüfilise korral 1:10 kuni 1:20. Reagiinide tiitri kiire langus (kuni täieliku negatiivsuseni) ravi ajal näitab ravi efektiivsust.

Wassermanni reaktsiooni puudused- tundlikkuse puudumine esialgne etapp primaarne süüfilis on negatiivne). Samuti on see negatiivne 1/3 patsientidest, kui neid on varem antibiootikumidega ravitud, tertsiaarse aktiivse süüfilisega patsientidel, kellel on naha ja limaskestade, osteoartikulaarse aparatuuri, siseorganite, kesknärvisüsteemi kahjustused, hilise kaasasündinud süüfilisega .
Konkreetsuse puudumine- Wassermani reaktsioon võib olla positiivne isikutel, kes ei ole varem haiged ja ei põe süüfilist. Eelkõige on RV valepositiivseid (mittespetsiifilisi) tulemusi täheldatud patsientidel, kellel on süsteemne erütematoosluupus, pidalitõbi, malaaria, pahaloomulised kasvajad, maksakahjustus, ulatuslikud südameinfarktid müokardi ja teiste haiguste korral ning mõnikord täielikult terved inimesed.
Tuvastatakse lühiajaline valepositiivne Wassermani reaktsioon mõnel naisel enne või pärast sünnitust, narkootikume kuritarvitavatel inimestel, pärast anesteesiat, alkoholi tarvitamist. Valepositiivne RV on reeglina nõrgalt väljendunud, sageli madala reagiinide (1:5-1:20), positiivse (3+) või nõrgalt positiivse (2+) tiitriga. Massiliste seroloogiliste uuringute korral on valepositiivsete tulemuste sagedus 0,1-0,15%. Tundlikkuse puudumise ületamiseks kasutavad nad külma (Collardi reaktsioon) seadistust ja samal ajal seatakse see muude seroloogiliste reaktsioonidega.

Kahni ja Sachs-Vitebsky settereaktsioonid

Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (RIBT)

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF)

Passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA)

Vere kogumise tehnika seroloogiliste reaktsioonide jaoks

Seroloogiline resistentsus

• Tõsi(absoluutne, tingimusteta) - on vaja läbi viia täiendav antisüüfiline ravi koos mittespetsiifilise raviga, et suurendada keha immuunjõude.
• Sugulane- pärast täielikku ravi kahvatutest treponeemidest moodustuvad tsüstid ehk L-vormid, mis on organismis madala virulentsusega ning sellest tulenevalt ei muuda lisaravi seroloogiliste reaktsioonide, eriti RIF ja RIBT näitajaid.

Pseudoresistentsus- pärast ravi, hoolimata positiivsetest seroloogilistest reaktsioonidest, ei esine kehas kahvatut treponeemi. Antigeeni organismis ei ole, kuid antikehade tootmine jätkub, mis fikseeritakse seroloogiliste reaktsioonide seadistamisel.
Seroloogiline resistentsus võib tekkida järgmistel põhjustel:

• ebapiisav ravi, võtmata arvesse haiguse kestust ja staadiumi;
• ebapiisav annus ja eelkõige patsientide kehakaalu arvestamata jätmise tõttu;
• ravimite kasutuselevõtu vahelise intervalli rikkumised;
• kahvatute treponeemide säilimine organismis vaatamata täisväärtuslikule spetsiifilisele ravile nende resistentsuse tõttu penitsilliini ja teiste keemiaravi ravimite suhtes siseorganite, närvisüsteemi, lümfisõlmede peidetud kahjustuste korral, mis on antibakteriaalsete ravimite jaoks kättesaamatud (sageli leitakse kahvatuid treponeeme armi kudedes palju aastaid pärast ravi lõppu, lümfisõlmedes on mõnikord võimalik tuvastada kahvatu treponeem 3-5 aastat pärast antisüüfilist ravi);
• vähenema kaitseväed juures mitmesugused haigused ja mürgistused (endokrinopaatia, alkoholism, narkomaania jne);
• üldine kurnatus (vitamiinide, valkude, rasvade vaene söömine).

• kaasuvad siseorganite mittespetsiifilised haigused, kardiovaskulaarsüsteemi häired, reuma, endokriin- ja närvisüsteemi talitlushäired, raske krooniline dermatoos, pahaloomulised kasvajad;
• närvisüsteemi kahjustused (rasked vigastused, põrutus, vaimne trauma);
• Rasedus kroonilised mürgistused alkohol, nikotiini ravimid; nakkushaigused (malaaria, tuberkuloos, viirushepatiit, düsenteeria, tüüfus, kõhu- ja korduv palavik s).

Süüfilise seroloogiline diagnoos

Süüfilise diagnoos põhineb kliinilistel ja laboratoorsetel andmetel. Süüfilise diagnoos tehakse alles pärast laboratoorset kinnitust, st kahvatu treponeemi avastamist kõva šankri eritumisel, erosioonsete paapulide avastamist primaarse ja sekundaarse süüfilise korral ning seroloogiliste uuringute andmeid. Seroloogilised reaktsioonid on äärmiselt väärtuslik meetod mitte ainult süüfilise diagnoosi kinnitamiseks, vaid ka selle kulgemise dünaamika jälgimiseks ravi mõjul ja haiguse paranemise määramiseks.

Seroloogiliste reaktsioonide kompleksi (CSR) standardkomponente süüfilise infektsiooni tuvastamiseks täiendavad praegu treponemaalsed reaktsioonid: RIBT (kahvatu treponema immobilisatsioonireaktsioon), RIF (immunofluorestsentsreaktsioon). Wassermani reaktsioon (RW, PB) põhineb komplemendi sidumise nähtusel. Selle valmistamiseks kasutatakse kardiolipiini antigeeni, mis on veise südamelihastest saadud kolesteroolisisaldusega alkoholiekstrakt ja millel on sarnased antigeensed omadused kahvatu treponemaga.

Wassermani reaktsioon. Komplement on seotud kompleksiga (lipoidne antigeen ja testitava seerumi reagin). Moodustunud kompleksi näitamiseks kasutatakse hemolüütilist süsteemi (lamba erütrotsüüdid ja hemolüütiline seerum).

Lisaks komplemendi sidumise reaktsioonile kardiolipiini ja treponemaalsete antigeenidega hõlmas CSR-i rühm reaktsiooni klaasil (ekspressmeetod). Hemolüüsi raskust RV-s näitavad plussid:

järsult positiivne - 4 +; positiivne - 3 +; nõrgalt positiivne - 2 + või 1 +; negatiivne - -.

Oluline on ka reaktsiooni formuleerimine kvantitatiivsel meetodil, st seerumi erinevate lahjendustega (1:10; 1:20 jne kuni 1:320). Standardsete seroloogiliste reaktsioonide paljusus on seletatav kahvatute treponeemide antigeense mosaiiksusega ja seetõttu ilmub patsientide vereseerumis vastav hulk antikehi (komplemendi siduvad, aglutiniinid, sademed, immobilisiinid, immuunfluorestsentsi põhjustavad antikehad jne). . Süüfilise igas staadiumis võivad domineerida teatud antikehad ja seetõttu võivad reaktsioonid mõne antigeeniga olla juba positiivsed, teistega aga negatiivsed. Lisaks nõuab standardsete seroloogiliste reaktsioonide suhteline spetsiifilisus diagnostiliste vigade vältimiseks mitte ühte neist, vaid reaktsioonide kompleksi. CSR muutub positiivseks 3. nädala lõpus või 4. nädala jooksul pärast kõva šankri ilmnemist. Need reaktsioonid on järsult positiivsed ja seerumi märkimisväärses lahjenduses peaaegu kõigil patsientidel, kellel on sekundaarne värske (98–99%), sekundaarne korduv (100%), tertsiaarne aktiivne (70–80%) ja tertsiaarne latentne (50–60%). süüfilis. CSR ei ole aga rangelt spetsiifiline süüfilise reaktsioonikompleks. Need võivad olla positiivsed pidalitõve, tuberkuloosi, brutselloosi, malaaria, erütematoosluupuse, aga ka kopsupõletiku, maksahaiguste, onkoloogilised haigused, peale alkoholi, rasvaste toitude võtmist, raseduse ajal, eriti teisel poolel ja ka esimese 2 nädala jooksul. peale sünnitust. Vanusega suureneb CSR-i mittespetsiifiliste valepositiivsete tulemuste arv.

Süüfilise mõistlikuks diagnoosimiseks võetakse arvesse CSR-i andmeid, kliinilisi andmeid, kahvatu treponema uuringu tulemusi primaarse ja sekundaarse süüfilise ilmingutes, andmeid teiste seroloogiliste reaktsioonide kohta - RIBT ja RIF.

RIBT põhineb kahvatu treponema immobiliseerimisel süüfilisega patsientide vereseerumis esinevate antikehade, näiteks immobilisiinide poolt. RIBT antigeenina kasutatakse küüliku süüfilise orhiidi kudedest saadud kahvatu treponema suspensiooni. Kahvatu treponeemid lõpetavad pärast patsiendi vereseerumi lisamist neile liikumise, st nad on immobiliseeritud. Reaktsiooni tulemusi hinnatakse protsentides: positiivne RIBT tuvastatakse immobiliseerimise ajal 51 kuni 100% kahvatu treponema, nõrgalt positiivne - 31 kuni 50%, kahtlane - 21 kuni 30% ja negatiivne - 0 kuni 20%. . Reaktsioon viiakse anaerobioosi tingimustesse. Immobilisiinid ilmuvad patsientide vereseerumis hiljem kui teised antikehad, seega muutub RIBT positiivseks hiljem kui CSR ja RIF. RIBT on kõige spetsiifilisem olemasolevatest reaktsioonidest süüfilisele. Selle peamine eesmärk on tuvastada valepositiivsed tulemused CSRi koostamisel. See on eriti oluline patsientide puhul, kellel süüfilis on varjatud ilma väliste ilminguteta, kuid siseorganite või närvisüsteemi kahjustusega. RIBT on eriti oluline rasedate naiste CSR-i valepositiivsete tulemuste äratundmisel. Tuleb meeles pidada, et RIBT mittespetsiifilised positiivsed tulemused on võimalikud ka sarkoidoosi, erütematoosluupuse, tuberkuloosi, maksatsirroosi jne patsientidel. Kuid nende haiguste puhul on RIBT nõrgalt positiivne (30 kuni 50%) ega saavuta kunagi 100% ). Antibiootikumidega ravimisel muutuvad RIBT tulemused negatiivseks. Seetõttu viiakse RIBT-i kasutavad uuringud läbi alles 7 päeva pärast, kui manustati vees lahustuvaid antibiootikume, ja 25 päeva pärast durantsete antibiootikumidega ravi lõppu.

REEF- tundlikum reaktsioon, seega on see positiivne juba süüfilise esmasel seronegatiivsel perioodil 80% patsientidest. Spetsiifilisuse poolest jääb RIF alla RIBT-le, mis ei võimalda RIBT-i sellega asendada, kuigi selle tehnika on palju lihtsam. Reaktsioonil on mitu modifikatsiooni: RIF-10, RIF-200 ja RIF-abs. (imendunud). RIF-10 on tundlikum, samas kui RIF-200 ja RIF-abs. täpsemalt. Reaktsiooni põhimõte seisneb selles, et spetsiifiline antigeen (treponema pallidum) kombineeritakse patsiendi vereseerumi (antikehad) ja liigivastase fluorestseeruva seerumiga (küüliku anti-inimese globuliini seerum, kombineerituna fluorestseiiniga, ainega, mis helendab ultraviolettvalguses). . Positiivse reaktsiooni korral on fluorestsentsmikroskoobis näha kahvatute treponeemide kollakasrohelist kuma, kuna neid ümbritsevad neile kleepuvad fluorestseeruvad antikehad. Luminestsentsi astet hinnatakse plussidega, nagu CSR-i puhul. Positiivne reaktsioon on märgitud 4 +, 3 + ja 2. +. Kui luminestsentsaste on 1 + ja luminestsentsi pole, loetakse reaktsioon negatiivseks. Sekundaarse süüfilise korral on RIF positiivne peaaegu 100% juhtudest. Latentse süüfilise korral on see alati positiivne (99-100%) ning tertsiaarsete vormide ja kaasasündinud süüfilise korral 95-100%.

Ekspressmeetod (mikroreaktsioon klaasil). Selles reaktsioonis, nagu ka CSR-is, kasutatakse kardiolipiini antigeeni, millest üks tilk segatakse spetsiaalse klaasplaadi süvendites 2-3 tilga uuritava vereseerumiga. Reaktsioon kulgeb sadestumise mehhanismi alusel. Reaktsiooni kogukestus on 10-40 minutit. Tulemust hinnatakse sademete hulga ja helveste suuruse järgi; reaktsiooni raskusastet näitavad plussid: 4 +, 3 + jne, samuti CSR. Mikroreaktsioon klaasil on süüfilisega patsientidel vähem spetsiifiline kui RV, kuid tundlikkuse poolest on see mõnevõrra parem. Ekspressmeetodi puhul on valepositiivsed tulemused tavalisemad kui RV puhul. Seetõttu on seda meetodit lubatud kasutada ainult selektsioonireaktsioonina elanikkonna massiuuringuteks, kliiniliseks läbivaatuseks ja patsientide uurimiseks somaatiliste haiglate kliinilise diagnostika laborites. Süüfilise lõplik diagnoos selle meetodi alusel on keelatud. Ainult ekspressmeetodit ei saa kasutada doonorite, rasedate naiste uurimisel ja ka süüfilisehaigete ravijärgseks jälgimiseks.

Süüfilise diagnoosimiseks võib kasutada muid meetodeid: ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) koos mikrosadestamisreaktsiooniga (RPM) või passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA) RMP-ga (sh RMP võõranaloogid – RPR või VDRL).

Kliinilise ja seroloogilise kontrolli läbiviimisel pärast spetsiifiline ravi(teraapia efektiivsuse määramiseks) on lubatud RMP kvantitatiivne uuring (reaktsioonitiitri uurimine dünaamikas).

ensüümi immuunanalüüs (ELISA,Eliza). Reaktsiooni põhimõte seisneb tahke faasi kandja pinnale adsorbeerunud süüfilise antigeeni kombineerimises uuritava vereseerumi antigeeniga ja spetsiifilise antigeeni-antikeha kompleksi tuvastamises ensüümiga märgistatud liigivastase immuunseerumi abil. ELISA tundlikkus ja spetsiifilisus on sarnased RIF-iga.

Passiivse hemaglutinatsiooni (RPHA) reaktsioon. Selle reaktsiooni makromodifikatsiooni nimetatakse TRHA-ks, mikromodifikatsiooniks MHA-TR ja automatiseeritud versiooniks AMHA-TR.

IgM seroloogia. IN viimastel aastakümnetel Antikehade moodustumise dünaamikat süüfilisega patsientide kehas uuritakse laialdaselt enne ravi, ravi ajal ja pärast ravi lõppu. See on tingitud asjaolust, et süüfilist täielikult ravitud patsientidel püsivad süüfilise spetsiifiliste seroloogiliste reaktsioonide positiivsed tulemused pikka aega, mis raskendab patsientide ravimise küsimuse otsustamist, samuti varajase kaasasündinud haiguse diagnoosimist. süüfilis. Samuti on raske vahet teha retsidiivi ja uuesti nakatumise vahel. Uurides antikehade moodustumist süüfilisega patsientide organismis, selgus, et pärast nakatumist tekivad esimesena spetsiifilised IgM-id, mis tuvastatakse juba teisel nädalal pärast nakatumist ja saavutavad maksimaalse kontsentratsiooni veres 6.-9. nädalaid. 6 kuu pärast pärast ravi lõppu enamikul patsientidest veres neid ei määrata. Neljandal nädalal pärast nakatumist hakkab organism tootma spetsiifilist IgG-d. Seda tüüpi immunoglobuliinide suurim kogus määratakse 1-2 aastat pärast nakatumist. Tuleb märkida, et spetsiifilise IgM tootmine lakkab, kui antigeen kehast kaob, ja mälurakkude kloonid jätkavad IgG sekretsiooni. Lisaks ei liigu suured IgM-molekulid läbi platsenta emalt lootele ja seetõttu hindavad nad nende olemasolu lapses tema nakatumist kahvatu treponemaga. Arvestades asjaolu, et spetsiifilise IgM kontsentratsioon veres aja jooksul loomulikult väheneb, võib nende antikehade tiitri tõus olla abistav märk haiguse retsidiivi või uuesti nakatumise esinemisest.

Treponemaalsed testid süüfilise tuvastamiseks. Üldkirjeldus.

Süüfilise usaldusväärseks diagnoosimiseks ja süüfilisevastaste antikehade tuvastamiseks patsiendi kehas (vereseerumis või tserebrospinaalvedelik), kasutage spetsiaalseid tehnoloogiaid laboriuuringud- nn seroloogilised meetodid.

Süüfilise diagnostiliste testide läbiviimisel kasutatakse erinevaid seroloogilisi reaktsioone: aglutinatsioon, sadestumine, immunofluorestsents, komplemendi sidumine, ensüümi immunoanalüüs jne. Kõik need seroloogilised reaktsioonid põhinevad antigeenide ja antikehade koostoimel.

Spetsiifilisi seroloogilisi teste nimetatakse treponemaalne sest nendes testides kasutatakse treponema pallidum'i või selle antigeene, st treponemaalse päritoluga antigeene. Treponemaalsete testide eesmärk on tuvastada spetsiifilised antikehad süüfilise tekitaja antigeensete struktuuride vastu, st antikehad, mis on suunatud spetsiifiliselt T. Pallidum bakteri enda, mitte treponeemiga kahjustatud kehakudede vastu. Spetsiifilisi IgM klassi antitreponemaalseid antikehi saab tuvastada juba teise haigusnädala lõpus.

7. Valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused

Positiivset süüfilise PB-testi inimestel, kes seda haigust ei põe, nimetatakse valepositiivseks. Valepositiivsete tulemuste sagedus tervetel inimestel on 0,2-0,25%. Kui tervetel inimestel on RV mittespetsiifiliste valepositiivsete tulemuste protsent väga madal, siis mõne haiguse korral võib see olla kõrge.

Kõik seroloogiliste reaktsioonide mittespetsiifilised tulemused võib jagada järgmistesse põhirühmadesse:

1. Haigused, mis on põhjustatud tavaliste antigeenide esinemisest sarnastes patogeenides (spiroheedid): retsidiiveeruv palavik, õõtsik, bejel, pint, suu treponeem, leptospira.

2. Positiivsed reaktsioonid, mis on tingitud muutustest lipiidide metabolismis ja muutustest seerumi globuliinides. Nende hulka kuuluvad positiivsed tulemused podagraga rasedatel naistel, lipiidide koostise häired pliimürgistuse tagajärjel, fosfor, pärast naatriumsalitsülaadi, digitaalise võtmist jne. Need reaktsioonid peaksid hõlmama ka positiivseid reaktsioone mõnede nakkushaiguste korral ( tüüfus, malaaria, kopsupõletik, pidalitõbi, endokardiit, kollagenoos, müokardiinfarkt, põrutus, vähk, maksatsirroos jne)

3. Tehnilised käitumisvead. Komplemendi annuse vale valik, reaktiivide säilitamise tingimuste ja tähtaegade mittejärgimine, vereseerumi kontrollproovide reaktsioonist väljajätmine, saastunud katseklaaside ja instrumentide kasutamine.

8. Wassermanni reaktsiooni modifikatsioon

Wassermani reaktsiooni modifikatsioonid on kvalitatiivses ja kvantitatiivses versioonis, külmas, tserebrospinaalvedelikuga.

RV muutmine külmas tundus tundlikum olevat. Wassermani reaktsiooni külmas seadistamise meetodi tunnuseks on kolmefaasilised temperatuurirežiimid, mille juures toimub komplemendi sidumine. See reaktsioon viiakse läbi ka kardiolipiini ja treponemaalse antigeeniga.

Lisaks RW kvalitatiivsele hindamisele on selle jaoks olemas meetod kvantitatiivne seadistus vereseerumi erinevate lahjendustega (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reagiini tiiter määratakse maksimaalse lahjenduse järgi, mis annab siiski teravalt positiivse tulemuse (4+). RV kvantitatiivne formuleerimine on oluline teatud süüfilise vormide diagnoosimisel ja ravi efektiivsuse jälgimisel.

9. Ulatus

Venemaal on RSKt osa süüfilise (SSR) standardsete seroloogiliste testide kompleksist.

Wassermani reaktsioon treponemaalse ja kardiolipiini antigeeniga (RSKt) on harjunud

• süüfilise kõigi vormide diagnoosimine,
• kontroll ravi efektiivsuse üle,
• süüfilisega patsiendiga seksuaalkontaktis olnud isikute läbivaatused,
• kliinilise ja anamneetilise süüfilise kahtlusega isikute uuringud
• psühhiaatria- ja neuroloogiahaiglate, doonorite ja rasedate, sealhulgas kunstlikule raseduse katkestamisele suunatud isikute süüfilise ennetava läbivaatuse käigus.

Praegu on Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi korraldusel soovitatav RSKT asendada tundlikumate treponemaalsete meetoditega (ELISA või RPHA).

Välismaal ei ole Wassermani reaktsiooni treponemaalse antigeeniga kliinilises laboripraktikas pikka aega kasutatud ja see ei sisaldu soovitatavate standardtestide loendis. Maailmaorganisatsioon Tervis.

Klassikaliste seroloogiliste reaktsioonide kompleks (CSR)

DAC- See reaktsiooni kompleks kasutatakse süüfilise serodiagnostikaks standardmeetod. See reaktsioonide kompleks sisaldab Wassermanni reaktsiooni kardiolipiini antigeeniga (letsitiini ja kolesterooliga rikastatud pulli südame ekstrakt) ja treponemaalse antigeeniga (ultraheliga töödeldud apatogeensete kultuuriliste kahvatute treponeemide suspensioon), samuti mikrosadestamise reaktsiooni (RMP). ) plasma või inaktiveeritud seerumiga, mis asetatakse kardiolipiini antigeeniga

CSR muutub positiivseks esmase perioodi keskel (selle jagunemise seronegatiivseks ja seropositiivseks määrab täpselt CSR), sekundaarsel perioodil on CSR positiivne 98-100% patsientidest ja kolmandal perioodil - ainult 60-70 %. See tähendab, et haiguse kestuse pikenedes väheneb järk-järgult CSR-i positiivsus.

KSRi eelised:

1) Seadistamise odavus, lihtsus ja kiirus. See on eriti iseloomulik mikrosadestamise reaktsioonile: RMP on praegu peamine sõelumis- (selektsiooni-) meetod;

2) Süüfilise paranemise jälgimiseks on mugav kasutada mittetreponemaalseid teste.

CSR-i puudused:

1) reaktsioonide tulemuste hindamise subjektiivsus ("silma järgi");

2) Madal tundlikkus süüfilise hiliste vormide korral;

3) Spetsiifilisuse puudumine võrreldes kaasaegsemate testidega. Nende läbiviimisel täheldatakse sageli valepositiivseid reaktsioone (LPR).

LPR võib olla tingitud ristreaktiivsusest kahvatu spiroheedi ja teiste mikroobide vahel, lipiidide ja valkude metabolismi häiretest, rakumembraanide ebastabiilsusest ja autoantikehade moodustumisest. LPR-i täheldatakse ägedate (malaaria, nakkuslik mononukleoos jne) ja krooniliste (tuberkuloos, pidalitõbi, hepatiit, borrelioos jne) infektsioonide, müokardiinfarkti, maksatsirroosi, kollagenooside (eriti SLE korral), onkopatoloogia, vaktsineerimise, uimastitarbimise, alkoholi ja rasvaste toitude kuritarvitamine. Valepositiivne võib olla CSR viimastel nädalatel raseduse ajal, pärast sünnitust ja mõnel naisel menstruatsiooni ajal. Valenegatiivsed CSR-tulemused võivad olla seotud HIV-nakkusega.

RIT, RIBT – kahvatu treponema immobiliseerimisreaktsioon

Treponema pallidum immobilisatsioonitest (TPI; Treponema pallidum immobilisation test, TPI) on klassikaline meetod, mis aitab tuvastada spetsiifilisi treponemaalseid antikehi. RIBT reaktsioonis kasutatakse antigeenina küüliku munandites kasvatatud patogeenset treponema pallidum T. pallidum'i (Nicholsi tüvi). RIBT põhineb elusate kahvatute treponeemide liikuvuse kadumisel pärast kokkupuudet patsiendi vereseerumi ja komplemendi antikehadega. Tulemusi hinnatakse tumevälja mikroskoopia abil. Vaatamata asjaolule, et RIBT-test viidi kliinilisse praktikasse spetsiifilise süüfilise testina, on see töömahukas, tehniliselt keeruline, aeganõudev ja kulukas kasutada.

1. RIBT-meetodi ajalugu

Treponema pallidum immobilisatsioonitest (TPRT) on tegelikult esimene spetsiifiline test süüfilise diagnoosimiseks. Seda reaktsiooni esitasid 1949. aastal Ameerika teadlased Nelson ja Mayer (R. W. Nelson ja M. M. Mayer) ning seda arutati üksikasjalikult järgnevatel aastakümnetel teaduslikes artiklites. Ebaõnnestunud katseid elusaid treponeeme testides kasutada on tehtud ka varem. Tänu sellele, et Nelsonil õnnestus luua keskkond, milles treponeemid püsisid elujõulisena kuni 8 päeva, kroonis tema uurimistööd edu.

2. RIBT meetodi põhimõte

Meetod põhineb liikuvuse kadumisel kahvatu treponeemide tõttu uuritava vereseerumi ja komplemendi immobiliseerivate antitreponemaalsete antikehade juuresolekul anaeroobsetes tingimustes. Antigeen on elus patogeenne kahvatu treponema, mis on saadud süüfilisega kunstlikult nakatunud küülikutelt.

3. RIBT testi seadistamine

Reaktsioonis osalevad testitav seerum, komplement ja antigeen. Küüliku munandi kudedest pärast kunstlikku nakatumist saadud elustreponeemile lisage katsealuse vereseerum. Treponemaalsete antikehade-immobilisiinide olemasolul seerumis lakkavad kahvatud treponeemid liikumisest (immobiliseeritud). Immobilisiini antikehad on hilised antitreponemaalsed antikehad.

Reaktsioon viiakse läbi kuumusega inaktiveeritud seerumite või vahatatud paberil kuivatatud seerumiproovidega (kuivtilgad). Seerumi inaktiveerimine kuumutamisega viiakse läbi 30 minutit temperatuuril 56 °C. Enne vere võtmist ei tohi uuritav võtta ravimeid, eriti penitsilliinipreparaate. Narkootikumide võtmine tühistatakse nende perioodiks võimalik viivitus organismis.

Antigeenina kasutatakse Nicholsi tüve baktereid, mis on saadud 7–10-päevase küüliku süüfilise orhiidi (munandite põletiku) tagajärjel. Ajavahemik reaktsiooni käivitamisest kuni selle tulemuste registreerimiseni kestab 18-20 tundi, seetõttu on mikroorganismide elujõulisuse ja hea liikuvuse säilitamiseks vajalik ellujäämiskeskkond.

RIBT kasutab merisea komplementi. Komplemendi saamiseks tuleb steriilsetes tingimustes võtta verd mitmelt merisealt.

Bakteriaalse saastumise korral jäetakse komplement kõrvale. Ei saa kasutada kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioonis säilinud komplemendi, tk. see on mikroorganismidele toksiline.

Immobiliseerimisreaktsioonis kasutatakse komplemendi liiast. Selle kogus sõltub suuresti kahvatu treponema ellujäämiskeskkonnast.

RIBT asetatakse steriilsetesse kastidesse, mida on eelnevalt kiiritatud bakteritsiidse kvartslambiga 45-60 minutit. Iga vereseerumit uuritakse kahes katseklaasis: kogenud Ja kontroll. Mõlemad katseklaasid täidetakse testitava seerumi ja antigeeniga nõutavad kogused. Katseklaasi valatakse aktiivne komplement ja kontrollkatsutisse sama kogus inaktiveeritud vereseerumit. Merisiga. Pärast täitmist segatakse tuubide sisu õrnalt loksutades.

RIBT kulgeb anaeroobsetes tingimustes. Katseklaasid koos koostisainetega asetatakse mikroanaerostaati, millest vaakumpumba abil imetakse ära atmosfääriõhk ja silindrist süstitakse gaasisegu (95 osa lämmastikku ja 5 osa süsihappegaasi). Mikroanaerostaat koos katseklaasidega asetatakse 18-20 tunniks termostaati (35°C).

RIBT tulemuste hindamine viiakse läbi pärast katseklaaside eemaldamist termostaadist ja mikroanaerostaadist (st pärast 18-20-tunnist kogemust). Pasteuri pipetiga kantakse katseklaasi sisu tilk klaasklaasile, mis kaetakse katteklaasiga ja uuritakse mikroskoobi pimedas väljas (objektiiv 40, okulaar 10X). Preparaadi erinevates osades uuritakse mitut vaatevälja, loendades mõlemas liikuvate ja liikumatute kahvatute treponeemide arvu. Loendamine algab ravimiga kontrollist ja seejärel katseklaasist.

Reaktsiooni seadistamisel kasutatakse 5 kontrolluuringut: ilmselgelt positiivse ja negatiivse vereseerumiga, aktiivse ja inaktiveeritud komplemendiga ning kahvatu treponema ellujäämissöötmega. Selles katses kasutatakse kahvatu treponema liikuvuse määramiseks kontroll-negatiivset vereseerumit. Kontrolli positiivset vereseerumit – immobiliseeriva aktiivsuse taseme hindamiseks selle katse tingimustes. Aktiivse ja inaktiveeritud komplemendi ja keskkonna uurimine viiakse läbi, et teha kindlaks nende mõju kahvatu treponema liikuvusele.

Komplemendi puudumisel katses ei näita immobiliseerivad antikehad oma aktiivsust korralikult ja treponeemid jäävad liikuvaks. Seetõttu tehakse pärast katset jääkkomplemendi määramine, et hinnata, kas kahvatu treponeemide liikuvus katseklaasides oli tingitud komplemendi puudumisest. Selleks kasutatakse hemolüütilist süsteemi - oina erütrotsüütide suspensiooni ja lahjendatud hemolüütilise seerumi segu, mida hoitakse termostaadis.

Komplementi jääk määratakse hemolüütilise süsteemi lisamisega igasse katsutisse vajalikus mahus. Torud asetatakse 45 minutiks 37° temperatuuriga termostaadi. Eksperimentaalsetes katseklaasides peaks toimuma erütrotsüütide hemolüüs, kontrollkatseklaasides hemolüüsi hilinemine. Hemolüüsi puudumine katseklaasides näitab komplemendi ebapiisavat kogust, sellistel juhtudel tuleks uuringut korrata. Vere seerumi korduvat uurimist ei tehta ainult siis, kui täheldatakse kahvatu treponema 100% immobiliseerimist.

4. RIBT tulemuste arvestus

Immobiliseeritud treponeemid loendatakse mikroskoobi all, kasutades tumevälja mikroskoopiat. Uurijalt nõutakse treponeemide liikumise hindamise oskust. Ta peaks pöörama tähelepanu kahvatu treponema tehtud liigutuste intensiivsusele. Selle bakteri puhul ei ole alati võimalik jälgida lainelaadseid kokkutõmbeid ja painutusliigutusi, mõnikord ainult pöörlevaid. Samuti peaksite suutma eristada treponeemide aktiivset liikumist vedelikuvooluga liikumisest.

Reaktsiooni tulemuste hindamiseks arvutatakse kahvatute treponeemide immobilisatsiooni protsent, st liikuvate ja liikumatute treponeemide suhe katses (aktiivse komplemendiga) ja kontrollis (inaktiivse komplemendiga) vastavalt valemile:

X \u003d (M - C) × 100 / M

kus M on liikuvate treponeemide arv kontrollis; C - liikuvate treponeemide arv katses; X - % immobilisatsioon. Praktilises töös määratakse immobilisatsiooni protsent eelnevalt koostatud tabeli järgi, kasutades ülaltoodud valemit.

Kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioon on hinnanguliselt

• positiivne immobiliseerimise ajal 51 - 100% treponem,
• nõrgalt positiivne: 31 - 50% liikumatud treponeemid,
• kahtlane: 21 - 30% liikumatud treponeemid,
• negatiivne: 0 - 20% liikumatud treponeemid.

Kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioon muutub positiivseks esmase süüfilise perioodi lõpus - sekundaarse süüfilise perioodi alguses (alates 7-8 nädalast nakatumise hetkest ja rohkem). Samal ajal on RIBT-st vähe kasu süüfilise varajases staadiumis diagnoosimisel, kuna kahvatut treponeemi immobiliseerivad ja reaktsioonis tuvastatud antikehad ilmuvad alles 3-6 nädalat pärast nakatumist. Antikehad-immobilisiinid kuuluvad klassi IgG immunoglobuliinid. Need ilmuvad verre hiljem kui reagins (antikardiolipiini antikehad), hiljem kui fluorestseiini antikehad (tuvastatakse RIF ja ELISA) ja sademed (RMP).

Tulevikus jääb RIBT positiivseks. Süüfilise hiliste vormide korral on reaktsioon kõrge. Sekundaarse, hilise süüfilise, neurosüüfilise, kaasasündinud süüfilise korral registreeritakse positiivne RIBT tulemus 95–100% juhtudest. Tertsiaarse süüfilise, siseorganite, närvisüsteemi spetsiifiliste kahjustustega, kui RV on sageli negatiivne, annab RIBT positiivseid tulemusi 98-100% juhtudest.

RIBT pikka aega tunnistatud kõige spetsiifilisemaks süüfilise testiks. Kirjanduse andmetel on RIBT spetsiifilisus 99%, tundlikkus jääb vahemikku 79-94%. TsNIKVI andmetel on RIBT tundlikkus (kokku kõigi süüfilise etappide puhul) 87,7%.

7. Meetodi ulatus

RIBT-i ulatus kitseneb järk-järgult seadistamise kestuse, kõrgete kulude ja töömahukuse tõttu. RIBT on üsna keeruline ja kulukas analüüs, mis nõuab kõrgelt kvalifitseeritud personali ja vivaariumi olemasolu. Sellega seoses on selle meetodi kasutamine viimastel aastatel oluliselt vähenenud. USA-s kasutatakse seda testi praegu ainult uurimislaborites.

Lähtudes RIF-i ja RIBT-i keerukusest ja kõrgest maksumusest, on otstarbekas neid kasutada süüfilise hiliste ja varjatud vormide diagnoosimiseks. RIBT säilitab oma positsiooni "reaktsioonide otsustajana" süüfilise varajaste varjatud vormide ja valepositiivsete tulemuste diferentsiaaldiagnostikas. See reaktsioon võib olla kasulik neurosüüfilise diagnoosimisel ja kui muud seroloogilised testid on vastuolulised.

RIBT muutub positiivseks palju hiljem kui RIF ja RV. Seetõttu ei kasutata seda süüfilise nakkuslike vormide diagnoosimiseks.

RIBT, nagu RIF, on antisüüfilise ravi protsessis väga aeglaselt negatiivne. Seetõttu ei sobi see antisüüfilise ravi edenemise jälgimiseks.

Valepositiivsed tulemused (FPR) RIBT-s on haruldased ja neid täheldatakse peamiselt paljude treponematooside (jahu, pinta, bejel) puhul, mida Venemaal ei leidu, aga ka pidalitõve, sarkoidoosi, SLE, tuberkuloosi ja tsirroosi korral. maks ja mõned teised. haruldased haigused mittesüüfilise iseloomuga. Patsientide vanusega suureneb RIBT valepositiivsete tulemuste arv.

RIBT võib osutuda valepositiivseks, kui testitav seerum sisaldab treponemitsiidseid aineid (nt penitsilliinid, tetratsükliinid, erütromütsiin), mis põhjustavad kahvatu treponeemi mittespetsiifilist immobilisatsiooni. See võib olla tingitud sellest, et patsient võtab treponemotsiidseid antibiootikume, mistõttu uuringut ei tehta isikutel, kes on saanud viimase kuu jooksul antibiootikume. RIBT-i verd saab uurida mitte varem kui 2 nädalat pärast antibiootikumide ja muude antisüüfiliste ravimite lõppu.

9. Kahvatu treponeemide immobiliseerimise reaktsiooni modifikatsioonid

Lisaks mikroanaerostaatilisele tehnikale on RIBT-i melanžseade vastavalt N.M. Ovtšinnikov. Anaeroobsed tingimused reaktsiooni moodustamise ajal luuakse reageeriva segu asetamisega melangerisse (leukotsüütide segistisse), mille mõlemad otsad on suletud kummirõngaga. Melange reaktsiooni tehnika võimaldab loobuda vaakumpumbast, lämmastiku ja süsinikdioksiidi seguga silindrist ning mikroanaerostaadist. Suure kliinilise materjali võrdlevas uuringus saadi tulemused, mis ei jää alla klassikalisele anaerostaatilisele tehnikale.

10. RIBT omadused, eelised ja puudused

RIBT on tehniliselt keeruline ja kallis diagnostikameetod. Tehnoloogia nõuab märkimisväärseid vahendeid küülikute hooldamiseks ja katsetamiseks. Seda aeganõudvat testi kasutatakse praegu peamiselt teaduslikel eesmärkidel. Enamikus välisriikides on RIBT-d peaaegu 40 aastat praktiliselt kasutatud mitte diagnostilistel eesmärkidel, vaid ainult uurimistöös.

Reaktsiooni puudused:

• RIBT nõuab tööd Nicholsi tüvega elava patogeense treponema pallidum'iga, mis jääb inimestele nakkavaks vaatamata küülikutega kohanemisele
• reaktsioon on keeruline, aeganõudev ja kallis
• vivaarium on vajalik
• Reaktsiooni seadistamiseks, tulemuste registreerimiseks ja vivaariumi hooldamiseks on vaja kõrgelt kvalifitseeritud töötajaid
• tulemuste hindamise subjektiivsus
• automatiseerimise puudumine
• seda seroloogilist meetodit ei saa kuidagi standardiseerida.
• reaktsioon ei ole rakendatav käimasoleva antisüüfilise ravi taustal
• võimetus kasutada ravi kontrolli all hoidmiseks. RIBT võib süüfilisega patsientidel püsida positiivsena paljude aastate jooksul (ja isegi kogu elu), hoolimata täielikust ravist.
• reaktsioon võib anda valepositiivseid tulemusi patsientidel, kellel on pahaloomulised kasvajad, diabeet, pidalitõbi, autoimmuunhaigused, kopsupõletik, raske kardiovaskulaarne patoloogia.

RIBT eelised on järgmised:

1) piisavalt kõrge tundlikkus;

2) Kõrge spetsiifilisus.

RIF (immunofluorestsentsreaktsioon)

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on ekspressdiagnostika meetod mikroobsete antigeenide või antikehade tuvastamiseks. Fluorestseeruva signaali tuvastamisel põhinevaid teste peetakse süüfilise parimate testide hulka.

1. Meetodi ajalugu

Fluorestseeruva treponemaalse antikeha (FTA) töötasid esmakordselt välja 1957. aastal Deacon jt (Deacon, Falcone ja Harris).

2. Meetodi põhimõte

RIF-meetod põhineb asjaolul, et fluorokroomidega märgistatud antikehadega immuunseerumiga töödeldud koe antigeenid või mikroobid võivad fluorestsentsmikroskoobi UV-kiirtes hõõguda. Sellise luminestseeruva seerumiga töödeldud määrdunud bakterid helendavad mööda raku perifeeriat rohelise äärisena

Antigeenina RIF-is kasutatakse küülikuorhiidi Nicholsi tüve elusate patogeensete kahvatute treponeemide suspensiooni, mis kuivatatakse klaasklaasil ja fikseeritakse atsetooniga. Patsiendi vereseerum lisatakse kuivatatud kahvatutele treponeemidele ja kinnitatakse atsetooniga klaasile.

Pärast pesemist töödeldakse preparaati seerumiga, mis sisaldab fluorestseiiniga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastaseid antikehi. Veel kord pestakse preparaati ja vaadeldakse fluorestsentsmikroskoobi all. Kui testitav seerum sisaldab treponemaalseid fluorestseiinivastaseid antikehi, täheldatakse treponeemide kollakasrohelist sära.

3. RIF-meetodil uurimistöö läbiviimise meetod

Objektiklaasile fikseeritud antigeeni (patogeenne treponema pallidum) töödeldakse testitava seerumiga. Pärast pesemist töödeldakse preparaati fluorestseeruva anti-inimese immunoglobuliini seerumiga, mis on märgistatud fluorokroomiga. Sel juhul seostub tekkiv fluorestseeruv kompleks (anti-inimese globuliin + fluorestseiini tioisotsüanaat) kahvatu treponema pinnal oleva inimese globuliiniga, pakkudes fluorestsentsmikroskoobis kahvatu treponema sära.

Antigeen-antikeha komplekside tuvastamiseks kasutatakse luminestseeruvat seerumit, mis esindab FITC-ga konjugeeritud liigivastaseid (inimesevastaseid) immunoglobuliine. Treponeemide vastaste antikehade olemasolu seerumis määrab fluorestsentsmikroskoobi all uuritud treponeemide sära. Test viiakse läbi kvalitatiivses ja poolkvantitatiivses versioonis.

4. Tulemuste arvestus

RIF-i tulemuste visualiseerimine toimub fluorestsentsmikroskoobi abil. Tulemusi hinnatakse preparaadis olevate treponeemide luminestsentsi astme järgi. Antikehade olemasolul on treponeemide sära näha, kuid kui seerumis antitreponeemseid antikehi ei olnud, siis treponeemid pole näha. Klaasile kinnitatud kuivatatud kahvatu treponema luminestsentsi aste on näidatud plussidega (alates "–" kuni "++++"). Negatiivne tulemus – puudub sära või taustatase – 1+.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on üsna tundlik infektsiooni kõikides etappides, inkubatsiooniperioodi lõpust hilise süüfiliseni. Klassikalise kulu süüfilise esmane periood algab 3-4 nädalat pärast nakatumist. RIF muutub positiivseks esmase perioodi esimestel päevadel või isegi inkubatsiooniperioodi lõpus, alates 3. nädalast pärast nakatumist. RIF-i tulemused jäävad positiivseks kõigil perioodidel, sealhulgas hilistel vormidel.

RIF muutub positiivseks mõnevõrra varem kui RW. Mõnede aruannete kohaselt esineb positiivne RIF 80% primaarse seronegatiivse süüfilisega patsientidest. Sekundaarsel perioodil on RIF positiivne peaaegu 100% juhtudest. See on alati positiivne latentse süüfilise korral ja annab 95-100% positiivseid tulemusi haiguse hiliste vormide ja kaasasündinud süüfilise korral.

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega meetodite rühm. RIF on tundlik nakkuse kõikides staadiumides, alates inkubatsiooniperioodist kuni hilise süüfiliseni. WHO andmetel on RIF-i tundlikkus primaarse süüfilise korral 70-100%, sekundaarse ja hilise süüfilise korral 96-100%, spetsiifilisus - 94-100%. TsNIKVI andmetel on RIF-i tundlikkus süüfilise kõigi vormide korral 99,1%.

RIF-i spetsiifilisust saab tõsta uuritava seerumi eeltöötlemisel sorbendi – ultraheliga läbi viidud treponemaalse antigeeniga, mis seob rühmaantikehi (RIF-abs).

7. Meetodi ulatus

RIF kehtib:

• kinnitava reaktsioonina varase, latentse süüfilise korral
• retrospektiivseks diagnoosimiseks
• süüfilise varjatud vormide ja süüfilise uuringute valepositiivsete tulemuste eristamiseks.
• neurosüüfilise kinnitava testina.

RIF-i kasutatakse laialdaselt kinnitava testina, kuid see ei ole mõeldud tavapäraseks kasutamiseks ega sõeluuringuks, kuna seda on tehniliselt keeruline seadistada. RIF-i läbiviimiseks on vaja vivaariumi või osta patogeensete kahvatute treponeemide suspensiooni, mis piirab reaktsiooni võimalust. Viimastel aastatel on aga siseturul hakanud ilmuma testimissüsteemid, mis võimaldavad reaktsiooni läbi viia ilma vivaariumi ja oma patogeense pallide treponema pallidum laboratoorse tüve puudumisel.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

LPR-i esinemine RIF-i määramisel on haruldane (koos kollagenooside, borrelioosiga).

RIF-i peetakse endiselt üheks parimaks süüfilise testiks, serodiagnoosi "kuldstandardiks". RIF-i on RIBT-ga võrreldes lihtsam seadistada,

Vaatamata kõrgele diagnostilisele väärtusele, elus T. pallidum'i kasutamise vajadusele, uuringu kõrge hind ja kestus takistavad RIF-i laialdast kasutuselevõttu igapäevapraktikas. Reaktsiooni seadistamine on töömahukas. Lisaks on RIF-i tulemuste hindamine subjektiivne.

RIF-i eelised ja RIBT on:

1) kõrge tundlikkus (eriti RIF-i jaoks);

2) Kõrge spetsiifilisus (eriti RIBT puhul).

RIF-i puudused ja RIBT:

1) Tehniline keerukus, meetodite kõrge hind.

2) Tulemuste hindamise subjektiivsus, automatiseerituse puudumine;

3) RIF ja RIBT võivad süüfilisega patsientidel püsida positiivsed aastaid (ja isegi kogu elu), hoolimata täielikust ravist. Seetõttu ei saa neid reaktsioone kasutada ravi kontrollimiseks.

10. Meetodi modifikatsioonid

Praktikas kasutatakse süüfilise serodiagnostikaks mitmeid immunofluorestsentsreaktsiooni modifikatsioone ja neid on kasutatud:

• RIF-abs- kõige tundlikum süüfilise serodiagnostika meetod, see muutub positiivseks varem kui muud reaktsioonid (alates 3. nädalast pärast nakatumist);
• RIF-200(patsiendi seerumit lahjendatakse esitlemisel 200 korda) on väga spetsiifiline meetod süüfilise serodiagnostikaks.
• RIF-10(10-kordne testitava seerumi lahjendus) - tundlikum meetod kui RIF-200.
• RIF-ts viidi läbi alkoholiga.
• RIF-abs-IgM- varajase IgM klassi antitreponemaalsete antikehade tuvastamine.

1. Kõige levinum modifikatsioon RIF-abs- immunofluorestsentsreaktsioon koos imendumisega. Enne reaktsiooni seadistamist tühjendatakse katsealuse seerum mittepatogeensete treponeemide seguga, et välistada ristreaktsioonid. Rühma antikehad eemaldatakse uuritud seerumist ultraheliga hävitatud kultuuriliste treponeemide abil, mis suurendab oluliselt reaktsiooni spetsiifilisust. Kuna testitavat seerumit kasutatakse 1:5 lahjenduses, on RIF-abs väga tundlik.

Peamised näidustused RIF-abs-ide kasutamiseks kliinilises praktikas on:

• süüfilise latentse ja hilise vormi diagnoosimine,
• CSRi ja RMP valepositiivsete tulemuste tuvastamine, eriti süüfilise kahtlusega rasedatel ja somaatilistel patsientidel,
• haiguse retrospektiivse diagnoosi seadmiseks.

RIF-abs ei ole ravitulemuste hindamisel kuigi informatiivne: 85% patsientidest, kes said adekvaatset antisüüfilist ravi, püsivad RIF-i positiivsed tulemused aastaid.

Seda reaktsiooni nimetatakse süüfilise serodiagnoosi "kuldstandardiks". Seda kasutatakse vahekohtuasjades, kuid usaldusväärse tulemuse saavutamiseks on vaja küüliku 7-päevase orhiidi T. pallidum tüve Nichols värsket kontsentreeritud suspensiooni, mida ei tohiks külmutada.

2. NSV Liidus paigaldati see kahes versioonis - RIF-10 Ja RIF-200, st testitava seerumi 10- ja 200-kordse lahjendamisega. RIF-200 - testitavat seerumit lahjendatakse 200 korda, et vähendada valepositiivsete tulemuste arvu. See tagab reaktsiooni kõrge spetsiifilisuse, kuid selle tundlikkus langeb mõnevõrra. RIF-10 on tundlikum, kuid annab sagedamini mittespetsiifilisi positiivseid tulemusi kui RIF-200, mida iseloomustab kõrge spetsiifilisus. RIF-10 on tundlikum, RIF-200 ja RIF-abs on spetsiifilisemad.

RIF-200 ja RIF-abs-ide tundlikkus on hinnanguliselt 84–99% ja spetsiifilisus 97–99%.

3. RIF-ts viidi läbi alkoholiga. Reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse spetsiifiliste kesknärvisüsteemi kahjustuste tuvastamiseks tervet tserebrospinaalvedelikku.

4. Reaktsioon RIF-abs-IgM pakutud IgM klassi varajase antitreponemaalsete antikehade tuvastamiseks. Seda reaktsiooni saab kasutada kaasasündinud süüfilise, süüfilise varajaste vormide diagnoosimiseks ning uuesti nakatumise ja serorelapsi juhtumite eristamiseks.

Selle reaktsiooni kaks modifikatsiooni on teada:

– FTA-ABS-IgM, mis põhineb anti-IgM konjugaadi (fluorestseiiniga märgistatud antikehad inimese IgM vastu) kasutamisel reaktsiooni teises faasis inimese fluorestsentsvastase globuliini asemel;

- RIF-abs-IgM venekeelne versioon, mida iseloomustab see, et testitavale vereseerumile lisatakse sorbenti, mis eemaldab IgG antikehad, ja RIF-abs asetatakse ülejäänud IgM antikehadega.

Peamised näidustused RIF-abs-IgM koostise jaoks on:

- kaasasündinud süüfilise serodiagnoosimine, kui lapse nahal ja limaskestadel pole kaasasündinud süüfilise ilminguid;

- süüfilise taasinfektsiooni ja kliinilis-seroloogilise või seroloogilise kordumise diferentsiaaldiagnostika, mille puhul RIF-abs-IgM on negatiivne ja RIF-abs on positiivne;

- varakult omandatud või kaasasündinud süüfilise ravi efektiivsuse hindamine: pärast piisav ravi RIF-abs-IgM muutub järgmise 3-6 kuu jooksul negatiivseks.

Seda reaktsiooni saab kasutada kaasasündinud süüfilise tuvastamiseks. On teada, et suured IgM molekulid ei pääse läbi terve platsenta. Seetõttu võivad M-klassi M-klassi antikehad treponema pallidum'i vastu ilmneda lapse kehas kas platsenta barjäärifunktsiooni rikkumise tõttu või neid toodab süüfilisega lapse keha. Süüfilise haige veres tekivad IgM klassi antikehad juba haiguse esimestel nädalatel ja antikehad klassi IgG ilmuvad hiljem. Mõlema klassi antikehade eraldi määramine on laste kaasasündinud süüfilise diagnoosimisel äärmiselt kasulik, kuna IgM-klassi antikehade olemasolu lapsel esimesel elukuul viitab sellele, et need on moodustatud süüfilisega lapse kehas. samas kui ainult IgG antikehade tuvastamine näitab viimaste ema päritolu.

Reaktsiooni avaldus 19S(IgM)-RIF-abs hõlmab suuremate 19S IgM molekulide esialgset eraldamist geelfiltrimise teel

väiksemate 7S IgG molekulide fraktsioonid. Täiendav uuring ainult 19S IgM fraktsiooni sisaldava vereseerumi RIF-abs reaktsiooni kohta,

kõrvaldab kõik võimalikud veaallikad. Kuid selle reaktsiooni seadistamise tehnika on keeruline ja aeganõudev, nõuab spetsiaalset varustust ja spetsialistide väljaõpet.

Immuunadhesioonireaktsioon (RIP, TPIA – Treponema pallida immuunadheents).

See reaktsioon põhineb Rieckenbergi 1912. aastal kirjeldatud nähtuse kasutamisel. RIP põhineb asjaolul, et süüfilisehaige seerumi poolt sensibiliseeritud virulentsed koetreponeemid kinnituvad komplemendi ja erütrotsüütide juuresolekul erütrotsüütide pinnale ning kanduvad tsentrifuugimisel koos nendega settesse, kaovad supernatant.

Reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse järgmisi koostisosi: testseerum, antigeen, komplement, doonorerütrotsüüdid, isotooniline naatriumkloriidi lahus. Antigeenina kasutatakse Nicholsi tüve kahvatu treponema suspensiooni.

Kõige laiemalt seoses süüfilise serodiagnostikaga uurisid seda testi kodumaised ja välismaised autorid 50.–60. aastatel. Andmed RIP kui diagnostilise testi väärtuse kohta on olnud vastuolulised. Reaktsioon nõudis maksimaalset täpsust, kuna koostisosade ebatäpse valamise, katsematerjali liia või puuduse korral valmistises saadi ebausaldusväärsed tulemused.

Venemaal viis ulatusliku uurimistöö läbi L.V. Sazonova, kes sai sarnased tulemused RIP-is ja RIT-is, kasutades Nicholsi tüve patogeensete kahvatute treponeemide värskelt valmistatud suspensiooni. Fenooliga kuumutatud või konserveeritud antigeeni kasutamine moonutas aga järsult reaktsiooni tulemusi ja muutis antigeeni ebastabiilseks. Soovita antud test asendada RIT L.V. Sazonova pidas seda võimatuks.

G.P. Avdeeva, kasutades antigeeni valmistamisel muid temperatuuri- ja ajarežiime, sai RIP-i uuringus erinevaid tulemusi. Tema sõnul on selle reaktsiooni tundlikkus kõrgem kui KCP ja RIT tundlikkus, kuid mõnevõrra madalam kui RIF ning RIP, RIT ja RIF spetsiifilisus on lähedane.

Kuid RIP-i antigeeni tootmisest vabanemise puudumine ei võimaldanud seda testi laiemalt uurida ja selle praktikas kasutusele võtta.

Passiivse hemaglutinatsiooni RPHA reaktsioon

Passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA) on tavaline seroloogiline test, mis on kindlalt juurdunud laboripraktikas. on uuringus üsna kõrge efektiivsusega.

1. RPHA meetodi ajalugu

Esimest korda teatasid G.Blumental ja W.Bachman (1932) RPGA kasutamisest süüfilise diagnoosimisel. 1965. aastal pakuti süüfilise diagnoosimiseks välja kaudne ehk passiivne hemaglutinatsioonitest. Reaktsiooni modifitseerimisest erinevate antigeenide abil teatas T. Ratlev aastatel 1965-1967. RPGA mikromodifikatsiooni pakkus välja Sokh R.M. ja kaasautorid 1969. aastal. Esimese kaubandusliku katsesüsteemi töötasid välja Jaapani teadlased Tomisava et. al. aastal 1969

2. RPGA meetodi põhimõte

Antigeenidega "laetud" erütrotsüütide valmistatud homogeensest suspensioonist sadestub antikehi sisaldava uuritava seerumi lisamisel helveste kujul sade. Saadud sade koosneb antikehade poolt "liimitud" erütrotsüütidest ja seda nimetatakse "hemaglutinaat". Erütrotsüütide suspensioon valmistatakse eelnevalt ette ja tarnitakse diagnostiliste testsüsteemide osana.

Punaste vereliblede liimimise protsessi, mille pinnal esinevad antigeenid, nimetatakse "hemaglutinatsiooniks". Sidumine toimub spetsiifiliste antikehade (aglutiniinide) toimel. Reaktsiooni nimetatakse "passiivne", sest erütrotsüütide enda antigeenid ei reageeri ja erütrotsüüdid ise täidavad eranditult abiindikaatori funktsiooni.

Passiivne (kaudne) hemaglutinatsioonireaktsioon on aglutinatsioonireaktsiooni tüüp, milles antigeenide kandjatena kasutatakse erütrotsüüte (kreeka keelest háima - veri), mitte muid osakesi. Üldiselt kleepuvad aglutinatsioonireaktsioonis antikehade toimel kokku ja sadestuvad mikroobid või muud rakud - mitte tingimata erütrotsüüdid, vaid näiteks lateksiosakesed, bakterid või muud antigeeni kandvad korpuskulaarsed osakesed.

Süüfilise diagnoosimise passiivses hemaglutinatsioonireaktsioonis kasutatakse antigeenina kahvatu treponema antigeenidega kaetud jäära või linnu erütrotsüüte. Spetsiifilisi antikehi sisaldava seerumi lisamisel kleepuvad erütrotsüüdid kokku (aglutinatsioon).

RPHA reaktsiooni nimetatakse immunoloogilisteks meetoditeks, kuna. see põhineb patogeense treponema pallidum'i antigeeni spetsiifilisel interaktsioonil antikehaga. Vastavalt "võreteooriale" on aglutinatsioon pinnaantigeenimolekulide "ristsidumise" tulemus antikehamolekulidega (immunoglobuliinidega).

3. Passiivse hemaglutinatsiooni reaktsiooni avaldus

RPHA asetatakse plasttablettidesse või katseklaasidesse patsiendi vereseerumi lahjendustega, millele lisatakse erütrotsüütide diagnostikat.

Antigeeni erütrotsüütidega kombineerimise protsessi nimetatakse sensibiliseerimiseks ja sel viisil saadud tehislikku korpuskulaarset antigeeni nimetatakse sensibiliseeritud erütrotsüütideks. Erütrotsüütide diagnostikat nimetatakse erütrotsüütideks, mis on antigeeniga sensibiliseeritud.

Diagnostika valmistamiseks kasutatakse esmalt formaliini ja seejärel tanniiniga töödeldud jäära või linnu erütrotsüüte (tavaliselt kana), mis on sensibiliseeritud patogeense treponema pallidum'i (Nicholsi tüvi) või rekombinantsete treponema pallidum valkude (TpN15, TpN17, TpN47). Kasutada võib ka kultiveeritud treponema pallidum'i ultraheliga antigeeniga sensibiliseeritud lamba erütrotsüüte.

Ainult seerum (ärge kasutage plasmat). Hemolüüsitud ja hägused proovid ei sobi. Sensibiliseerimata erütrotsüüdid toimivad negatiivse kontrollina (et välistada erütrotsüütide vastaste antikehade olemasolu). Kasutage igas tootmisseerias positiivseid ja negatiivseid kontrolle.

Immunoloogilise tableti süvenditesse (rakkudesse) viiakse uuritud vereseerumi proovid ja uuritavad erütrotsüüdid. Kui patsiendi vereseerum sisaldab spetsiifilisi treponemaalseid antikehi, siis testitava seerumi lisamisel süvendisse koos antigeeniga tekivad antigeen-antikeha kompleksid, mis on seotud kandjate (erütrotsüütide) pinnaga. Visuaalselt väljendub see punaste vereliblede liimimises ehk hemaglutinatsioonis, mis on nähtav palja silmaga. Immuunkompleksid "antikeha-antigeen-erütrotsüüt", mis raskusjõu mõjul järk-järgult laskuvad, jaotuvad kogu kaevu põhja pinnale ja moodustavad iseloomuliku pildi "ümberpööratud vihmavarjust".

Sõltuvalt uuritavas proovis sisalduvate antikehade hulgast varieerub "ümberpööratud vihmavarju" kujutis maksimumist, mis hõlmab kogu kaevu põhja pinda, kuni väikese alani selle keskmises, madalaimas osas (valgustusega keskus ja intensiivsema settinud erütrotsüütide rõnga teke piki perifeeriat).

Immuunkompleksid ei moodustu, kui proovis pole spetsiifilisi antikehi või kui reaktsioonile lisatakse kontroll- (intaktsed) erütrotsüüdid. Samal ajal kogunevad erütrotsüüdid järk-järgult kaevu põhja madalaimasse punkti, moodustades kompaktse täpi või "nupu" kujul oleva kuju, mille keskel on mõnikord kerge valgustus.

Kui inimese vereseerum sisaldab erütrotsüütidevastaseid antikehi, siis "vihmavari" tekib igal juhul - nii reaktsioonis testerütrotsüütidega kui ka kontrollerütrotsüütidega. Sel juhul on spetsiifiliste antitreponemaalsete antikehade tuvastamiseks soovitatav kasutada muid meditsiinitehnoloogiaid.

Võimalik on prosooni nähtus (reaktsiooni võimatus liigsete antikehade tõttu), mis elimineeritakse seerumi lahjendamisega.

4. Passiivse hemaglutinatsioonireaktsiooni tulemuste arvestamine

RPGA tulemusi võetakse visuaalselt arvesse 60-120 minuti pärast mikromeetodi seadistamisel ja 2-4 tunni pärast või järgmisel päeval makrovariandi seadistamisel. Suuremate (tuumaliste) linnuerütrotsüütide kasutamisel saadakse selgem pilt, tulemused fikseeritakse varasemal kuupäeval.

Võimalik on määrata tiitrit (kõrge tiiter TPHA ≥ 1:2 560).

Uuringu tulemusi hinnatakse 4+ süsteemi järgi ("-" kuni "++++") vastavalt moodustunud kile suurusele. Aglutinatsiooni korral paiknevad erütrotsüüdid kaevu pinnal "vihmavarjuna" ja negatiivse tulemuse korral libisevad erütrotsüüdid vabalt alla ja kogunevad "nupu" kujul kaevu keskele. ".

RPGA tulemuste üldtunnustatud hinnang:

4+ - positiivne RPHA. Aglutineeritud erütrotsüüdid "vihmavarju" kujul vooderdavad ühtlaselt kogu augu pinda;

3+ – positiivne RPHA. Erütrotsüüdid ääristavad kogu augu pinda, kuid osa neist "libiseb" keskele. Samal ajal moodustub maardla perifeeriasse märgatav rõngas;

2+ - nõrgalt positiivne RPHA. Erütrotsüüdid moodustavad kaevu alumise osa väikesel alal kile, moodustades tiheda erütrotsüütide setterõnga, mille keskel on märgatav valgustus;

1+ - määramatu RPHA, erütrotsüüdid moodustavad kaevu põhjas lahtise sette, mille servad on hägused ja keskel on kerge valendik;

(–) - negatiivne RPHA, kõik erütrotsüüdid asuvad kaevu põhjas kompaktse sette kujul ("nööbid" või rõngad) puhta ümbritseva tausta taustal (ilma ümbritseva granulaarse settimiseta).

Välispraktikas hinnatakse RPGA tulemusi ka reaktiivseks (aglutinaadi moodustumise korral), nõrgalt reaktiivseks (kui moodustised on ebaolulised) ja mittereaktiivseks (kui aglutinatsiooni ei täheldata).

Reaktsiooni tulemuste arvestust saab teha spetsiaalsete analüsaatorite abil automaatselt. Lisaks kvalitatiivsele uuringule võimaldavad kõik testimissüsteemid kvantitatiivset analüüsi koos tiitri määramisega.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada RPHA-d

RPHA muutub positiivseks esmase perioodi keskel (7-8 nädalat nakatumise hetkest, 3-4 nädalat pärast kõva šankri tekkimist) ja püsib positiivsena aastaid pärast ravi.

Treponemavastaste antikehade väga kõrge taseme korral uuritud seerumis (mis on kõige iseloomulikum sekundaarsele süüfilisele) on võimalik TPHA valenegatiivne tulemus (nn prosooni nähtus).

Pikka aega süüfilist põdenud inimeste veres tuvastatakse spetsiifilisi aglutiniini antikehi, mistõttu ei saa RPGA-d soovitada uuesti nakatumise diferentsiaaldiagnostikaks ega nakkusprotsessi raskusastme määramiseks.

RPGA-d ei kasutata ravi kontrollimiseks, kuna. võib jääda positiivseks palju aastaid pärast taastumist. Samas saab seda kasutada lisameetodina (RMP-le või RPR-le) ravi efektiivsuse jälgimisel, antikehade tiitrite languse dünaamika uurimisel. Selle eelduseks on sama RPGA testisüsteemi kasutamine nagu patsiendi esimesel (enne ravi) läbivaatusel, samuti uuring samas laboris.

6. RPHA tundlikkus ja spetsiifilisus

RPHA-d peetakse väga tundlikuks ja spetsiifiliseks testiks. See reaktsioon on väärtuslik diagnostiline test süüfilise kõigi vormide puhul, kuid see on eriti tundlik haiguse kaugelearenenud vormide korral. RPHA tundlikkus varieerub sõltuvalt haiguse staadiumist. Primaarse süüfilise korral on RPHA tundlikkus 76% (ja kõrgem), sekundaarse süüfilise korral - kuni 100%. Varjatud varajase - 97%, hilise süüfilisega - 94%, spetsiifilisusega 98-100%. Värskete haigusvormide madalam tundlikkus on tingitud hilisemast aglutiniinide moodustumisest.

Riigiasutuse "TsNIKVI Roszdrav" andmetel oli RPHA tundlikkus süüfilise erinevate vormide diagnoosimisel 99,4%. Enamik teadlasi märgib RPHA 98–99% spetsiifilisust.

Tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest ei jää RPHA alla ning hiliste vormide ja kaasasündinud süüfilise puhul ületab see isegi RIF-i ja RIBT-i.

7. RPGA meetodi rakendusala

TPHA-d saab kasutada nii sõeluuringu kui ka kinnitava testina; saab kasutada poolkvantitatiivses variandis koos antikeha tiitri arvutamisega. Arenenud kvantitatiivne meetod RPHA seadistamine, mikromeetod, samuti automatiseeritudn.

8. RPHA omadused, eelised ja puudused

Kirjanduse andmetel on RPGA võtnud kliinilises praktikas järjekindlalt liidripositsiooni enamikus maailma riikides. TPHA on välismaistes suguhaiguste kliinikutes enim kasutatav test.

RPGA tehnikat on lihtne teostada, ei vaja erivarustust: selle seadistamiseks on vaja vaid hemaglutinatsiooniplaati. Uuring ei võta kaua aega; reaktsioon on väga tundlik ja spetsiifiline. Meetodi aprobeerimine kliinilises praktikas on näidanud, et see on äärmiselt lihtne, odav ja tundlik. Sarnaselt ELISA-ga on RPHA-d lihtne teostada, see ei nõua kõrgelt kvalifitseeritud töötajaid ja eriseadmeid ning selle automatiseerimine on võimalik.

RPGA testi eelised:

• lihtne seadistada ja tõlgendada,
• ei vaja erivarustust,
• aeg tulemuse saamiseks - 45 minutit,
• sobib masssõeluuringuks (lahjenduses 1:20 on vaja ainult 25 µl seerumit),
• kõrge standardiseerituse tase,
• sisekontrolli olemasolu,
• pikk säilivusaeg
• vastuvõetav hind
• raamatupidamise automatiseerimise võimalus.

Samuti tuleks märkida RPGA puudusi:

• mittespetsiifiliste reaktsioonide võimalus erütrotsüütide vastaste antikehade juuresolekul,
• tiitri ja süüfilise staadiumi korrelatsiooni puudumine,
• hilisem positiivne reaktsioon süüfilise varases staadiumis,
• valepositiivsete reaktsioonide võimalus alkoholi tarvitanud isikutel, narkomaanidel,
• tundlikkus vibratsiooni ja temperatuuri suhtes laboris.

RPGA eelised võrreldes RIBT-i ja RIF-iga on järgmised:

• tööstuslike katsesüsteemide kasutamine,
• reaktsiooni automatiseerimise võimalus,
• pole vaja töötada elava kahvatu treponemaga,
• välistab vajaduse vivaariumi järele.

9. RPHA seadistusvigade allikad ja põhjused, valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused

Passiivse hemaglutinatsiooni reaktsioon on suhteliselt lihtne uuring; selle teostamisel on vaja järgida kõiki diagnostikaseadmete tootjate soovitusi ja tööreegleid kliinilise diagnostika laboris. Tehtud vead võivad viia reaktsiooni nii valenegatiivsete kui ka valepositiivsete tulemuste ilmnemiseni ja registreerimiseni. RPGA valepositiivsed tulemused võivad olla tingitud inimfaktori ja bioloogiliste tegurite mõjust.

Võib saada valepositiivseid tulemusi

• mittesuguhaigustega treponematoosidega patsientide vereseerumite uurimisel,
• reumatoidfaktori tõttu
• Treponemaalse antigeeniga ristreageerivate antikehade tõttu, mis tekivad mitmesuguste süsteemsete või ravimitest ja ravimitest põhjustatud ainevahetushäirete käigus,
• immunoglobuliinide ebanormaalse taseme tõttu;
• vastsündinutel - ema IgG-vastaste IgM-antikehade moodustumise tõttu loote või lapse kehas, mis raskendab tulemuste tõlgendamist ja kaasasündinud süüfilise diagnoosimist.

Vead, mis on põhjustatud inimeste osalemise teguri mõjust uuringule:

• saastunud mikroplaadid
• vale pipeteerimine
• vibratsioon laboris
• õhutemperatuur laboris on väljaspool temperatuurivahemikku: 18–25 kraadi

Kõige tüüpilisemad tehnilised vead RPGA seadistamisel, mis põhjustavad ebausaldusväärseid tulemusi, on järgmised:

• koostisainete ebatäpne lahjendamine,
• temperatuuri rikkumine,
• reaktiivide inkubatsiooniaja rikkumine,
• tabletile reaktiivide pealekandmise tingimuste rikkumine,
• lahuste pH mittevastavus nõutavatele,
• laboratoorsete klaasnõude saastumine.

RPGA seadistamisel võivad vigade allikaks olla ka järgmised tehnilised punktid:

• kontrollvereseerumite reaktsiooni koostisest väljajätmine;
• erütrotsüütide ebaühtlane kontsentratsioon diagnostikas, mis on tingitud ebapiisavast segamisest enne kasutamist;
• diagnostiliste ja kontrollerütrotsüütide säilitamise tingimuste rikkumine; aegunud komplektide kasutamine;
• saastunud katseklaaside, pipetiotste, pipettide, immunoloogiliste plaatide, lahuste kasutamine reaktsioonide seadistamisel;
• vereseerumi proovi esialgse lahjendamise ebatäpsused;
• ebapiisav põhjalikkus järjestikuste topeltlahjenduste tegemisel;
• temperatuurirežiimi ja inkubatsiooniaja mittejärgimine;
• kõrvaliste vibratsioonide olemasolu ja immunoloogilise plaadi raputamine inkubatsiooni ajal;
• RPGA määramise meetodi rikkumine, mis väljendub kontrollerütrotsüütidega uuringu läbiviimisest keeldumises.

Vereplasma kasutamine, mis sisaldab antikoagulante, mis võivad põhjustada mittespetsiifilist erütrotsüütide aglutinatsiooni (RPHA), võib viia tulemusteni, mida ei saa tõlgendada.

Valepositiivsete ja valenegatiivsete tulemuste arv on väiksem kui teiste seroloogiliste testide puhul. LPR-d RPHA taustal on haruldased ja võimalikud treponematooside korral (leib, bejel, pint). Samuti registreeriti valepositiivseid tulemusi (kokku alla 1%) narkomaanidel, patsientidel nakkuslik mononukleoos, borrelioos, pidalitõbi, kollagenoosidega, maksatsirroos, lümfosarkoom, samuti rasedatel.

Reaktsiooni valenegatiivsed tulemused võivad olla tingitud konkurentsist IgM ja IgG antikehade vahel. Valenegatiivsed tulemused on võimalikud ka HIV-nakkusega patsientidel.

10. RPHA meetodi modifikatsioonid

RPGA seadistusel on mikro- ja makro modifikatsioonid, esimest kasutatakse sagedamini säästlikkuse, seadistamise kiiruse ja tulemuste arvestamise tõttu.

Lisaks töötati välja pildianalüüsi automaatne diagnostikakompleks, mis võimaldas teostada tulemuste kvantitatiivset automaatset hindamist ja välistada subjektiivsuse saadud andmete tõlgendamisel. Riistvara-tarkvara kompleks tunneb pildi ära, töötleb andmeid ja annab vastuse suhtelistes ühikutes.

Lugejaid ja automaatseid analüsaatoreid kasutatakse ka RPGA tulemuste salvestamise automatiseerimiseks.

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) – tehisosakeste aglutinatsioonitest Treponema pallidum'i antikehade tuvastamiseks

TPPA testi lühikirjeldus

Praegu kasutatakse süüfilise diagnoosimiseks ka passiivse hemaglutinatsiooni meetodi modifikatsiooni - TPRA (Treponema pallidum particle agglutination), mille puhul kahvatu treponema antigeen fikseeritakse želatiiniosakestele. Kuna kunstlikel polümeeriosakestel ei ole oma bioloogilist aktiivsust määravaid antigeene, siis on neil põhinevaid süüfilise serodiagnostika komplekte põhjust pidada arenenumateks. Bioloogiliselt inertsete kunstlike osakeste kasutamine minimeerib mittespetsiifilist aglutinatsiooni, mida tavaliselt esineb teiste kandjate puhul.

TPPA-d kasutatakse seroloogiline diagnoos antikehad patogeensete treponeemide erinevat tüüpi ja alamliikide vastu. Seda testi saab kasutada süüfilise, pint, bejeeli ja yawsi tekitajate vastaste antikehade tuvastamiseks.

Uuringu protseduur on väga lihtne ega vaja erivarustust – kasutatakse standardseid "U"-kujulisi mikroplaate. Test põhineb T. pallidum'i antigeenidega, patsiendi vereseerumis leiduvate antikehadega, sensibiliseeritud želatiiniosakeste aglutinatsioonil.

TPPA on kinnitav treponemaalne test, mis on kasulik nii väikese prooviarvu kui ka massilise sõeluuringu jaoks. Välismaal kasutatakse TPPA-d kinnitava testina ja mikrohemaglutinatsiooni testi MHA-TP (microhemaglutination assay for antibodies to T. pallidum) asendamiseks.

TPPA testi tundlikkus on 85–100%, spetsiifilisus aga 98–100%. TPPA tundlikkus primaarse süüfilise suhtes on 88%, sekundaarse ja hilise latentse süüfilise puhul 98%-100%.

Kui süüfilise diagnoosimiseks kasutatakse TPPA-d, võivad teist tüüpi treponema (nt T. pallidum endemicum, pertenuum või carateum) vastased antikehad põhjustada valepositiivseid tulemusi. Nende antikehade eemaldamiseks seerumiproovidest enne testi alustamist on mitmeid meetodeid.

TPPA testi põhimõte

TPPA on želatiiniosakeste passiivne aglutinatsioonimeetod inimese seerumis või plasmas. Patogeense treponema vastaseid antikehi sisaldav seerum reageerib želatiiniosakestega, mis on sensibiliseeritud ultraheliuuringuga Nicholsi tüve kahvatu treponema antigeeniga. Reaktsiooni tulemusena moodustub mikrotiiterplaadi süvendis aglutineerunud želatiiniosakestest sile kile.

Kui antikehad puuduvad, settivad osakesed plaadi süvendi põhja, moodustades aglutineerimata osakestest kompaktse "nupu". Sensibiliseerimata želatiiniosakestega kontrollsüvendid peaksid samuti näitama iga seerumi jaoks sellist kompaktset "nuppu", st aglutinatsiooni ei esine.

TPPA testi rakendamine

TPPA on universaalne test, mida saab võrdselt edukalt kasutada nii elanikkonnarühmade süüfilise kohustuslikul ennetusuuringul (sõeluuringul) kui ka spetsialiseeritud dermatoveneroloogilistes asutustes. TPPA testi eeliseks on selle kõrge tundlikkus, mis ei jää alla klassikalised testid, mis olid kuni viimase ajani süüfilise serodiagnoosi "kuldstandard". Testi eelisteks on ka kõrge reprodutseeritavus, samuti reaktsiooni seadistamise lihtsus ja kiirus.

TPPA testi kasutatakse süüfilise mittetreponemaalsete sõeltestide (nt VDRL-testi) positiivsete tulemuste kinnitamiseks ja patsientide hindamiseks, kellel on negatiivsed mittetreponemaalsed testid, kuid kellel on hilisele süüfilisele viitavad nähud või sümptomid. TPPA kasutamine ainsa süüfilise sõeltestina ei ole soovitatav.

Lisaks saab TPPA aglutinatsioonitesti kasutada tserebrospinaalvedeliku proovide uurimiseks neurosüüfilise diagnoosimisel. Sel juhul, nagu ka teiste seroloogiliste testide puhul, tuleks tulemuste tõlgendamisel läbi viia kohustuslik kombinatsioon haiguse muude näitajate ja sümptomitega.

TPPA testi tulemused

Tulemust hinnatakse "plusside" süsteemi järgi - alates (-) kuni (2+). Katsetulemused on nähtavad palja silmaga ja neid tõlgendatakse järgmiselt:

Tulemused salvestatakse, et teha kindlaks vastavus ülaltoodud kirjeldusele. Määramatu tulemusega (±) proove tuleks uuesti testida. Juhul, kui proov annab mitmes TPPA testis ebamäärase tulemuse, on soovitatav uuring läbi viia muude meetoditega.

Analüüsi tulemusi ei tohiks käsitleda eraldiseisvana. Näiteks nakkuse varases staadiumis on antikehade hulk veel liiga väike, mistõttu puudub TPPA ja paljude teiste meetodite tundlikkus. Seetõttu tuleb süüfilise kahtluse korral proovid uuesti läbi vaadata, isegi kui analüüsitulemused on negatiivsed. Diagnoosi tegemiseks on vaja arvesse võtta patsiendi kliinilisi sümptomeid, kliiniline ajalugu ja muud andmed.

Nagu TPHA testis, võib TPPA puhul täheldada prosooni fenomeni ja valenegatiivset tulemust, kui seerumiproov sisaldab liiga kõrget antikeha tiitrit.

ELISA - ELISA

Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA; Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs, ELISA) on üks paljudest meetoditest nakkushaiguste seroloogiliseks diagnoosimiseks. Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA) süüfilise serodiagnostikas on kahvatu treponema antigeenide vastaste klasside M, G ja A antikehade (IgM, IgG, IgA) test. ELISA-d on võimalik teha tserebrospinaalvedelikuga.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) kasutuselevõtt praktikas Wassermani reaktsiooni ja teiste kardiolipiinitestide asemel on oluliselt parandanud süüfilise laboratoorse diagnoosimise kvaliteeti. Selle meetodi oluliseks eeliseks on uurimisprotsessi automatiseerimise võimalus, mis vähendab inimfaktori mõju.

1. ELISA meetodi ajalugu

Tahkefaasilise kandja pinnal tehtava ensüümi immuunanalüüsi põhiprintsiibid töötasid välja E. Engvar et al. (1971), B.Van Weeman ja A.Schuurs (1971). Nende välja töötatud ensüümi immuunanalüüsi pakkusid esmakordselt süüfilise diagnoosimiseks 1975. aastal J. Veldkamp ja A. Visser, kes hindasid selle automatiseeritud testi potentsiaali. ELISA-d hakati süüfilise diagnoosimisel laialdaselt kasutama 1980. aastatel, mil töötati välja ja sertifitseeriti diagnostilised testid ning standardiseeriti testimismeetodid. NSV Liidus töötasid süüfilise diagnoosimise ELISA tehnika välja V. N. Bednova, A. V. Babiy ja A. V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. ELISA meetodi põhimõte

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) on reaktsioonimehhanismi järgi lähedane RIF-ile (tuvastatakse samad antikehad). Ensüümi immuunanalüüsi reaktsioon klassifitseeritakse immunoloogiliseks reaktsiooniks, mis põhineb treponema pallidum'i antigeenide väga spetsiifilisel interaktsioonil süüfilisega patsiendi antikehadega.

Süüfilidoloogilises praktikas kasutatakse peamiselt ELISA kaudset varianti. Kõige sagedamini kasutatava kaudse reaktsiooni variandi põhimõte on järgmine. Polüstüreenplaadi süvendite pinnale on fikseeritud immuunkompleksid, mis moodustuvad süüfilisega patsiendi antikehade koostoimel kahvatu treponema antigeenidega. Pärast seda tuvastatakse need värvireaktsioonis, kasutades spetsiifilisi konjugaate ja sobivaid substraat-kromogeenseid lisandeid.

Testi sooritamise protseduur on järgmine: patsiendi seerum asetatakse tahkefaasilisele kandjale, millele on kinnitatud antigeen. Antikehade olemasolul selles moodustub kandja pinnale antigeen-antikeha kompleks. Reaktsiooni tulemuste "avaldamiseks" kasutatakse inimese Ig vastaseid liigivastaseid antikehi, mis on konjugeeritud ensüümmarkeritega. Positiivse reaktsiooni korral lagundab antigeen-antikeha kompleksiga seotud ensüüm süsteemi lisatud substraadi, mille tulemusena tekib erineva intensiivsusega värvumine.

Reaktsioonis määratakse tahkele faasile adsorbeerunud AG ja AT kompleksi, kasutades ensüümiga märgistatud antiglobuliini antikehi, vastavalt ensüümi värvusreaktsioonile substraadiga.

Reaktsioonis määratakse tahkele faasile adsorbeerunud antigeenide ja antikehade kompleks, kasutades ensüümiga märgistatud antiglobuliini antikehi.

ELISA võimaldab tuvastada erinevate klasside seerumi Ig-d. Turul on süsteeme, mis võimaldavad teil määrata eraldi IgM ja IgG ning koguantikehi.

ELISA jaoks kasutatavatel spetsiifilistel antigeenidel võib olla erinev päritolu:

ülihäälne- need on saadud bakteriraku T.pallidum hävitamise tulemusena ultraheli või muul meetodil;

rekombinantne- need saadakse geenitehnoloogia tehnoloogiate abil, viies bakteriraku (nt Escherichia coli E.Coli) genoomi teatud T.pallidum antigeeni sünteesi eest vastutava geeni, millele järgneb bakterite massi kasv. tootev mikroorganism, nende rakkude hävitamine, antigeeni eraldamine ja puhastamine;

peptiid- saadakse järjestikuse tulemusel keemiline süntees T.pallidum valkude antigeensed epitoobid.

Keha on võimeline moodustama antikehi peaaegu iga antigeeni molekuli osa vastu. Normaalse immuunvastuse korral seda tavaliselt ei esine. Ühel või mitmel valguantigeenist eraldatud immunogeensel peptiidil on eriline antigeensus ja enamik antikehi moodustub spetsiifiliselt nende vastu. Nad arendavad kõige intensiivsemat immuunvastust. ELISA kõige informatiivsemad näitasid kahvatu treponema valkude immunodominantseid piirkondi molekulmass 15 kD, 17 kD ja 47 kD. Antigeenina kasutati Nicholsi tüve patogeensete treponeemide pesuaineekstrakti või sonikaati.

3. Uurimistöö läbiviimise meetod meetodiga

Meetodi põhimõte on identifitseerida tahkele faasile (plastplaadi süvendite pinnale) adsorbeeritud spetsiifiline antigeen-antikeha kompleks ensüümiga (peroksüdaasiga) märgistatud antiglobuliini antikehadega, kasutades substraadiga värvireaktsiooni, mis on kvantifitseeritud spektrofotomeetriliselt.

Polüstüreenplaadi süvendite sensibiliseerimiseks kasutatavad antigeenid võivad olla:

• lüsaat- saadud kahvatu treponema hävitamise tulemusena ultraheliga;
• peptiid- saadud kahvatu treponema valkude fragmentide keemilise sünteesi tulemusena ja millel on patogeeni algsete valkudega sarnane antigeenne reaktiivsus;
• rekombinantne- saadud geenitehnoloogia meetoditega, kandes antigeenseid determinante, mis on identsed kahvatu treponemaga.

Süüfilidoloogilises praktikas kasutatakse tavaliselt ELISA kaudset varianti.

4. Tulemuste arvestus

ELISA-s kasutatakse antigeeni-antikeha reaktsiooni visualiseerimiseks ensüümi reaktsiooni ( aluseline fosfataas või mädarõika peroksidaas) substraadiga, mis muudab selle värvi. Värvi intensiivsus määrab reaktsiooni positiivsuse ("-" kuni "++++"). ELISA tulemusi saab hinnata visuaalselt 4-punktilises süsteemis või instrumentaalselt digitaalsete optilise tiheduse indikaatorite kujul, mis saadakse spetsiaalsetel lugejatel (nt Multiscan) lainepikkusel 492 nm. Sest tulemuste hindamine toimub spektrofotomeetriliselt, see välistab subjektiivse tõlgendamise.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

ELISA positiivsuse tingimused - alates 4. nädalast pärast nakatumist. ELISA (nagu ka RIF) tulemused muutuvad positiivseks esmase perioodi esimestel päevadel või inkubatsiooni lõpus ja jäävad positiivseks kõigil perioodidel. ELISA on eriti väärtuslik süüfilise varajases diagnoosimises – positiivseid antikehade tulemusi võib saada juba haiguse inkubatsiooniperioodi lõpus (st 4-6 nädalat pärast nakatumist).

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

ELISA on väga tundlik ja spetsiifiline test, mis on selle eelis. ELISA on reaktsioonimehhanismi, tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest lähedane RIF-ile, tk. mõlemas reaktsioonis osalevad samad antikehad. Enamik teadlasi märgib kõrget spetsiifilisust ja tundlikkust haiguse kõigil etappidel. Erinevate ELISA variantide tundlikkus ulatub G. A. Dmitrijevi sõnul 98–100% -ni ja spetsiifilisus 96–100%. TsNIKVI andmetel on ELISA tundlikkus süüfilise suhtes 99,1% (Vene Föderatsiooni korraldus nr 87 M3).

Tahkefaasi ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) variant on üks tundlikumaid seroloogilisi teste, mis võimaldab tuvastada 0,0005 µg/ml antikehi ja 0,000005 µg/ml antigeene.

7. Meetodi ulatus

Meetodit soovitatakse kasutada rasedate, kontaktisikute, doonorite ja riskirühmade esindajate uurimisel. ELISA-d saab kasutada nii sõeluuringu kui ka kinnitava testina. ELISA on suhteliselt lühikese ajaloo jooksul arenenud soovituslikust testist kinnitavaks testiks. Süüfilise diagnoosimisel kasutatakse testi ka positiivseid tulemusi andvate proovide kinnitava testina, kasutades erinevaid mittetreponemaalseid teste ja TPHA-d.

ELISA meetodit saab kvantitatiivselt kasutada positiivsuse ehk reaktiivsuse indeksi arvutamisel, mis võimaldab hinnata antikehade taset proovis.

Praegu reguleerib Venemaal ensüümi immuunanalüüsi kasutamist süüfilise diagnoosimisel Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi 26. märtsi 2001. aasta korraldus nr 87 "Süüfilise seroloogilise diagnoosi parandamise kohta" (lisa nr. 1 "Süüfilise sõeluuringute ja diagnostiliste testide seadistamine"). Korralduses on kavas seroreaktsioonide kompleksis (SSR) olev RSK asendada ELISA ja RPHA-ga.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

Ensüüm-immunoanalüüs on keeruline mitmeetapiline uuring, mille käigus on vaja rangelt järgida kõiki diagnostikakomplektide tootjate soovitusi, uuringus kasutatud seadmete reguleerimise ja konfigureerimise reegleid.

ELISA seadistamisel võivad vigade allikaks olla järgmised punktid:

Uuring hüperlipideemilise, hemolüüsitud vereseerumi või bakterite kasvu tunnustega proovide reaktsiooni kohta;

Ärge harjutage bioloogilise materjali proovi kahekordset või enamat külmutamist, vajadusel tehke kordusuuring, kasutage duplikaatkatsutist võetud seerumit;

Immunosorbendi ja pesulahuse säilitamise tingimuste ja tingimuste rikkumine; aegunud testikomplektide kasutamine;

Reaktsioonikomponentide rakendamine teistest diagnostikakomplektidest;

Reaktsioonietappide aja rikkumine;

immunoloogilise plaadi süvendite kuivatamine reaktsioonietappide ajal;

Plastnõude (plastist kandikute) taaskasutamine kromogeeni ja substraadi segu valmistamiseks;

Kasutatavate seadmete (seib ja spektrofotomeeter) tööparameetrite metroloogilise kontrolli sageduse mittejärgimine;

Saastunud laboriklaaside kasutamine reaktsioonide seadistamisel: kolvid, mõõtesilindrid, katseklaasid, pipetid, pipetiotsad;

Ebapiisav hoolitsus proovide lahjendamisel bioloogiline materjal;

Vead bioloogilise materjali proovi sisestamisel tableti vastavasse süvendisse;

Vead õppetulemuste kandmisel registreerimispäevikusse, õppeprotokolli või vastusevormi.

Diagnostiliste testikomplektide kasutamise juhendi soovituste hoolikas rakendamine, pipetidosaatorite ja automaatsete seadmete täpsuse regulaarne kontrollimine, sisemiste positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine võimaldavad saada väga reprodutseeritavaid ELISA tulemusi.

9. Omadused, eelised ja puudused

ELISA on oma lihtsuse, reprodutseeritavuse ja kättesaadavuse tõttu üks kaasaegseid ja paljutõotavaid süüfilise serodiagnostika meetodeid. Antikehade tuvastamine ELISA abil on ideaalne diagnostiline meetod, mis sobib suure hulga proovide samaaegseks uurimiseks. Oma eeliste tõttu on see populaarsust kogunud kõigis riikides.

ELISA uuringute tehnoloogia tagab kõigi kaubanduslike diagnostiliste testikomplektide tootjate soovituste järgimise ja uurimisprotseduuri põhjalikkuse. ELISA uuringute läbiviimiseks on vaja osta täiendavaid spetsiaalseid seadmeid. Seadistustehnika võtab kauem aega võrreldes RMP, RPR ja RPGA-ga.

Mitme etapi või kogu protsessi kui terviku automatiseerimise olemasolu võimaldab teil samaaegselt uurida suur hulk bioloogilise materjali proovid koos uuringu kõrge standardiseerituse astmega, subjektiivse elemendi minimeerimine tulemuste hindamisel, fikseeritud uuringuprotokollide salvestamise võimalus, mis võimaldab arhiveerida uuringuandmeid ja neid uuesti retrospektiivseks analüüsiks suunata.

Eelised:

• Võimaldab süüfilise tekitaja vastaste IgM ja IgG antikehade diferentseeritud ja täielikku määramist.
• kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus läheneb 100%
• reprodutseeritavus
• automatiseerimise võimalused

ELISA eelised hõlmavad kõrget spetsiifilisust (96–100%) ja tundlikkust (98–100%), mida märkis enamik teadlasi.

Mitme etapi või kogu protsessi kui terviku automatiseerimise olemasolu võimaldab üheaegselt uurida suure hulga bioloogilise materjali proovidega voolu, mis on uuringu kõrge standardiseerituse astmega, minimeerides hindamise subjektiivse elemendi. tulemuste kohta võimalus salvestada fikseeritud uuringuprotokolle, mis võimaldavad uuringuandmeid arhiveerida ja neile tagasiulatuva analüüsi jaoks uuesti juurde pääseda.

Manuaalsete meetodite, sealhulgas T. pallidum'i antigeenide vastaste antikehade määramise ELISA abil, olulised puudused on:

~ võimalikud vead personal õppetöö ajal (järelevalve, hooletus, tehnoloogia rikkumine);

~ uurimisprotsessi täieliku standardimise võimatus ELISA manuaalse versiooniga;

~ suurenenud personali nakatumise oht.

10. Meetodi modifikatsioonid

Lisaks klassikalisele kaudsele ELISA-le on ka meetod tuntud. püüdmine ELISA. Selle pakkusid 1989. aastal välja O. E. Ijsselmudien jt. tuvastada IgM klassi antikehi Tr antigeenide vastu. pallidum. Meetod on kõrge spetsiifilisuse ja tundlikkusega.

Klassi M inimese immunoglobuliinide vastased puhastatud antikehad sorbeeritakse tableti süvendite pinnale ja pärast testitava seerumi inkubeerimist seondub kogu IgM kandjaga. Esinemine seotud IgM-i hulgas, mis on spetsiifilised antigeenide Tr suhtes. pallidum tuvastatakse Tr antigeenide abil. pallidum konjugeeritud ensüümiga.

See meetod võimaldab tuvastada mitte ainult IgM klassi, vaid ka IgG, IgA klassi antikehi. Selleks sensibiliseeritakse plaatide süvendid inimese immunoglobuliinide vastaste teatud klassi afiinsuspuhastatud antikehadega. Sel juhul püütakse selle klassi antikehad seerumist ja treponemispetsiifiliste antikehade tuvastamine toimub nende kombineerimisel konjugaadiga, mis on treponemaalse antigeeni ja ensüümi kombinatsioon.

Lõksu ELISA kasutamine vähendab reumatoid verefaktori poolt vahendatud valepositiivsete reaktsioonide riski, M ja G klassi immunoglobuliinide ristreaktsioone. Vastsündinute uurimisel on antud juhul valepositiivsed testitulemused, mis on seotud vastu suunatud IgM tuvastamisega. Samuti on välistatud ema antitreponemaalne IgG.

Kuna ELISA variante kasutatakse välismaal laialdaselt ensüümi immuunanalüüs (EIA) ja süsteem ICE süüfilis. Viimases adsorbeeriti plaadi süvenditesse IgM ja IgG vastaste antikehade segu, samuti kolm rekombinantset T. pallidum valku. Positiivseid tulemusi testitakse samas testisüsteemis kahes korduses, et saada lõpptulemus.

Venemaal on kodumaiste reaktiividega ELISA abil süüfilise serodiagnostikaks välja töötatud mitmeid katsesüsteeme. Nendel süsteemidel on kõrge spetsiifilisus ja tundlikkus.

Lisaks ülaltoodule on ELISA jaoks ka muid võimalusi, sealhulgas neid, mis võimaldavad otsene tuvastamine patogeen veres (otsene ELISA), dot-ELISA reaktsiooniga nitrotselluloosribadele, ELISA kapillaarverega, samuti immunoblotanalüüs või Western blot, mille käigus tuvastatakse samaaegselt patogeeni erinevate komponentide vastased antikehad.

ELISA kaasaegne täiustatud modifikatsioon on immunoblotanalüüs.

ICA (immunokeemiluminestsentsanalüüs), ICL (immunokemiluminestsentsanalüüs)

Vene Föderatsiooni tervishoiu moderniseerimise kontekstis laboridiagnostika arenguga on laborite praktikasse jõudnud laboriuuringute automatiseerimine, mis võimaldab standardiseerida uuringute analüütilisi etappe. See parandab diagnostika kvaliteeti. Automatiseerimise kasutuselevõtuga hakati rakendama uusi kõrgtehnoloogilisi kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega meetodeid, näiteks kemoluminestsentsimmunoanalüüsi (CLIA)

Kemiluminestsents on footonite emissiooniprotsess oksüdatiivsete keemiliste reaktsioonide elektrooniliselt ergastatud produktide üleminekul algsesse energiaolekusse. Kemoluminestsentsreaktsiooni käigus vabaneb märkimisväärne kogus energiat ja kiiratava valguse kvantsaagis on üsna kõrge. Kõigist mitteisotoopsetest meetoditest tagab kemoluminestsents kõrgeima tundlikkuse. Immunomeetriliste meetodite puhul on kemoluminestsentsi tundlikkus suurusjärgus kõrgem kui radioimmunoanalüüsil.

Immunokemiluminestsentsi meetod (ICL) on nüüd leidnud rakendust kasvajamarkerite diagnoosimisel, autoimmuunhaigused, diabeet, südamemarkerid, hormoonid ( kilpnääre, neerupealised, nais- ja meessuguhormoonid), tõrviku infektsioonid, viiruslik hepatiit, herpese rühma viirused.

Immunokemiluminestsentsi meetodi põhjal on välja töötatud mitmeid väga tundlikke ja spetsiifilisi (98-100%) süüfilise diagnoosimise testsüsteeme, mida kasutatakse peamiselt välismaal.

Meetodis kasutatakse antigeenidena geenitehnoloogia meetoditega saadud rekombinantseid lipoproteiine, mis on T.pallidum antigeenide täielikud analoogid.

Kliinilise uuringu tulemuste põhjal on ICA meetodit tunnustatud ja soovitatud kasutada Venemaa Föderatsioonis süüfilise laboratoorsel diagnoosimisel sõel- ja kinnitava testina, kui laborites on olemas vastav varustus. 2012. aastal lisati ICA sugulisel teel levivate infektsioonide ja urogenitaalsete infektsioonidega patsientide ravimise kliinilistesse juhenditesse süüfilise diagnoosimise sõeluuringu ja kinnitava testina.

Seega annab kõrgtehnoloogilise ICA kasutamine, mis on automatiseerimise kasutuselevõtuga jõudnud nii maailma kui ka kodumaise laboridiagnostika praktikasse, järgmised eelised:

• subjektiivsete tegurite mõju välistamine uuringu analüütilises etapis
• töötajate ohutus potentsiaalselt nakatunud bioloogilise materjali uuringute läbiviimisel
• tulemuste saamise kiiruse suurendamine patsiendi poolt
• teadusuuringute standardimine ja uuringute kvaliteedi kontroll
• usaldusväärsete ja usaldusväärsete tulemuste edastamine patsientidele
• kvaliteetsed kliinilised laboriuuringud.

Tundlikkuse poolest on ICA meetod võrreldav radioimmunoanalüüsi meetodiga ning teostamise lihtsuse, personali ohutuse ja paljude muude parameetrite poolest ületab see seda.

Kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega (98–100%) ICA meetod võimaldab kvantifitseerida süüfilise tekitaja vastaste antikehade taset ning seda saab kasutada süüfilise infektsiooni kinnitamiseks ja sõeluuringuks. Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

Immunokromatograafia (ICH).

Vene Föderatsioonis on suhteliselt uued meetodid treponema-spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks, mis põhinevad immunokromatograafia (ICH) meetoditel. Nagu ICA meetodi puhul, kasutatakse antigeenidena geenitehnoloogia meetoditega saadud rekombinantseid lipoproteiine (näiteks: Tp15, Tp17, Tp47 antigeenid) ja biosünteetilist TmpA peptiidi. Neid antigeene kasutatakse ka erinevad kombinatsioonid immunosorbentide osana ELISA-s ja immunoblotanalüüsis.

ICG meetod võimaldab kiirelt määrata süüfilise tekitaja vastaste treponema-spetsiifiliste antikehade sisaldust seerumi- ja täisvereproovides ilma spetsiaalseid laboriseadmeid kasutamata ning seda kasutatakse esmatasandi tervishoiuteenuste osutamisel, sh epidemioloogiliste näidustuste korral.

Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

PBT (lihtsad kiirtestid voodi kõrval)

Suhteliselt hiljuti hakati süüfilise serodiagnostikas välja kujunema suund nn lihtsate kiirtestide (PBT) ehk patsiendi voodi kõrval tehtavate testide (Point-of-care – ROC) väljatöötamiseks. Lihtsad voodiäärsed kiirtestid ehk immunokromatograafilised testid võimaldavad kiirelt määrata süüfilise tekitaja vastaste treponema-spetsiifiliste antikehade sisaldust seerumi- ja täisvereproovides ilma spetsiaalseid laboriseadmeid kasutamata ning kasutada esmatasandi tervishoius, sh. epidemioloogilised näidustused. Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

Need testid põhinevad kahvatu treponema treponemaalsete antigeenide antikehade immunokromatograafilisel tuvastamisel ja tehakse ribadel; sel juhul võib kasutada nii täisverd kui ka seerumit (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Testide formaat võimaldab teil läbi viia uuringuid spetsiaalse varustuse puudumisel ja elektrit kasutamata. Kuid nende suhteliselt madala tundlikkuse ja spetsiifilisuse tõttu pole need testid veel oma teed leidnud. lai rakendus praktikas.

Immunoblotanalüüs (Western Blot)

Viimastel aastatel on ilmunud uurimismeetodid, mille eesmärk on tuvastada ja analüüsida antikehade sisaldust. iga antigeeni kohta kahvatu treponema eraldi. Üheks selliseks meetodiks on immuunblotanalüüs (või blotting, immunoblot, Western blot), mida kasutatakse kahvatu treponema vastaste IgG või IgM antikehade määramiseks. Immunoblotanalüüsi meetod on ensüümi immuunanalüüsi modifikatsioon - ELISA variant.

Immunoblotanalüüs on üks kaasaegsemaid süüfilise serodiagnostika meetodeid ja seda kasutatakse aktiivselt välismaal. See sai oma nime ("Western blotting") humoorika vastusena DNA tuvastamismeetodite ("Southern Blotting") ja RNA ("Northern Blotting") nimedele.

1. Meetodi ajalugu

Immunoblotimist (Western blot) kasutatakse kahvatu treponema antigeenide IgG või IgM antikehade määramiseks (Herremans M. et al., 2007).

2. Klassikaline immunoblot

Klassikaline immunoblot(Western Blot Analysis) ühendab ensüümi immuunanalüüsi ja elektroforeetilise meetodi kasutamise. Süüfilise põhjustaja valgu antigeenid eraldatakse eelnevalt elektroforeesiga ja viiakse kandjale - nitrotselluloosmembraanile (ribale). Seda ülekandmist nimetatakse blottinguks. Seejärel töödeldakse seda eraldatud punktidega (blotid) kandjat testitava seerumiga ja ensüümide või radioaktiivsete ainetega märgistatud IgG või IgM antikehadega. Meetod hõlmab looduslike või rekombinantsete treponema valkude kasutamist.

elektroforees on laetud ühendite eraldamine nende liikuvuse alusel elektroforeetilises väljas. Kui mõnes keskkonnas rakendatakse potentsiaalide erinevust, liiguvad positiivselt laetud molekulid negatiivselt laetud elektroodi poole ja negatiivselt laetud molekulid positiivse elektroodi poole.

Enamik globulaarseid valke on kokku pandud nii, et enamik laetud rühmi, nimelt hüdrofiilsed rühmad, paiknevad valgu pinnal, laenguta hüdrofoobsed jäägid aga sukeldatud gloobuli sisse. Elektriväljas migreeruvad valgud vastavalt oma laengule vastupidiselt laetud elektroodi suunas.

Valkude elektroforeetiline eraldamine viiakse läbi polüakrüülamiidil põhinevas sünteetilises geelkeskkonnas. Valkude eraldamiseks nende molekulmassi järgi eelinkubeeritakse valkude segu enne elektroforeesi naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul.

Välisteadlaste Weberi ja Osborni (1969) üksikasjalikud uuringud näitasid, et pärast sellist töötlemist on ainsaks teguriks, mis võib valkude liikuvust polüakrüülamiidgeelis (PAAG) mõjutada, valgu suurus, õigemini selle molekulmass. See võimaldas kasutada SDS-PAGE elektroforeesi meetodit SDS-i juuresolekul valkude ja peptiidide molekulmassi üsna täpseks määramiseks. Väliskirjanduses nimetati seda meetodit SDS-PAGE (naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforees).

Reaktiivsuse profiil klassikalises WB testis looduslike antigeenidega (polüakrüülamiidgeelelektroforeesi meetod naatriumdodetsüülsulfaadiga). (1) - kontroll positiivne tulemus, (2) - kontroll negatiivne tulemus, (3-6) - kliinilised proovid.

Selle meetodiga süüfilise testides, mis on eelnevalt puhastatud ja hävitatud selle koostisosadeni, allutatakse kahvatu treponema elektroforeesile polüakrüülamiid- või agaroosgeelis. Samal ajal eraldatakse selle koostises olevad antigeenid molekulmassi järgi.

Seejärel viiakse antigeenid vertikaalse elektroforeesi abil nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd nähtamatut spektrit kahvatule treponeemile iseloomulikke antigeenseid ribasid.

Analüüsi käigus kantakse uuritav materjal (seerum, patsiendi vereplasma jne) nitrotselluloosribale (ribale). Kui proovis on spetsiifilisi antikehi, seostuvad need inkubeerimise käigus tugevalt neile rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega ja moodustavad “antigeen-antikeha” kompleksi.

Pärast sidumata immunoglobuliinide eemaldamist riba pesemise käigus järgneb inkubeerimine konjugaadiga - ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide antikehad (inimese IgG või IgM antikehad), mille käigus ensüümiga märgistatud antikehad kinnituvad olemasolevale antigeen-antikehale. kompleksid membraani pinnal.

Pärast seondumata konjugaadi eemaldamist substraadilahusega inkubeerimise ajal interakteerub ensüüm substraadiga, mille tulemuseks on värvusreaktsioon - membraanilõikude värvumine (ribade kujul), kus paiknevad üksikud kahvatu treponema antigeenid, antikehad mis olid testitavas seerumis. Värvimise intensiivsus sõltub seerumist seotud antikehade hulgast. Reaktsiooni tulemust hinnatakse visuaalselt.

Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab kahvatu treponema rangelt määratletud antigeenide antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Selle meetodiga määratud immunodeterminantidel 15, 5, 17, 44,5, 47 kD on süüfilise puhul diagnostiline tähtsus. Ig G immunoblotanalüüs on tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest sarnane absorptsiooniga RIF-iga (RIF abs). Ig M-immunoblotanalüüs võib olla kaasasündinud süüfilise diagnostiline test.

3. Immunoblot lineaarse immuunanalüüsi vormingus

Lineaarne immuunanalüüs (line immunoassay, LIA) võimaldab samaaegselt määrata inimese seerumis või plasmas kahvatu treponema antigeenide vastaseid antikehi. Antigeenid kantakse eelnevalt testribadele (ribadele), mis tarnitakse kaubanduslike diagnostikakomplektide osana.

Ribad on valmistatud nitrotselluloosmembraanist, plastalusega polüamiidmembraanist või plastalusega nailonmembraanist. Tootmise ajal asetatakse testribale mitu eraldiseisvat antigeeni eraldi antigeensete joontena. Lisaks nendele süüfilise antigeenidele kantakse igale rajale veel neli kontrolljoont: streptavidiin ja kontrollid (3+, 1+ ja ± lõikejoon).

Ribade jaoks kasutatakse geenitehnoloogia abil saadud kunstlikke antigeene - rekombinantseid valke või sünteetilisi polüpeptiidi konstruktsioone. Need on kahvatu treponema pinnaantigeenide analoogid - TpN15, TpN17, TpN47 ja TmpA molekulmassiga 15, 17, 47 kDa ja 44,5 (TmpA), kus kDa = kilodaltonid. Nende abiga määratakse patogeeni erinevate immunodominantsete komponentide seerumi antikehad.

Uuritava proovi inkubeerimine toimub küvetis, kuhu asetatakse ka indikaatorriba. T. pallidumi vastased antikehad määratakse testribadele trükitud antigeenidega seondumise teel. Kui proovis on T. pallidum-spetsiifilisi antikehi, moodustavad need sidemed üksikute antigeeniliinidega. Kui testitavas seerumis sisalduvad antikehad interakteeruvad testribale asetatud diskreetsete T. pallidum antigeenidega, moodustub antigeen-antikeha kompleks visuaalselt tuvastatavate värviribade kujul.

Võttes arvesse immunoblotanalüüsi tulemusi, hinnatakse seerumi reaktsioonivõimet iga antigeeni suhtes eraldi. Täielikult positiivne vastus antakse, kui tulemus saadakse samaaegselt kahe või kolme esitatud antigeeniga.

Uurimisprotseduurid viiakse läbi käsitsi või spetsiaalse analüsaatoriga, tulemuste tõlgendamisel spetsiaalselt arvutiprogramm nakkushaiguste jaoks.

Tänu rekombinantsete antigeenide kõrgele puhastusastmele ja süüfilise põhjustaja kõige immunogeensemate determinantide vastaste antikehade samaaegsele tuvastamisele on meetodil kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus.

4. Tulemuste arvestus

Antigeensete ribade värvumise intensiivsuse lugemiseks ribadel on välja töötatud fotomeetrid, mille töö põhineb signaali peegeldumisel, mis välistab subjektiivse hinnangu ja annab potentsiaalse võimaluse automatiseerimiseks.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

Western blot meetodil tehtud testid võivad tuvastada Treponema pallidum'i antigeenide spetsiifilisi antikehi haiguse väga varases staadiumis. Süüfilise diagnoosimisel on kõige olulisemad antikehad kahvatu treponema TpN15, TpN17, TmpA ja TpN47 antigeenide vastu. Need antigeenid on membraanivalgud, mille molekulmass on vastavalt 15, 17, 44,5 ja 47 kDa.

Treponema pallidum'i viimisel inimkehasse tekivad antisüüfilised antikehad selles järjekorras: esmalt tekib immuunvastus TpN17 antigeenidele, seejärel TpN47, pärast TpN15 ja hiljem kui kogu TmpA. Testitulemuste arvessevõtmisel hinnatakse seerumi reaktsioonivõimet igaühe suhtes eraldi. Näiteks kui lineaarses blotis on reaktiivsus ainult TpN17 ja TpN47 antigeense liini suhtes, tähendab see, et haigus on varases staadiumis. Mida rohkem antigeensed liinid muutuvad reaktiivseks, seda kaugemale infektsioon areneb. Süüfilise ravis muutub selle testi reaktsioonivõime.

IgM määramine valkudele molekulmassiga 15,17, 41, 47 kDa võimaldab tuvastada 29,2% sekundaarse süüfilisega, 12,5% varajase latentse süüfilise ja 8,0% seroresistentse süüfilisega patsientidest. IgG otsimist samade molekulide suhtes iseloomustab tundlikkus 61,6% seroresistentse ja 100% sekundaarse ja varajase latentse süüfilise suhtes.

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

Kirjanduse andmetel on testi tundlikkus ja spetsiifilisus väga kõrged - vastavalt 99,6-100% ja 99,3-99,5%. Klassikalise meetodi puhul saavutatakse see valkude, glüko- ja lipoproteiinide elektroforeetilise eraldamise ning immuunseerumi või monoklonaalsete antikehade tuvastamise maksimaalse spetsiifilisusega. Optimaalsetes tingimustes võib immunoblotanalüüs tuvastada antigeeni koguses, mis on väiksem kui 1 ng testitavas mahus.

Lineaarse bloti tundlikkus on samuti 99,6% ja spetsiifilisus 99,3% ja 99,5% vahel.

Ekspertide sõnul on immunoblotanalüüs rekombinantsete väga spetsiifiliste antigeenidega tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest sarnane RIF abs-ga.

Väliskirjanduse andmetel ja TsNIKVI-s läbiviidud uuringu tulemustel on immunoblotanalüüsi meetod süüfilise diagnoosimisel kõrge tundlikkusega (98,8-100%) ja spetsiifilisusega (97,1-100%).

7. Meetodi ulatus

Immunoblotanalüüs (immunoblot) on väga spetsiifiline ja väga tundlik võrdlusmeetod. Kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus võimaldavad seda meetodit pidada süüfilise kinnitava testina. Meetodit saab kasutada nii diagnoosi kinnitamiseks kui ka siis, kui teised treponemaalsed testid annavad küsitavaid ja vastuolulisi tulemusi. Western blot meetod võib diagnoosi kinnitada patsientidel, kellel on positiivsed või ebamäärased testitulemused, sealhulgas need, mis on saadud TPHA või ELISA abil.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

Valepositiivseid tulemusi on väga harva. Valenegatiivsed tulemused on samuti üsna haruldased ja neid täheldatakse immuunpuudulikkusega patsientidel - sagedamini HIV-nakkusega inimestel ja diagnostilise "akna" mõjuga antikehade sünteesi hilinemise tõttu, samuti staadiumis esinevate vigade tõttu.

Kaasaegsete katsesüsteemide kasutamine dikteerib kõigi nõuete täpse järgimise nii materjalile kui ka reaktsiooni toimimisele. Põhimõtteliselt on vigade allikaks uuringu järjekorra ja tehnoloogia rikkumine (eriti klassikalise Western blot puhul), testikomplektide tootjate soovituste mittejärgimine. . Vigu võib teha ka vereseerumi proovide kogumisel, kohaletoimetamisel, säilitamisel, samuti analüüside tegemisel. Lisaks määrdunud proovidele on muudeks võimalikeks põhjusteks aegunud testikomplektide kasutamine ja vead testitulemuste analüüsimisel.

9. Omadused, eelised ja puudused

Immunobloti unikaalsus seisneb selle kõrges infosisalduses ja tulemuste usaldusväärsuses.

Test ei vaja kõrgelt puhastatud antigeene, võrdlus- ja kontrollseerumeid. Antikeha sihtmärgi tuvastamine põhineb valgu molekulmassil, millega patsiendi seerumist pärinevad antikehad reageerivad. Ühes reaktsioonis saab tuvastada antikehade seondumise mitme antigeeniga, millest igaüks saab täpselt iseloomustada. Tänu sellele on immunoblotimisel mitmeid eeliseid võrreldes teiste antikehade tuvastamise meetoditega, mille tulemused sõltuvad standardiseeritusest, tundlikkusest, substraadi kvaliteedist, teatud antigeenide ebastabiilsusest või lahustumatusest.

Meetod on kergesti reprodutseeritav, suhteliselt lihtne teostada ja tulemusi tõlgendada, võimaldab määrata korraga mitme T. pallidum'i antigeeni vastaste antikehade spektri ja hinnata panust üldine reaktsioon erineva spetsiifilisusega antikehad.

Kõrge puhtusega rekombinantsete ja peptiidsete antigeenide kasutamine vähendab seerumite mittespetsiifilist reaktsioonivõimet. Meetodi kasutamine võimaldab vältida uurijale ohtlikke töömahukaid ja subjektiivseid meetodeid (G. pallidum'i tüvede siirdamine, töö patogeense T. pallidum'iga reaktsiooni seadistamisel). See määrab süüfilise diagnoosimisel immunoblotanalüüsi meetodi eelistamise teistele treponemaalsetele testidele (RIF ja eriti RIBT).

10. Meetodi modifikatsioonid

Sellel meetodil põhinevad mitmed kaubanduslikud testimissüsteemid. Mõned neist on vormingus western blot, koosnevad ribadest, millele kantakse üle T. pallidumi valgukomponendid, mis on eelnevalt polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga eraldatud.

Teised on vormingus lineaarne blot, koosnevad ribadest, millele on adsorbeeritud rekombinantsed ja sünteetilised polüpeptiidid diskreetsete joontena – T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 ja TmpA pinnaantigeenide analoogid.

Western blot'i tulemusi on raskem tõlgendada, kuna ribadel on palju erinevaid antikehi, millest paljud on rühmaspetsiifilised. Seevastu lineaarse blotanalüüsi tulemuste tõlgendamine on lihtne; lisaks võimaldavad ribale trükitud täiendavad kontrolljooned T. pallidum nelja antigeeni vastaste antikehade taseme poolkvantitatiivset hindamist.

xMAP tehnoloogia

xMAP on tipptehnoloogia, mis võimaldab teha mitmeparameetrilisi uuringuid, tuvastades samaaegselt mitu analüüti ühest bioloogilisest proovist. Tahke faasina kasutatakse värvilisi mikrosfääre, mis on kaetud püüdmisreagentidega (oligonukleotiidid, antikehad, antigeenid).

Uuritav proov lisatakse mikrosfääre sisaldavale lahusele. Proovis tuvastatud analüüdid seonduvad vastava mikrosfääriga, misjärel viiakse lahusesse tuvastav aine (tuvastusantikehad, fluorestseeruv märgis). Määratava analüüdi tuvastamiseks kasutatakse kahe laseri süsteemi, mis võimaldab nii kvalitatiivselt hinnata analüüdi olemasolu proovis (selleks kasutatakse punast laserit, mis klassifitseerib mikrosfääre värvi järgi) kui ka kvantitatiivset hindamist. analüüdi sisaldus proovis (selleks kasutatakse rohelist laserit).