Rakuline biotehnoloogia taimekasvatuses. GMO tehnoloogiad ja biotehnoloogia

Rakukultuuride ja rakutehnoloogiate eriline rakendusvaldkond on biotehislike elundite ja kudede arendamisega seotud koetehnoloogia. Praeguseks on kogutud fundamentaalsete teadmiste põhjal omandatud tehnoloogiaid erineva päritoluga rakukultuuride (taimerakud, putuka- ja imetajarakud) läbiviimiseks, sh tööstuslikus mastaabis.

Taimerakud ja taimekoekultuur võimaldavad protoplastidest ja rakkudest terve taime regenereerida. Taimerakukultuuride eripäraks on nende võime totipotentsusele, s.t. teatud keskkonnas ja teatud tingimustes on ühest rakust võimalik terve taim taastada. See tehnika annab suhteliselt lühiajaline kontrollitud tingimustes arvukate rakupopulatsioonide saamine ja võimaldab tuvastada suurenenud bioloogilise produktiivsusega taimeliine.

Taimerakkude konstrueerimine põhineb isoleeritud rakkude, kudede ja protoplastide kultuuri kasutamisel. Nende tehnoloogiate kasutamiseks taimekasvatuses on mitu võimalust.

Esimene on seotud isoleeritud taimerakkude võimega toota kultuuris väärtuslikke bioloogiliselt aktiivseid ühendeid, sealhulgas ženšenni või idioliite, eeterlikke õlisid, alkaloide, glükosiide jne.

Teine suund on isoleeritud kudede kultuuri kasutamine taimede kloonseks paljundamiseks ja istutusmaterjali täiustamiseks.

Kolmas suund on isoleeritud rakkude kasutamine sordiaretuses. Tehissöötmel kasvatatud taimerakke iseloomustab suur heterogeensus; sel juhul on võimalik selekteerida rakke, mis on vastupidavad teatud ebasoodsatele teguritele – põud, madal temperatuur, fütopatogeenid jne.

Taimerakukultuure kasutatakse keemiliste ühendite biotransformatsiooniks ja bioloogiliselt aktiivsete ühendite tõhusaks sünteesiks de novo. Rakukultuuris säilib võime toota algsele tervikule iseloomulikke bioloogiliselt aktiivseid ühendeid, mis võimaldab korraldada tingimused, mis tagavad väärtuslike saaduste sünteesi, mida algsetes tervetes taimedes varem ei leitud. Näiteks taimerakukultuurides avanes võimalik saada selliseid väärtuslikke ühendeid nagu peritsiin, pericaliin, hinokiool, ferriginool, akvammaliin jne.

Rakendatud suuremahulisi taimerakkude kultiveerimissüsteeme, et saada erinevaid väärtuslikke aineid- mentool, ženšenn, ubikinoon-10, betaniin, kamptotetsiin (antikantserogeen), polüpeptiidid - fütoviiruste inhibiitorid, agar-agar jne kg preparaati), saadakse praegu suurema efektiivsusega rakukultuuris.

Immobiliseeritud taimerakke kasutavad protsessid osutusid veelgi tõhusamaks. Sellised bioloogilised süsteemid on mehaaniliste kahjustuste suhtes vastupidavamad, samas kui rakkude kasvufaas langeb kokku produkti moodustumise faasiga; rakud on kergesti ülekantavad uude keskkonda või muudesse kultiveerimistingimustesse. Pärast apikaalse meristeemi (väike diferentseerumata rakkude ala varre otsas) võime tuvastamist kasvada, moodustades terve taime, on seda tehnikat kasutatud taimeliinide kloonimiseks.

Taimekoekultuur võimaldab sarnaselt rakukultuuriga kiiresti saada terveid taimekloone ja selle põhjal peaaegu piiramatus mahus perspektiivset istutusmaterjali.

Putukarakukultuurid võimaldavad hankida uut tüüpi bioloogilisi aineid kahjurite tõrjeks ilma negatiivne mõju elujõulisuse kohta kasulikud liigid putukad, aga ka need, mis keskkonda ei kogune. Bioloogiliste kahjuritõrjemeetodite eelised on teada juba ammu, need on bakteri-, seene- ja viiruspreparaadid, mille valmistamiseks on vaja spetsiaalseid seadmeid ja tingimusi. See kehtib eriti viirusrühma ravimite kohta, mille tootmine põhineb peremeesputuka massilisel paljunemisel tehiskeskkonnas. Nende valmistamise töömahukuse tõttu ei ole neid preparaate kuni viimase ajani laialdaselt kasutatud.

Putukarakukultuuride kasutamine võib selle probleemi täielikult lahendada. Viiruste paljundamiseks mõeldud putukarakukultuuride tehnika on väga paljutõotav. Selleks on vaja hankida kõrge tootlikkusega rakuliine, optimeerida toitekeskkonda ja valida tõhusad viirus-rakusüsteemid. Seda tehnoloogiat kasutatakse Ameerika Ühendriikides ravimi "Elkar" tootmiseks. Väga edukad arendused kodeerivaid geene sisaldavate rekombinantsete bakuloviiruste osas veevahetus putukad. Pärast sellise ravimi kasutamist surevad putukad 5 päeva jooksul dehüdratsioonist või veega üleküllastumisest.

Uued biotehnoloogia meetodid võivad mõjutada viirusravimite hinda. Lisaks saab sünteesimiseks kasutada ka putukarakke, nagu taimerakke ravimid. Alustatud on putukarakkude potentsiaali kasutamise rakendamist VLP vaktsiinide (VLP - virus-like particle - virus-like particles) tootmiseks, mis on mõeldud nakkushaiguste raviks, nt. SARS ja gripp. See meetod võib oluliselt vähendada kulusid ja kõrvaldada traditsioonilise kanamunameetodiga seotud ohutusprobleemid.

Loomade rakukultuure kasutatakse laialdaselt katseobjektidena uute ravimite ohutuse ja efektiivsuse hindamisel. Lisaks sobivad imetajate rakud ravimite sünteesiks, eriti mõned loomsed valgud, mis on geneetiliselt muundatud mikroorganismide abil sünteesimiseks liiga keerulised, aga ka monoklonaalsed antikehad ja vaktsiinid.

Näiteks Sanofi Pasteur (USA) töötab USA tervishoiu- ja inimteenuste ministeeriumi tellimusel välja meetodeid imetajate rakkude kultiveerimiseks, et tõhusalt sünteesida gripivaktsiine. Rakukultuse, eriti tüvirakkude ja tehnoloogiate eriliseks rakendusalaks on teraapia ja rekonstruktiivne kirurgia kahjustatud elundid ja koed.

Nende haiguste loetelu, mille ravi saab võimalikuks tänu rakuteraapia ja siirdamise kasutamisele, täieneb kiiresti. Kõige arenenum on praegu rakutehnoloogiate kasutamine kardioloogias müokardiinfarkti ravis, verevoolu taastamisel isheemilistes organites ja kudedes, südame pumpamisfunktsiooni tõstmisel, samuti düslipideemia ja ateroskleroosi ravis. Neuroloogias on Parkinsoni tõve ja Hagintoni tõve raviks hakatud kasutama siirdamisrakkude tehnoloogiaid.

On näiteid luuüdi tüvirakkude positiivsest kasutamisest põletuste ja sügavate nahahaavade paranemisel, süsteemsete ja lokaalsete luudefektide ravis. Seoses halvasti diferentseerunud vereloomerakkude kasvajavastase toimega ja nende võimega kasvaja kasvu otseselt pärssida, viiakse läbi uuringuid, mille eesmärk on tüvirakkude kliiniline kasutamine onkoloogias.

Uute tehnoloogiate otsimine elundi või süsteemi kadunud funktsiooni taastamiseks on viinud koetehnoloogia (regeneratiivne meditsiin ja organogenees) tekkeni biotehnoloogia ja meditsiini ristumiskohas. Meditsiini tulevik on otseselt seotud rakutehnoloogiate arenguga, mis võimaldavad kahjustatud elundit muutmata "uuendada" selle rakulist koostist. Selline elundi struktuursete ja funktsionaalsete elementide "uuendamine" võimaldab lahendada samu probleeme nagu elundisiirdamine. Samas avardab see tehnoloogia oluliselt siirdamisravi võimalusi, muutes selle kättesaadavaks väga erinevatele patsientide kategooriatele.

Viimaste rekonstrueerimistehnoloogiate väljatöötamise aluseks on funktsioneerivad rakud, mis olenevalt mikrokeskkonnast on võimelised moodustama erinevat tüüpi kudesid.

Nende haiguste loetelu, mille ravis rakutehnoloogiaid juba kasutatakse või lähitulevikus plaanitakse kasutada, kasvab kiiresti. See nimekiri sisaldab ilmselt kõiki haigusi, uimastiravi mis on ebaefektiivsed. Koetehnoloogias kasutatav interdistsiplinaarne lähenemine on suunatud eelkõige uute biokomposiitmaterjalide loomisele, et taastada üksikute kudede või elundite kui terviku kadunud funktsioonid.

Selle lähenemisviisi põhiprintsiibid seisnevad kahjustatud elundisse või koesse implanteerimiseks mõeldud biolagunevatest materjalidest kandjate väljatöötamises ja kasutamises, mida kasutatakse koos doonorrakkude ja/või bioaktiivsete ainetega.

Traditsiooniliste biotehnoloogiliste protsesside revolutsioonilised transformatsioonid on seotud meetodite kasutamisega geenitehnoloogia. Rekombinantne DNA meetod on uusima biotehnoloogia nurgakivi. Rekombinantse DNA loomine tähendab kahe erineva liigi DNA tüki kombineerimist (rekombineerimist).

Geenitehnoloogia abil on välja töötatud ja kasutatud erinevaid sotsiaalselt olulisi tehnoloogiaid ja protsesse:
- uute ravimite ja ohutute vaktsiinide tootmine;
- teatud geneetiliste haiguste ravi;
- biokontrolli ainete loomine põllumajandusele;
- tootlikkuse suurendamine ja tootmiskulude vähendamine;
- mõnede toodete allergeensuse vähendamine;
- parandamine toiteomadused tooted;
- biolagunevate plastide arendamine;
- vee- ja õhusaaste vähendamine;
- toidu riknemise kiiruse aeglustamine;
- viirushaiguste tõrje.

Molekulaarne ehk geneetiline kloonimine – geneetiliselt identsete DNA molekulide loomise protsess – on molekulaarbioloogia alus, biotehnoloogilise uurimistöö fundamentaalne meetod, aga ka biotehnoloogia arendamise ja kommertsialiseerimise alus. Suurem osa biotehnoloogia praktilistest rakendustest, alates ravimite väljatöötamisest kuni transgeensete põllukultuuride loomiseni, põhinevad geneetilistel kloonimismeetoditel.

Molekulaarse kloonimise abil sai võimalikuks: geenide tuvastamine, lokaliseerimine ja kirjeldamine; Geneetiline kaardistamine ja kogu genoomi järjestamine; paralleelide tõmbamine geenide ja nendega seotud tunnuste vahel; märkide avaldumise molekulaarse aluse loomine. Kloonimise ulatus on äärmiselt lai.

Numbri juurde paljutõotavad suunad biotehnoloogia tähendab kultuurtaimede genoomi muutmist saagikuse suurendamiseks ja nende resistentsuse parandamiseks kahjurite ja kahjurite suhtes. ebasoodsad tingimused keskkond. Loomulikult äratab suurimat huvi üheiduleheliste taimede (peamiselt teravilja) transformatsiooni võimalus.

Kõrgemate taimede genoomi transformatsioon viiakse ellu kahel viisil: ballistiline ja kasutades looduslikku geneetilise materjali ülekandesüsteemi - osa Ti-plasmiidist (T-DNA) - Agrobacterium tumefaciens - bakteriaalse vähi või kroonilise sapipõie põhjustaja. kaheidulehelised taimed. Markersüsteemina kasutatakse antibiootikumiresistentsuse geene, aga ka uusi süsteeme - Luxi geene ehk bakteriaalset P-glükuronidaasi geeni, mis põhjustab selektiivsöötme värvumist. Erinevate geenidega modifitseeritud Ti-plasmiidid kantakse taimedesse. Geneetilise informatsiooni edastamine Ti-plasmiidi abil viidi läbi ka üheiduleheliste taimede näitel: kasutati gladioolisibula kudesid, mille külgmised osad olid eemaldatud.

Silindrilised eksplantaadid nakatati Agrobacterium virulentsete tüvedega, mis kandsid opiiini sünteesi kodeerivaid geene sisaldavat Ti-plasmiidi; 24 tunni pärast tekkisid nakatunud taime pinnale kasvajad. Carneli ülikooli (USA) spetsialistid pakkusid välja uue meetodi – tulistada taimerakke geneetilise materjaliga kaetud volframkuulidega. Peremeesrakkude "koorimine" toimub kiirusel üle 1000 km/h miljoni metalligraanuliga, mis on kaetud DNA fragmentide kihiga; meetod osutus universaalseks.

Geenitehnoloogia abil sai võimalikuks saada soola-, herbitsiidi- ja külmakindlaid taimi. Ekspertide sõnul hinnatakse Ameerika Ühendriikides iga-aastast külmakahju 6 miljardile dollarile. Selgus, et kõige aktiivsemad kristallisatsioonikeskused on üksikud bakterid (Pseudomonase, Erwinia esindajad), mis on võimelised 0 °C juures tekitama jää teket; neid nimetati INA-bakteriteks – aktiivseteks veekristallisaatoriteks (Ice-nucleation Active). Nendes bakterites on tuvastatud spetsiifiline membraanivalk, mis põhjustab kristalliseerumist; jää geene on kloonitud ja muudetud.

Keskmise osa eemaldamine põhjustas kristallisatsioonivalgu väljutamise võime kadumise. Selle tulemusena kaotasid modifitseeritud jäägeeniga bakterid -1-5 °C juures võime vett kristalliseerida. Nende geneetiliselt muundatud bakterite istutamine taimedele pungade puhkemise ajal hoiab ära teiste bakterite koloniseerimise, nii et taimed on metsikut tüüpi INA bakterite nakatumise suhtes praktiliselt immuunsed ega karda lühiajalisi külmi.

"Rohelise revolutsiooni" teine ​​laine on keskendunud geneetiliselt muundatud "iseviljastuvate" taimede hankimisele. On kindlaks tehtud, et lämmastikku siduvate sümbiootiliste bakterite genoom sisaldab rühma geene, mis vastutavad sümbioosi eest taimedega ja paiknevad suurtes sümbiootilistes plasmiidides pSym; sõlmede moodustumise protsessi juhivad nod-geenid ja lõpuks vastutavad nitrogenaasi sünteesi eest nif-geenid, st. lämmastiku sidumine.

Praegu investeeritakse USA-s ja teistes riikides suuri rahasummasid lämmastikku siduvate geenidega transgeensete teraviljade tootmise programmi. Kui aga lämmastikku siduvaid geene kantakse üle kõrgemad taimed peale raskuste geneetiline olemus, on ka teisi. Lämmastikku siduvate geenide ja lämmastikku siduvate geenide ning lämmastiku ensüümi toimimiseks vajalike elektronkandjate ja kofaktorite sünteesi eest vastutavate geenide vahelise seose reguleerimist ei ole veel piisavalt uuritud.

Viimaseid tuleb kaitsta hapniku pärssiva toime eest. Samuti tehakse intensiivseid taimegeneetika uuringuid tõhusate peremeestaimede valimiseks, samuti uuritakse mikroorganismide genoomi muutmist, et saada organisme, mis võivad eksisteerida sümbioosis mitte ainult liblikõieliste taimedega (näiteks teravili). Põhiuuringud lämmastikku siduvate geenide ülekandmine kõrgematele taimedele toob ilmselt kaasa paljulubavaid avastusi ja radikaalse muutuse taimede lämmastikuga toitumise praktikas.

Teine, väga oluline suund geenitehnoloogia rakendamisel on kultuurtaimedele resistentsuse andmine lehti söövate putukate nakkustele. Looduslikud taimepatogeenid, nagu bakter Bacillus thuringiensis (Bt), mis sünteesivad lehti söövate putukate vastu tõhusaid toksiine, on muutunud geenide allikaks, mis muudavad taimed nende kahjurite suhtes resistentseks. Bt toksiinide sünteesi juhib üks geen ning olemasolevad meetodid võimaldavad teha tööd, mille eesmärk on parandada olemasolevaid Bt tootjaid ja tooteid.

On teada, et Bt-kristallide sünteesi kontrollivad geenid paiknevad vähesel hulgal olulise molekulmassiga plasmiididel. Bt poolt sünteesitud toksiline valk on kloonitud E. colisse ja B. subtilisesse ning selle ekspressioon on saavutatud isegi vegetatiivse kasvufaasi ajal. On tõendeid liblikatele toksilise valgu kloonimise kohta tubakarakkudes.

Kasvatatud terves tubakataimes tootis iga rakk toksiini. Nii muutub ise toksiini omandanud taim putukate suhtes resistentseks: lehti süües röövik hukkub taimele olulist kahju tekitamata.

Ameerika ettevõtted "Monsanto" ja "Agrocetus" viisid läbi põldkatsed ja lasid välja puuvilla-, sojaubade ja mitmete teiste kultuuride sorte, millel oli kromosoomi sisestatud Bt genoom. Resistentsus röövikutele kandub edasi seemnetele ja järgmistele taimede põlvkondadele. Alustatud on liblikõielistele mürgise Bt-geeniga transgeensete kartulite ja tomatite seemikute tootmist. Loodud on transgeenne putukakindel pappel, mille koerakkudesse on viidud antitrüpsinaasi geen. Ensüüm vähendab valgu omastamist putukate poolt, mis viib populatsiooni vähenemiseni.

Kloonitud herbitsiidiresistentsuse geenid; nende taimedesse kloonimise eesmärk on tagada pestitsiidide kasutamise ohutus põllumajanduses. Kultuurtaimede geenide kloonimine on aga seotud teatud riskidega. Hirmud on seotud võimalusega, et geneetilised vektorid ja transgeensed taimed pääsevad biotehnoloogide kontrolli alt välja. Seetõttu on muret geneetiliselt muundatud taimede umbrohuks muutumise pärast, kuigi "umbrohu" kompleks (omaduste kogum, mis tagab kiire leviku kultuurtaimede kahjuks, vastupidavus ebasoodsatele teguritele, tõhusad seemnete levitamise mehhanismid jne). ei saa vaevalt tekkida ühe või mõne geeni siirdamise tulemusena.

Samal ajal võib ühe geeni poolt kodeeritud herbitsiidiresistentsus põhjustada olulisi probleeme külvikorra praktikas. Seega toimib teatud preparaadi suhtes resistentne taim, mida kasvatatakse teatud piirkonnas, järgmisel aastal, kui sellel põllul saaki vahetatakse, selle herbitsiidi suhtes resistentse umbrohuna. See näeb ette vajaduse põhjalikult testida kõiki geneetiliselt muundatud taimi enne nende põllule viimist.

Uus viis genoomi modifitseerimiseks on antisenss-RNA-de kasutamine, st. teatud valgu sünteesi pärssimine. Täiendava mRNA oligonukleotiidi sisestamine rakku takistab teabe lugemist. Selle tehnoloogia kasutamine võimaldas saada mitmesuguseid konserveeritavaid tomateid kaua aega blokeerides polügalakturonaasi geeni funktsiooni (lagustab rakus süsivesikuid, stimuleerides küpsemist) või vähese kofeiinisisaldusega kohvi tootmist pärssiva geeni sisseviimise tulemusena; need. see on viis eemaldada põllumajandustoodetest ebameeldivad kibedad ja muud ained, tõrjuda viirusnakkusi jne.

Loomade geenitehnoloogia on suunatud kõrge jõudlusomadustega loomade aretamisele.

Geenitehnoloogia meetodid koos loomade kloonimise meetodiga võimaldavad saada ka mudeleid inimeste haiguste, vananemisprotsesside ja pahaloomuliste kasvajate tekke uurimiseks. Tulevikus saab neid tehnikaid kasutada uute ravimite väljatöötamiseks ja selliste ravimeetodite, nagu geeni- ja rakuteraapia, tõhususe hindamiseks. Loomade kloonimine annab võimaluse päästa ka ohustatud liike.

Loomade paljunemise biotehnoloogilised meetodid hõlmavad kunstlikku viljastamist, sünnituse esilekutsumist, siirdamist, isaste ja isaste suhte reguleerimist. naissoost elanikkonnas on see ka raseduse varajane diagnoosimine, hormoonide kasutamine reproduktiivfunktsioonide ja kasvu reguleerimiseks jne.

Embrüonaalne kunstlik eraldamine on rutiinne kloonimise meetod. Meetod võimaldab saada suur hulk väärtuslike tootjate loomade koopiad. Ühemunakaksikutest on võimalik saada suur hulk koopiaid, eraldades blastula või morula staadiumis embrüod osadeks. Need embrüo osad viiakse seamunade tühjadesse koortesse, asetatakse mitmeks päevaks agarisilindritesse, seejärel süstitakse lammaste munajuhadesse.

Tavaliselt arenenud embrüod siirdatakse retsipientlehmadele kirurgiliselt seksuaaltsükli 6.-7. päeval. Poolte ellujäämisprotsent on kuni 75%, veeranditel madalam, umbes 40%. Saadud embrüod siirdatakse surrogaatema emakasse, mis tagab nende tiinuse ja sünni. Kuna embrüod pärinevad samast sügootist, on nad geneetiliselt absoluutselt identsed.

Embrüoga manipuleerimist kasutatakse erinevatelt loomadelt embrüote saamiseks. See lähenemine võimaldab ületada liikidevahelise barjääri ja luua kimäärseid loomi. Nii saadakse näiteks lamba-kitse kimäärid.

Esimesed katsed näitasid looma genoomi transformeerimise võimalust inimese geenidega, USA-s õnnestus saada inimese kasvuhormooni geeni kandvaid sigu. Edinburghi biotehnoloogiakeskusest saadi lambad, kellel on ülekantud inimfaktor 9, mis eritub piima koostises.

Uus meetod - somaatiliste rakkude tuumaülekanne (ehk munarakkude ümberprogrammeerimine) algab somaatilise raku eraldamisega kehast - mis tahes rakk, mis ei osale paljunemisprotsessis (st kõik muud rakud peale sugurakkude - spermatosoidide ja munade) . Imetajatel sisaldab iga somaatiline rakk täielikku topeltkomplekti kromosoome (igas paaris saadakse üks kromosoom ema munarakust, teine ​​isa spermast). Iga suguraku genoom koosneb ainult ühest kromosoomikomplektist.

Lamba Dolly loomiseks viisid teadlased täiskasvanud lambalt saadud somaatilise raku tuuma munarakku, mille tuum oli eelnevalt eemaldatud. Pärast teatud keemilisi manipuleerimisi hakkas tuumaga vahetatud munarakk käituma nagu värskelt viljastatud munarakk. Selle jagunemise tulemusena moodustus embrüo, mis siirdati surrogaatemale ja viidi läbi kogu raseduse ajal. Dolly ilmumine demonstreeris võimalust eemaldada spetsialiseeritud somaatilise raku tuuma geneetiline programm ja see laboris ümber programmeerida, asetades selle muna sisse.

5-6 päeva jooksul areneb munarakust embrüo, mis on doonorloomaga geneetiliselt identne. Sellest embrüost pärit rakke saab kasutada mis tahes tüüpi kudede saamiseks, mida tuuma doonori keha siirdamisel tagasi ei lükka. Seda meetodit saab hästi kasutada rakkude ja kudede kasvatamiseks asendusravi jaoks. Seda loomade kloonimise meetodit kasutatakse praegu väga aktiivselt.

Biotehnoloogiliste meetodite ning diagnostika- ja ravivahendite täiustamine, võimalus luua kiirendatud meetoditega tõhusaid põllumajandusloomade ja kultuurtaimede sorte – kõik see aitab kaasa inimeste elukvaliteedi parandamisele.

Tunnetame biotehnoloogia panust mineraalse tooraine ja energiakandjate ressursside suurendamisse ning keskkonnakaitsesse. Viimasega seoses muutub eriti oluliseks suund, mis on keskendunud keskkonnasõbralike uute materjalide väljatöötamisele. Keskkonnasõbralike materjalide loomine kasulikud omadused on endiselt üks meie aja põhiprobleeme. Praeguseks on looduslikus keskkonnas mittelagunevate sünteetiliste plastide tootmismaht jõudnud 180 miljoni tonnini aastas, mis on tekitanud ülemaailmse keskkonnaprobleemi.

Selle probleemi radikaalseks lahenduseks on polümeeride väljatöötamine, mis on võimelised biolagunema komponentideks, mis on elus ja eluta loodusele kahjutud. Sellega seoses on viimastel aastatel toimunud märkimisväärseid edusamme lagunevate biopolümeeride – kõrgmolekulaarsete polümeersete materjalide – sünteesil, mis võivad looduskeskkonnas laguneda kahjututeks toodeteks (süsinikdioksiid ja vesi).

ON. Voinov, T.G. Volova

Mikroorganismid erinevad üksteisest oluliselt morfoloogia, raku suuruse, seoses hapnikuga, kasvufaktorite nõuetega, võime omastada substraadi erinevaid komponente jne.
Rohkem kui 100 000 teadaolevast mikroorganismiliigist kasutatakse tööstuses suhteliselt vähe – umbes 100 liiki. Need peavad vastama järgmistele nõuetele:
1. Kasvatage odavatel ja saadaolevatel substraatidel;
2. Omama suur kiirus biomassi kasv ja sihttoote kõrge tootlikkus toitainesubstraadi säästliku tarbimisega;
3. Näidake suunatud biosünteesi aktiivsust minimaalse kõrvalsaaduste moodustumisega (joonis 2.1);

Riis. 2.1. Tööstuslikus sünteesis kasutatavad mikroorganismid mitmesugused ühendid
A-A tsetobakter aceti; B - Aspergillus niger; B - Penicillium chrysogenum; G - Lactobacillus delbruecki; E - Levaani tootmine Zymomonas mobilis't sisaldava söötme kääritamise teel

4. olema geneetiliselt homogeenne, stabiilne tootlikkuse ja toitainesubstraadivajaduse, samuti viljelustingimuste poolest;
5. olema resistentne faagide ja muu kõrvalise mikrofloora suhtes;
6. olema kahjutu (ei omada patogeenseid omadusi) inimestele ja keskkonnale;
7. On soovitav, et tootjad oleksid termofiilsed ja atsidofiilsed, kuna sel juhul on fermenteeritud substraati lihtsam kaitsta võõra mikrofloora sissetungi eest;
8. Biosünteesi sihtprodukt peab olema majandusliku ja rahvamajandusliku väärtusega ning kergesti eraldatav kääritatud substraadist.
Anaeroobsed mikroorganismid pakuvad üha suuremat huvi, kuna nende kasvatamisel ei ole vaja energiamahukaid õhutusseadmeid.
ülesüntees, see tähendab, et mikroorganismi võime sünteesida teatud produkti kogustes, mis ületavad tema füsioloogilisi vajadusi, on looduses üsna tavaline. Tihtipeale on mikroorganismide poolt keskkonda sattunud üks või teine ​​ainevahetusprodukt (orgaanilised happed, alkoholid, antibakteriaalsed ained) teistele liikidele mürgine ja toimib tootja eluruumi kaitse vahendina või toitainete tagavarana. Selliste omadustega mikroorganismid tõmbasid esimestena ligi majanduslik tegevus tuhat aastat tagasi ja viidi läbi spontaanne kõige produktiivsemate vormide valik. Nüüd kasutatakse selliseid looduslikke mikroorganismide tüvesid, mõnikord pärast teadlikku selektsiooni, mikroobse biomassi (mikroobse valgu) tootmiseks bakterite kujul. lämmastikväetised, biopestitsiidid, toiduainete tootmises ja teistes rahvamajanduse sektorites. Tööstuslike mikroorganismide põhikontingenti esindavad aga kunstlikult valitud tüved.
Praegu kasutatakse tööstuses kolme tüüpi tüvesid:
1. looduslikud tüved, mida sageli täiustatakse loodusliku või kunstliku valiku abil;
2. indutseeritud mutatsioonide tulemusena muudetud tüved;
3. Geeni- või rakutehnoloogia abil saadud kultuuritüved.
Organismide valiku põhimõtted. Alustades teadlikku mikroorganismide valimist, seadis inimene endale eesmärgiks luua looduslike mikroobide jaoks ebatavaliste omadustega tööstuslikke organisme. Metoodiliselt lahendab inimene selle eesmärgi kahel viisil:
1. Mikroobiraku geneetilise informatsiooni korrigeerimine, välja arvatud tööstuslikuks sünteesiks ebasoovitavad omadused ja vajalike omaduste suurendamine.
2. Täiesti uue informatsiooni esilekutsumine raku geneetilises programmis.
Selleks on vaja lahendada ka järgmised ülesanded:
1. Suurendage oluliselt seda tüüpi mikroobidele ja nende ainevahetusproduktidele omast tootlikkust;
2. Geneetiliselt programmeerida selliste ainete biosüntees, mis on antud liigi jaoks ebatavalised või isegi ebatavalised mikroobimaailma jaoks.
Erinevalt tuhandeaastase ajaloo ja rikkalike kogemustega kultuurtaimede ja koduloomade aretusest algas sihipärane mikroorganismide selektsioon ja selektsioon alles pärast mikromaailma tunnustamist ning arenes paralleelselt geneetika kui teadusdistsipliini saavutustega. .
Mis tahes elusorganismi valides toetub inimene evolutsiooni loomulikele liikumapanevatele jõududele – pärilikele muutustele ja positiivsete isendite valikule. Mikroorganismidel kui valikuobjektil on aga mitmeid omadusi:
1. Mikroobikultuuri kasvatamine ühest rakust, mis on tavaline mikroobide selektsiooni meetod, viib selleni, et aretaja käes on algse selektsioonimaterjalina alati klooni isend (kellel on geneetiline ühtlus). Teisalt jõuab mikroorganismide kloon kiiresti sellise arvuni, et looduslike mutatsioonide tõttu muutub see populatsiooniks – erineva genotüübiga rakkude kogumiks;
2. Enamik mikroorganisme on haploidsed, kromosoomide ühe koopiaga, mistõttu neil puudub varjatud varieeruvus, mis on kõrgemate organismide valiku aluseks;
3. Enamik tööstusliku tähtsusega mikroorganisme ei ole endiselt tuntud hübridiseerumisvõime (sugulise paljunemise) poolest. See tähendab, et rakkude selektsiooni saab läbi viia ainult vegetatiivselt;
4. Mikroorganisme iseloomustab erakordselt kiire põlvkondade vahetus, mistõttu on mikrobioloogist aretajal palju rohkem võimalusi positiivsete isendite selekteerimiseks. Valitud mikroorganismi hindamine võib toimuda mõne päeva jooksul pärast kasvatamist, erinevalt makroorganismidest, kus töö tulemused on nähtavad mitme aasta pärast;
5. Mikroorganismide kasvatajal on selekteerimiseks tohutult palju isendeid, mis avardab põhimõtteliselt tema võimalusi, kuid iga klooni produktiivsuse hindamine nõuab aeganõudvat tööd.
Valitava kultuuri saab valida kogusse kogutud kultuuride hulgast (muuseumikultuurid); saab kasutada tuntud tööstustootjaid; mikroobe on võimalik eraldada looduslikest substraatidest.

Ideed mikroorganismide biokeemia ja füsioloogia kohta suunavad aretaja teatud kõige tõenäolisema potentsiaaliga mikroorganismide rühmadele. ülesüntees huvipakkuv aine. Antibiootikumide tootjaid leidub peamiselt seente ascomycetes ja actinomycetes hulgas, aminohapete ülesüntees on kergemini saavutatav korünebakterites, rakuväliseid ensüüme sünteesivad sageli pärmseened. Mikroorganismide valiku põhietapid on näidatud joonisel 2.2.

Riis. 2.2. Mikroorganismide valiku skeem

Tabel 2.1. Rakutehnoloogia meetodite rühmad

Kaugelt suguluses olevate hübriidide loomise meetodid

Rakutehnoloogiad taimekasvatuses . Teraviljade genofondi rikastamist on võimalik saavutada tohutul hulgal geneetilised ressursid nende metsikud sugulased. Leitud teraviljaliigid, millel on kõrge vastupidavus:

• haigused ja kahjurid,
• temperatuur ja vee stress,
• muldade soolsus ja kõrge happesus.

Aretustöös kasutatakse liikidevahelise (või isegi geneeriliste) kokkusobimatuse ületamiseks meetodeid:

• in vitro viljastamine,
• idukultuur,
• tagasiristid ja muud kaasaegsed tehnikad (Feldman ja Sears, 1984).

Taimede geenitehnoloogia loob täiesti uue geneetilise varieeruvuse mehhanismi - transgenees, mida erinevalt varem eksisteerivatest (rekombiogenees, mutagenees) iseloomustab üksikute geenide ülekandmise võimalus. See funktsioon muudab aga meetodite rakendamise keeruliseks geenitehnoloogia parandada mitmeid majanduslikult väärtuslikke polügeenselt päritud tunnuseid. Siiski on juba saadud kimäärseid taimi, mis kannavad resistentsuse geene haiguste, putukate, herbitsiidide jms suhtes (Kilchevsky ja Khotyleva, 1997).

kauge hübridisatsioon teraviljakasvatus koos looduslike sugulastega on suunatud üksikute geenide või väikeste kromosoomifragmentide ülekandmisele metsikult kasvavatelt liikidelt kultiveeritud liikide genoomi. Kuid selleks peate ületama kokkusobimatuse barjäär- kromosoomide konjugatsiooni puudumine meioosi korral. Nisu kromosoomil 5B leiti geene, mis mõjutavad kromosoomide konjugatsiooni ja seega avanes võimalus seda protsessi teatud määral kontrollida.

Madridi ülikoolis (Hispaania) ja Max Plancki Seltsi Tõuaretuse Instituudis (Köln, Saksamaa) otsene geeniülekande meetod, mis võimaldab saada transgeenseid taimi suhteliselt lihtsal viisil in vivo, välistades vajaduse taimede regenereerimiseks rakulistest. Enim uuritud bakterid on Azospirillum (Postgate, 1989). India erinevates osariikides tehtud katsete seerias suurendas nisu-, riisi-, sorgo- ja hirsiseemnete külvamine risosfääri lämmastikufiksaatoritega teravilja saagikust kuni 30% (Subba Rao, 1982.

Praegu on laiemat praktilist rakendust leidnud veel üks oluline kaasaegse biotehnoloogia valdkond - rakkude valik kui meetodit uute taimevormide loomiseks mutantsete rakkude ja somaklonaalsete variatsioonide isoleerimisega valikulistes tingimustes. Rakkude valik on justkui mutatsioonilise selektsiooni arendus, kuid seda rakendatakse üksikute rakkude tasemel, kasutades in vitro tehnoloogiat, mis ühelt poolt annab sellele rohkem võimalusi ja teisest küljest tekitab olulisi raskusi. vajadusele taastada üksikutest rakkudest täisväärtuslikud rakud.taimed.

Eelis rakkude valik enne traditsioonilisi meetodeid koosneb:

• hooajalisuse puudumine tööl,
• võimalus kasutada valikus miljoneid rakke,
• valiku suund selektiivse kandja kasutamise kaudu,
• tööde sooritamine laboritingimustes

In vitro kultuuri arenguga on ilmnenud reaalne võimalus haploidsust laiemalt kasutada põllukultuuride valikul. Rakukultuuri meetodi kasutamine võimaldas regenereerida taimi sisaldavatest generatiivsetest rakkudest haploidne komplekt kromosoomid. Võimalikuks sai haploidide masstootmine. Praktiline väärtus aretuses praegu saadud kultuuri tolmukad (androgenees), munasarjad ja munarakud (günogenees) ja haploprodutseerimismeetod, mis on teatud tüüpi günogenees

Loengu kava

Teema 5.6. Põllumajanduse ravim. Üherakuliste mikroorganismide valk

MIKROOBSE BIOMASSI SAAMINE

MOODUL 2.

Loengu vorm: ajurünnak

1 Biotehnoloogia ja taimekasvatus.

2 Biotehnoloogia ja loomakasvatus.

3 Tehnoloogiline bioenergia.

4 Söödavalgu tootmine.

5 Pärmi ja bakterite kasutamine.

6 Vetikate ja mikroskoopiliste seente kasutamine.

Probleem lahendada: biotehnoloogia kasutusvaldkonnad põllumajanduses.

Õpilased pakuvad selle probleemi lahendamiseks ideid. Seejärel analüüsitakse ideid õpetaja abi ja nõuannete abil eksperimentide rühmas. Ajurünnaku reegel on see, et igasuguseid ideid väljendatakse kuni kõige absurdsemateni, ideede kritiseerimine rünnaku ajal on keelatud. Koolitaja paneb kõik ideed kirja ja osalejad vaatavad need üle. Selline loeng aktiveerib õpilaste vaimset tegevust, arendab heuristlikke võimeid.

Kultuurtaimed kannatavad umbrohtude, näriliste, putukakahjurite, nematoodide, fütopatogeensete seente, bakterite, viiruste, ebasoodsate ilmastiku- ja kliimatingimuste tõttu. Need tegurid koos pinnase erosiooni ja rahega vähendavad oluliselt põllumajandustaimede saaki. Kartulitootmises põhjustavad tohutut kahju Colorado kartulimardikas, aga ka seen. Phytophtora- kartuli varase mädaniku (hilise lehemädaniku) põhjustaja.

Mais on allutatud laastavatele lõunapoolsete lehemädaniku "rünnakutele", mille kahju USA-s 1970. aastal hinnati 1 miljardile dollarile.

Viimastel aastatel suurt tähelepanu antakse taimede viirushaigusele. Koos kultuurtaimedele nähtavaid jälgi jätvate haigustega (tubaka ja puuvilla mosaiiktõbi, tomatite talvine haigus) põhjustavad viirused varjatud nakkusprotsesse, mis vähendavad oluliselt põllukultuuride saaki ja põhjustavad nende degeneratsiooni.

Biotehnoloogilised viisid taimede kaitsmiseks kahjulike mõjurite eest on järgmised:

Ebasoodsate tegurite suhtes vastupidavate taimesortide aretamine;

Kemikaalid tõrje (pestitsiidid), umbrohud (herbitsiidid), närilised (ratitsiidid), putukad (insektitsiidid), nematoodid (nematotsiidid), fütopatogeensed seened (fungitsiidid), bakterid, viirused .;

Koos taimede kaitsega on ülesandeks tõsta põllukultuuride tootlikkust, nende toite- (sööda)väärtust, taimesortide loomist, mis kasvavad soolastel muldadel, kuivadel ja soistel aladel. Arendused on suunatud erinevate protsesside energiatõhususe tõstmisele taimekudedes alates valguskvandi neeldumisest kuni CO 2 assimilatsioonini ja vee-soola ainevahetuseni.

Enamik biomeditsiinilisi uuringuid tehakse rakkudega in vitro(st mitte elusorganismil, vaid rakkudel "in vitro"). Rakke kasutatakse bioloogilise mudelobjektina teadusuuringutes, testimises ja ravimite tootmises. Lisaks on teadlased õppinud parandama rakkude geneetilisi vigu ja andma neile vastupanuvõime teatud haigustele, mis on tulevaste meditsiinitehnoloogiate – geeni- ja rakuteraapiate – aluseks. See artikkel räägib rakkudega töötamise meetoditest, samuti nende kasutamise võimalustest ja piirangutest.

Tsükli peapartneriks on ettevõte: suurim seadmete, reaktiivide ja Varud bioloogiliste uuringute ja tootmise jaoks.

Selle artikli partner -

Elusobjekt koosneb väiksematest komponentidest: elunditest, kudedest, rakkudest, organellidest, biomolekulidest ning on samal ajal osa suurematest süsteemidest nagu toiduahelad, ökosüsteemid, kooslused. Isegi Hippokrates ja Aristoteles imestasid terviku ja selle osade vahekorra üle ning nõustusid, et tervik on midagi enamat kui osade summa. Kuid kaasaegne teadus toetub peaaegu täielikult alternatiivsele printsiibile - reduktsionismile -, mille kohaselt terviku tundmine toimub selle koostisosade tundmise kaudu. Selle lähenemisviisiga kaovad osadevahelised ühendused, meie puhul rakkudevahelised. Kuigi iga rakk on tegelikult ka tervik, kuid väljaspool keha pole see enam päris sama rakk, mis oli tema koostises. Mis selle üleminekuga muutub?

Selgeks illustratsiooniks on limavormid. Nendel üherakulistel organismidel on võime ühineda kümnetest tuhandetest rakkudest plasmoodium, mis võib toitu otsides kiiresti liikuda ja eoseid pikale kaugusele paisata ning seejärel jälle üksikuteks rakkudeks laguneda (video 1). Paljudel bakteritel on ka võime moodustada tihedaid konglomeraate – biokilesid ehk biokilesid, milles sisemised rakud on väliste poolt keskkonna eest kaitstud. See tähendab, et integreerumine mitmerakulistesse struktuuridesse toob kaasa uute funktsioonide tekkimise, mis üksikutes rakkudes puuduvad. Uute võimete omandamisest tulenevad konkurentsieelised olid umbes 1 miljard aastat tagasi põhjuseks, miks üherakulised organismid ühinesid paljurakulisteks organismideks.

1. video. Dictyostelium discoideum- üherakuline limahallitus. Kui limahallitused toitu otsivad, ühinevad üksikud rakud ja moodustavad kuni 2 mm pikkuse plasmoodiumi.

Mitmerakulistes organismides eksisteerivad rakud üksteisega tihedas ühenduses sadu miljoneid aastaid kestnud evolutsiooni vältel ja selle aja jooksul on nad teatud funktsioonide täitmiseks täielikult reorganiseerunud. Raku väljendatud geenide ulatust, selle funktsioone ja aktiivsust, kuju ja suurust, jagunemiskiirust ja surma reguleerivad ühendused teiste keharakkudega. Imetajatel põhineb see seos erinevatel signaalidel: keemilistel (hormoonid, tsütokiinid, kasvufaktorid, toitained, hapniku derivaadid, metalliioonid jne), mehaanilistel ja elektrilistel (edastatakse neuronite poolt) (joonis 4).

Joonis 4. Rakkudevahelise interaktsiooni peamised tüübid. Keha osana on rakud omavahel tihedalt seotud ja nende tegevus on rangelt kooskõlastatud. Selleks kasutatakse elektrilisi signaale ( eespool) edastatakse neuronite, keemiliste signaalide kaudu ( keskel) levivad vere kaudu (endokriinsed) või interstitsiaalvedeliku(parakriin), samuti mehaanilised jõud ( altpoolt). Need ühendused eksisteerivad nii naaberrakkude kui ka keha kõige kaugemate rakkude vahel. Rakk muundab sissetulevad signaalid juhisteks aktiivsete geenide spektri ja sellest tulenevalt ka raku enda omaduste muutmiseks.

Rakkudevaheline kommunikatsioon on peaaegu kõigi meditsiiniteaduste, eriti endokrinoloogia, neuroloogia, kardioloogia, hematoloogia jne uuritud protsesside aluseks, kuid nende interaktsioonide täielikust dekodeerimisest ei saa veel rääkida. Kui organismi rakus on häiritud normaalsed ühendused keskkonnaga, siis see kas sureb (selleks on olemas spetsiaalsed enesehävitamise mehhanismid – apoptoos ja anoikid) või muutub "asotsiaalseks" ehk vähkkasvajaks. Kehast isoleerituna ja Petri tassile ülekandmisel kaotavad rakud ka peaaegu kõik välised ühendused, kuid soodsates tingimustes elavad ja jagunevad mõnda aega (võivad aga muutuda vähiks).

Uues kunstlikud tingimused rakud säilitavad ainult genoomi, samas muutuvad kõik muud omadused – suurus, kasvukiirus, geeniekspressioon, funktsionaalne aktiivsus, ravimitundlikkus, ainevahetus, membraani koostis ja muud. Sellega seoses on täna käimas aktiivne tingimuste otsimine in vitro, mis reprodutseerivad tingimusi maksimaalselt in vivo. Enamik kehakudesid sisaldab mitut tüüpi rakke, neil on keeruline ekstratsellulaarse maatriksi struktuur ning need on läbinud veresoonte ja närvide võrgustiku (joonis 5). Looge selline arhitektuur täielikult uuesti in vitro ei ole veel võimalik, mis tähendab, et kultuuris olevad rakud on endiselt vaid ligikaudsed näitajad keharakkudele.

Joonis 5. Sidekoe kompleksne korraldus in vivo koosneb: mitut tüüpi rakkudest (fibroblastid, rasvarakud, makrofaagid ja muud leukotsüüdid), mitut tüüpi kiud (1 - elastsed, 2 - retikulaarsed ja 3 - kollageen), närvid ja veresooned, mis on suletud polüsahhariidhüdrogeeliga.

Rakkude isoleerimine ja kasvatamine

Rakkude allikaks võib olla mis tahes kehakude. Enamikus kudedes paiknevad rakud sees nö rakuväline maatriks, mis jagab koe piirkondadeks ja moodustab selle arhitektuuri (joonis 5 ja 6). Rakuväline maatriks koosneb fibrille moodustavatest valkudest: kollageenist, fibronektiinist, elastiinist ja pikkade polüsahhariidharudega proteoglükaanidest (glükosaminoglükaanidest). Viimased hoiavad suurepäraselt vedelikku ja moodustavad suuremas osas rakuvälisest ruumist niinimetatud hüdrogeeli. Luu puhul moodustub maatriks kristalliseerunud kaltsiumfosfaadist. Kõige tavalisem inimese valk on kollageen: see moodustab kuni 30% kõigi keha valkude massist. Maatriksi komponente sünteesivad paljud rakud, kuid fibroblastid on sellele spetsialiseerunud.

Joonis 6. Millised koed mikroskoobi all välja näevad? in vivo multifotonmikroskoopia erinevaid saite nahk sisaldab lahtist ( A ) ja tihe ( b ) sidekuded, lihas ( V ) Ja närvikiud (G ), rasvarakud ( d ) ja mikrovesiikulid ( e ). Kollageenikiud on kujutatud punaselt (v.a V ), veresooned on rohelised, rakud ja mikrovesiikulid sinised (sisse b - roheline). Suuruste skaala - 50 mikronit. Pildi täissuuruses vaatamiseks klõpsake sellel.

Rakkude isoleerimiseks on vaja hävitada rakuväline maatriks ja lõhkuda rakkudevahelised sidemed, misjärel rakud “pudenevad” (joonis 7). Rakukultuuri võib saada ka muul viisil: asetades söötmesse terve koetüki ja siis hakkab osa rakkudest järk-järgult välja roomama ja külvama ümbritsevat ruumi. Seda tüüpi kultuuri nimetatakse eksplanteerida. Rakkude eraldamine ja manipuleerimine toimub tavaliselt spetsiaalses steriilses karbis – laminaarvoolukappis (joonis 8). A ).

Joonis 7. Skeem raku koest eraldamiseks. In vivo (biopsia) või pärast surma saadud koefragment purustatakse mehaaniliselt ja töödeldakse proteolüütiliste ensüümidega, mis lõhustavad rakuvälist maatriksit (trüpsiin, kollagenaas, hüaluronidaas, papaiin või nende kombinatsioonid). Lisaks ensüümidele kasutatakse kaltsiumi siduvaid ühendeid (kelaatoreid), mis võtavad kaltsiumi raku adhesioonimolekulidest ning nõrgendavad nende seost omavahel ja rakuvälise maatriksiga. DNaasi lisamine võimaldab vältida rakkude kokkukleepumist viskoosseteks trombideks elektrostaatilise interaktsiooni tõttu kahjustatud rakkudest vabaneva DNA-ga. Pärast seda eraldatakse rakud tsentrifuugimise ja/või filtreerimise teel maatriksi fragmentidest (jääkidest) ja istutatakse kultiveerimiskolbidesse või Petri tassidesse.

Mõnel koel puudub rakuväline maatriks või rakud ei ole sellega seotud, mis lihtsustab oluliselt isoleerimisprotseduuri. See kehtib peamiselt luuüdis paiknevate vererakkude ja nende prekursorite kohta. Nende rakkude pinnamolekulide isoleerimise ja säilitamise lihtsuse tõttu on kõige paremini uuritud nende tüüpide mitmekesisust ja nende moodustumise viise vere tüvirakkudest (hematopoeetiline SC).

Pärast isoleerimist asetatakse rakud toitekeskkonda ja kasvatatakse Petri tassides või kolbides süsinikdioksiidi atmosfääris (5% CO 2 ) ja 100% õhuniiskuse lähedal CO 2 inkubaatorites (joonis 8). b ). Toitekeskkond koosneb füsioloogilised soolad, pH puhvrit, aminohappeid, vitamiine ja glükoosi, samuti valkude kasvu ja toitumisfaktoreid (vt allpool olevat kasti). Söötmele lisatud fenoolpunase indikaator võimaldab pH-d visuaalselt kontrollida ja annab söötmele punase värvuse.

Joonis 8a. Kultuuritöö põhivarustuseks on laminaarvoolukapp. Laminaarne voolukapp tagab ühtlase vertikaalse steriilse õhuvoolu, kaitstes rakukultuuri mikroobse saastumise eest.

Joonis 8b. Kultuuritöö põhitehnika - CO 2 -inkubaator. Süsinikdioksiid CO 2 inkubaatoris võimaldab esiteks tingimusi paremini reprodutseerida in vivo ja teiseks on vaja säilitada söötme pH, milles reeglina kasutatakse vesinikkarbonaadist CO 2 sõltuvat puhversüsteemi. Inkubaatoris hoitakse niiskust 100% lähedal, mis ei lase vedelikul aurustuda ja selle komponente kontsentreerida.

Valkude kasvu ja toitumistegurid

Valgufaktorid on rakukultuuri kõige õhem koht. Nende tegurite levinuim allikas on loomade seerum, tavaliselt vasikate embrüod, harvem hobuste või samast loomast pärit seerum, kus rakud ise. Täielik filtreeritud vadak lisatakse rakkudele, mis on lahjendatud 1–10%. Uurides mistahes ainete mõju rakkudele (kasvufaktorid, proteiinhormoonid, tsütokiinid), loob seerum tugeva fooni, mida tuleb vähendada, kasvatades rakke ilma seerumita (deprivatsioon) 2–72 tundi enne katset. Seerumi kasutamist on peaaegu võimatu standardida ja see on potentsiaalne infektsioonide allikas, mis piirab oluliselt selle kasutamist biomeditsiinitoodete tootmisel. Vadaku alternatiiviks on puhastatud ja rekombinantsetest valkudest valmistatud standardsed valgulisandid.

Kasvatamise ja reprodutseeritavuse probleemid elusrakkudega tehtud katsetes (Diaemi lahendused)

Mõned kultuurid on nende suhtes väga tundlikud välismõjud või keskkonna keemilise koostise kõikumised, millega seoses tekib mitmeid küsimusi:

• Kuidas kasvatamistingimusi tuua in vitro nendega võrreldavatele tingimustele in vivo? Mõned elusorganismides toimuvad protsessid nõuavad rakkude jaoks eritingimuste (mikrokeskkonna) loomist.
• Kuidas korraldada pikaajalist eksperimenti ja läbi viia vaatlust dünaamikas? Rakukultuurid on ideaalne objekt pikaajaliste katsete tegemiseks. Kuid tekib keskkonnahomöostaasi probleem: rakud tarbivad pidevalt toitaineid ja eritavad metaboliite. Kui probleem lahendatakse lihtsalt söötme vahetamisega, ei ole ainete kontsentratsioon söötmes asenduste vahel konstantne. Lisaks tuleb söötme vahetamiseks või mikroskoobi all jälgimiseks regulaarselt inkubaatorist rakukultuuri eemaldada.
• Kuidas kaitsta rakukultuuri bakterite, mükoplasmade ja seentega saastumise eest, mis võib tühistada kõik jõupingutused rakkude eraldamiseks kudedest?
• Kuidas saavutada katse reprodutseeritavus? Rakud on elusobjektid, mille käitumist võivad mõjutada isegi väikesed tegurid: inkubaatori ukse sagedane avamine, erinev aeg kultuuri viibimine väljaspool inkubaatorit, valgustus, kui kultuure vaadeldakse mikroskoobi all – see kõik võib märkimisväärselt mõjutada artefaktide väljanägemist katses. Seega on teiseks ülesandeks saavutada katseparameetrite stabiilsus.

Lahendus:

Vähirakud, isegi kehas, on tavalistest väga erinevad ja kultuuris see erinevus ainult suureneb. Seega on paljudel vähiliinidel suurenenud kromosoomide komplekt (aneuploidsus), mis muudab nad DNA kahjustuste suhtes vastupidavamaks. Lisaks põhjustavad paljusid vähitüüpe viirusnakkused, mis kanduvad edasi rakukultuuridesse, mis välistab nende rakkude kasutamise vaktsiini tootmisel (vt allpool). Sellega seoses on farmakoloogias ja teadusuuringutes suur nõudlus "normaalsete" - mitte vähirakkude - järele.

Just vaktsiinide tootmine oli "normaalsete" rakkude kultuuri saamise peamiseks motiiviks. Selleks Leonard Hayflick (joon. 10 b ) eraldas rakud katkenud materjalist ja avastas, et kultuuris on rakkude jagunemiste arvu piirang, mida nimetatakse Hayflicki piiriks. Inimese rakkude puhul on see piir 50–70 jagunemist ja see on tingitud telomeeride lühenemisest, mis on rakkude vananemise põhimehhanism.

1965. aastal sai Hayflick kopsufibroblastide rea WI-38 (joonis 10 A ), mis on surelik, kuid on välja töötatud ja piisavas koguses külmutatud, et tagada teadusuuringud kogu maailmas tänaseni. Inimpäritolu, viirusnakkuste puudumise ja vähkkasvajate transformatsiooni tõttu on see liin leidnud laialdast rakendust vaktsiinide tootmisel. Nüüd aga kardavad ravimifirmad, et selle liini piiratud ressurss ei võimalda alustatud uuringuid lõpule viia, ning lähevad üle teistele liinidele. Seda liini kasutatakse nüüd laialdaselt vananemise molekulaarsete mehhanismide uurimiseks.

Teatud kompromiss vähi ja normaalse vahel on jäädvustatud rakud: saadud normaalsest koest, nad on omandanud piiramatu arvu jagunemisvõime. Selline üleminek surematusele võib toimuda kas spontaanselt või teatud geenide kunstliku sissetoomise või vähirakkudega sulandumise tulemusena, nagu näiteks hübriid. Rakkudele "surematuse" võivad anda onkogeenid: SV40 viiruse suur T-antigeen, H-Ras, c-myc, E1A. Need geenid põhjustavad sisuliselt rakkude kasvaja transformatsiooni koos kõigi sellest tulenevate puudustega (genoomi ebastabiilsus, füsioloogiliste funktsioonide kadumine jne). Kõige õrnem ja üha laiemalt levinud immortaliseerimismeetod on telomeraasi pöördtranskriptaasi (TERT) geeni viimine rakku, mis viib lõpule telomeeride ehituse ja takistab nende lühenemist jagunemisel (joonis 11). Telomeraasi avastus pälvis 2009. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna.

Kuigi selline transduktsioon on tegelikult ka onkogeenne, võimaldab see paremini säilitada füsioloogilisi funktsioone ja vähem destabiliseerida genoomi, võrreldes transduktsiooniga teiste onkogeenidega. Samuti väärib märkimist, et see meetod ei tööta kõigi rakkude puhul: näiteks ei sobi see T- ja B-rakkudele.

Joonis 11. Kromosoomide otsalõike – telomeere – lühendatakse iga rakujagunemisega, ja kui need on ammendunud, käivitub rakus enesehävitamise mehhanism. Selgroogsete telomeerid koosnevad korduvatest TTAGGG nukleotiidjärjestustest. Iga jagunemisega neid sektsioone lühendatakse, kuid TERT telomeraas annab matriitsina oma üheahelalise DNA, millega ta esmalt sünteesib ühe ahela ja seejärel lõpetab DNA polümeraas teise telomeeri DNA ahela. Seega on telomeraas võimeline säilitama rakkude surematust.

diferentseerunud rakud(mis on omandanud lõpliku spetsialiseerumise) moodustavad enamiku keharakkudest ja praktiliselt ei jagune. Olles kõigi organite ja kudede põhikomponendid ja "tööhobused", on need enamiku ravimite sihtmärgiks, mistõttu on need uurimistöös väga populaarsed. Kultuuris on neid võimalik saada suunatud eristamise teel. pluripotentsed tüvirakud soovitud rakutüüpi (vt allpool), kuid sellel teel on olulisi tehnilisi ja inimrakkude puhul ka eetilisi raskusi.

Kõige tavalisemad diferentseerunud rakkude kultuurid on esmased rakukultuurid- küpsest koest eraldatud rakud, mida ei passida in vitro(joonis 12). Selliste rakkude jagunemiste arv sõltub kriitiliselt kultiveerimistingimustest, kuid harva ületab 5–10 korda. Erandiks on tüvirakud, eellasrakud ja mõned spetsiifilised rakud, näiteks aktiveeritud T- ja B-lümfotsüüdid. Lisaks kipub pikaajalisel kasvatamisel esmane kultuur asenduma fibroblastidega.

Primaarsete rakukultuuridega tehakse palju uuringuid, millel on vähi- ja immortaliseeritud rakkude ees mitmeid eeliseid:

1. Need sobivad rakkudega palju paremini in vivo: neuronid juhivad elektrilisi impulsse, hepatotsüüdid eritavad albumiini, makrofaagid fagotsüteerivad baktereid jne.
2. Kui rääkida loomarakkudest, siis vivaariumi olemasolul on need kergesti kättesaadavad – jääb üle vaid hankida (mis on aga üsna töömahukas). Inimrakkude saadavus määratakse koetüübi järgi: levinud on nabaveeni endoteelirakkude (HUVEC, joonis 12d) ja rasvkoest pärinevate mesenhümaalsete stroomarakkude kultuurid. kõrvalsaadused vastavalt sünnitusabi ja kirurgia.
3. Need kannavad doonori genotüüpi ja seetõttu saab neid kasutada konkreetse patsiendi patoloogiate põhjuste uurimiseks molekulaarsel tasemel.

Inimeste, hiirte, rottide, küülikute ja teiste loomade rakukultuurid kogutakse kogudesse, mida hoitakse vedel lämmastik temperatuuril -196 °C (joon. 13 A ). Kõige täielikum kollektsioon – ATCC USAs – sisaldab üle 4600 eukarüootse rakukultuuri. Moskva Riiklikus Ülikoolis luuakse praegu oma mastaabis ainulaadset Noa laeva elusüsteemide hoidlat, milles on erinevate elusobjektide näidiste hulgas nii looma- kui ka inimese rakke (joon. 13). b ). Mõnel instituudil on ka oma kogud: näiteks IBCh RAS-is on kogumine korraldatud pilvesalvestuse põhimõttel ühise ajakirja ja erinevate laborite vahel jaotatud rakkudega.

Kogudest pärit rakuliine saab osta; need on olemas peaaegu igat tüüpi kasvajate ja tervete kudede jaoks ning neid on üksikasjalikult kirjeldatud. See võimaldab valida konkreetse uuringu jaoks sobivaimad read ja võrrelda tulemusi varem enda või teistes laborites saadud tulemustega.

Diaem: kõik, mida vajate rakukultuuridega töötamiseks

Mobiiltehnoloogia seadmed:

Kultuurplast, söötmed, seerumid, asendajad, lisandid:

Materjali andis partner - firma Diaem

Rakkude kasutamine teadusuuringutes

Rakukultuurid on peamiselt tööriist teaduslikud uuringud. Milliseid funktsioone see tööriist annab ja milleks seda kasutada saab? Kultuuris olevate rakkude jaoks on olemas rikkalik manipuleerimis- ja analüüsimeetodite arsenal: mõned kuuluvad selle eriprojekti 12 meetodi hulka ja paljusid teisi on kirjeldatud eraldi artiklites Biomolekuli kohta. Siinkohal puudutame põgusalt peamisi, kuid enne räägime rakukultuuride kui mudelobjektide ainulaadsetest eelistest.

Erinevalt keharakkudest määrab teadlane kultuuris olevate rakkude jaoks välistingimused täielikult. Kuigi need tingimused ei vasta sageli tingimustele in vivo, reprodutseeritavus ja kontroll võimaldavad seadistada täpseid katseid ja tuvastada rakkude reaktsiooni teatud stiimulitele. Rakusiseste protsesside uurimiseks on see võimalus ainulaadne, kuid me peame meeles pidama, et kui tugevam rakk kultuuris erinevad keharakkudest, seda tõenäolisem on, et ka nende protsesside mehhanismid erinevad.

Rakk ei sisalda mingil juhul biokeemilistes ja struktuuriuuringutes kasutatavat lahjendatud lahust, vaid väga tihedat ja küllastunud mikrokeskkonda ( rahvarohke keskkond) (Joonis 14 ja video 2). Seetõttu erinevad molekulide aktiivsused tehislahuses ja "elus" mõnikord mitme suurusjärgu võrra. Seetõttu on rakk palju adekvaatsem mudel biomolekulide tegevuste ja koostoimete uurimiseks ning potentsiaalsete ravimite mõju analüüsimiseks sihtmolekulidele farmakoloogias.

Video 2. Erinevate intratsellulaarsete struktuuride kolmemõõtmeline rekonstrueerimine lõikes jooniselt 14. allkiri

Kollane - endoplasmaatiline retikulum, sinine - membraaniga seotud ribosoomid, oranž - vabad ribosoomid, helerohelised niidid- mikrotuubulid, sinised - tihedad südamiku vesiikulid, valged - klatriini negatiivsed vesiikulid, helepunased - klatriini sisaldavad vesiikulid, magenta - klatriini negatiivsed sektsioonid, hele- ja tumerohelise sise- ja välispinnaga õõnsused - mitokondrid. Üksikud molekulid ja väikesed kompleksid ei ole näidatud.

Kuidas geen rakku toimetada?

Kui meile huvipakkuv molekul on valk, siis kõige lihtsam viis selle rakku panemiseks ja uurimiseks on selle valgu geeni rakku viimisega otse “kohapeal” sünteesida. Geenide rakkudesse toimetamiseks on palju meetodeid (joonis 15), mõlemad põhinevad puhtalt füüsikalis-keemilistel põhimõtetel ( transfektsioon) ja kasutades viiruseid kandjana ( transduktsioon).

Tõhusus transfektsioon sõltub oluliselt rakkude tüübist ja tehnikast: vähi- ja immortaliseeritud rakkude puhul on see tavaliselt 30–80%, kuid primaarsete rakkude puhul on see harva üle 10%. Erandiks on elektroporatsiooni meetod, mis võimaldab mõnikord saavutada primaarsetesse kultuuridesse geeni kohaletoimetamise kõrge efektiivsuse. Keemilised meetodid transfektsioonid ei ole mõeldud sisestatud geeni sisestamiseks raku genoomi ja sisestatud DNA läheb aja jooksul kaduma.

Väike osa DNA-st võib siiski transfektsiooni käigus genoomis fikseerida ja pärida, mis võimaldab saada sisestatud geeni stabiilse ekspressiooniga liini. Selekteerimine viiakse läbi, valides sellised rakud antibiootikumiresistentsuse suhtes (koos uuritava geeniga sisestatakse tavaliselt sellist resistentsust tagav geen) või kasutades mitut rakkude sorteerimise tsüklit.

Joonis 15. Transfektsioon ja transduktsioonimeetodid. Geeni sisestamiseks rakku on vaja ületada välismembraan. Enamasti kasutatakse selleks DNA nanosuuruses komplekse lipiidvesiikulite (lipofektsioon), polümeerkandjate või kaltsiumikristallidega, mis rakk ise imendub. Samuti on võimalik membraani ajutiselt perforeerida kasutades elektrilahendust – elektroporatsiooni. Juhtudel, kui geen on vaja sisestada vaid mõnesse rakku (näiteks üksikute neuronite uurimisel), kasutatakse mikroinjektsiooni meetodit. Transduktsiooni puhul kasutatakse viirusosakesi, millesse paigutatakse enda genoomi osa asemel vajalik geen. Samal ajal säilitavad viirused võime tungida rakkudesse, toimetada geeni efektiivselt tuuma ja osade viiruste puhul integreerida selle raku DNA-sse.

Viiruslikud meetodid transduktsioon neil on transfektsiooni ees mitmeid eeliseid: kõrge efektiivsus võrreldes primaarsete rakuliinidega, võimalus sisestada geen genoomi, rakendatavus in vivo ja viiruste toime selektiivsus teatud tüüpi rakkudele ja kudedele.

Transfektsiooniks luuakse kunstlikud viirusosakesed, mis väliselt näevad välja nagu looduslikud viirused ja tungivad rakku samade mehhanismide kaudu. Kuid sees kannavad nad oma DNA osa asemel geene, mida uurija vajab, ja neil puudub iseseplikatsiooni programm (st sellised osakesed ei ole nakkav). Tänapäeval on laialdaselt kasutusel kümmekond erinevatel viirustel põhinevat geneetiliselt muundatud konstruktsiooni. Viirusosakeste selektiivsuse muutmiseks saab neid täiendavalt modifitseerida määratud pinnamolekulidega.

muuda seda

Nüüd on rakutehnoloogiate võimalused jõudmas uuele tasemele pärast hiljutist läbimurret CRISPR/Cas-9 süsteemil põhinevates genoomi redigeerimismeetodites. Meetod on juba aktiivselt kasutusel ja müügil on komplektid teatud geenide selektiivseks eemaldamiseks rakkudest (geneetiline knockout). CRISPR/Cas-9 eeliseks on lihtsus võrreldes varem kättesaadavate genoomi redigeerimismeetoditega (tsink fingers, TALEN). CRISPR/Cas-9 abil saate geene mitte ainult kustutada ja välja lülitada, vaid ka muuta ja taastada. CRISPR/Cas-9 on praegu paljulubav vahend monogeensete pärilike haiguste ravis.

Olgu valgus

Soovitud geenide rakkudesse viimise suhteline lihtsus avab juurdepääsu tänapäeva molekulaarbioloogia kõige võimsama tööriista – geneetiliselt kodeeritud fluorestseeruvate valkude – rikkalikele võimalustele. Need võimaldavad teil jälgida üksikuid keharakke ja isegi molekule rakkudes, värvida teatud organelle, uurida molekulidevahelisi interaktsioone ja valkude konformatsiooni, mõõta sekundaarsete sõnumitoojate (Ca 2+, H 2 O 2, cAMP, H +, ATP /) kontsentratsioone. ADP, NADH jne.), visualiseerida ja määrata erinevate valkude aktiivsust.

Lisaks on viimase viie aasta jooksul laialt levinud optogeneetika – meetod, mille puhul on geneetiliselt kodeeritud valgustundlike valkude abil võimalik juhtida rakuprotsesse kõrge ajalise ja ruumilise eraldusvõimega, kiirgades sõna otseses mõttes laserit. soovitud ala (joonis 16) .

Joonis 16. Optogeneetilised konstruktsioonid lubada laseri kasutamist antud punkt rakke ja käivitada teatud ajahetkel erinevaid protsesse: 1 - ioonvool läbi membraani ja elektriimpulsid, 2 - geenide aktiivsus, 3 - valkude aktiivsus, 4 - retseptori aktiivsus ja signaalide edastamine rakkudele, 5 - ainete imendumine väljastpoolt, 6 - valkude vastastikmõjud, 7 - intratsellulaarsete vesiikulite liikumine, 8 - valkude süntees ja lagundamine, 9 - mitokondriaalne hingamisahel ja rakusurm, 10 - signaali edastamine teiste vahendajate poolt.

Fluorestseeruvad valgud ja optogeneetika näitavad oma täielikku potentsiaali koos kaasaegsete fluorestsentsmikroskoopia meetoditega. Need meetodid on saavutanud üksikute molekulide tundlikkuse, mille ruumiline lahutusvõime on mitukümmend nanomeetrit ja ajaline lahutusvõime kuni mitukümmend mikrosekundit (joonis 17). Kuigi see ruumiline eraldusvõime on elektronmikroskoopia omast madalam, muudavad ajalise eraldusvõime olemasolu (see tähendab, et see on rakendatav elusrakkudele) ja võime analüüsida mitut molekuli samaaegselt optilise mikroskoopia meetodid ainulaadseks paljude probleemide jaoks.

Joonis 17. Kõrglahutusega optilise mikroskoopia kaasaegsete meetodite ruumiline ja ajaline lahutusvõime. Nimetused: FRET - Forsteri resonantsenergia ülekanne (Forster resonant energy transfer); SPT - üksikute osakeste jälgimine (üksikute osakeste trajektooride mikroskoopia); PALM / STORM - fotoaktivatsiooni lokaliseerimismikroskoopia / stohhastiline optiline rekonstruktsioonmikroskoopia (fotoaktiveeritud lokaliseerimismikroskoopia / stohhastilise optilise rekonstrueerimise mikroskoopia); STED - stimuleeritud emissiooni ammendumine (stimuleeritud emissiooni summutamise mikroskoopia); FCS - fluorescence correlation spectroscopy (fluorescence correlation spectroscopy); TIRF – täielik sisepeegeldus sisemine peegeldus); SIM - struktureeritud valgustusmikroskoopia (struktureeritud valgustuse mikroskoopia); - konfokaalne mikroskoopia (konfokaalne mikroskoopia).

Tippimine ja sorteerimine

Veel üks võimas meetod, mis kehtib ainult rakkude kohta in vitro Ja ex vivo(kohe pärast valimist) on voolutsütomeetria- üheosaline rakkude uuring vedelikuvoolus: rakud läbivad ükshaaval laserkiire ning spetsiaalsed detektorid püüavad kinni laseriga valgustatud rakust fluorestsentsi ja valguse hajumise signaali. Erinevalt mikroskoopiast on see oma olemuselt kvantitatiivne meetod, see tähendab, et see võimaldab teil täpselt mõõta fluorestsentsi intensiivsust ja on kõrge tootlikkusega: töötlemiskiirus ulatub miljoni rakuni minutis. See võimaldab "loendada" heterogeenseid rakupopulatsioone, mis kõik on esmased rakukultuurid. Eelkõige ei ole sellel alternatiivi populatsiooni haruldaste rakkude (nt tüvirakud või antigeenispetsiifilised lümfotsüüdid) tuvastamiseks, loendamiseks ja sorteerimiseks, mida võib olla vaid mõni rakk miljoni kohta. Tsütomeetria on leidnud immunoloogias suurima leviku leukotsüütide alampopulatsioonide analüüsimiseks ilma nende kultuurisse ülekandmiseta. Oluline tsütomeetria tüüp on rakkude sorteerimine voolus, mis võimaldab mitte ainult analüüsida, vaid ka eraldada üksikuid alampopulatsioone heterogeensetest rakusegudest, mille puhtus on üle 99%.

Rakkudest tüvirakkudega organismideni

Enne seda kaalusime traditsioonilisi rakkudega töötamise meetodeid, millest paljud pakuti välja eelmise sajandi teisel poolel. Tol ajal olid need tipptehnoloogiad, mis andsid hiljem olulise panuse biomeditsiiniteaduse ja molekulaarbioloogia arengusse ning on nüüd osa igapäevasest laboripraktikast. Tänapäeval võimaldavad arenenud mobiilsidetehnoloogiad saavutada muljetavaldavaid tulemusi. Teaduslikes ja eriti populaarteaduslikes artiklites kipuvad autorid aga sageli avastuse ulatusega liialdama ning keerukust ja piiranguid eirama. See loob mõnevõrra moonutatud pildi, kus juba täna on kuskil arstid, kes prindivad 3D-printeriga elundeid, päästavad inimesi HIV-st ja pimedast ning suudavad ravida peaaegu iga vähi. Tõepoolest, rakutehnoloogiate edu lubab meil loota, et see saab tulevikus tõepoolest võimalikuks, kuid seni soovitavad juhtivad eksperdid ennustustega mitte kiirustada, kuna keha ja kude on palju keerulisemad kui ainult rakkude koostises olevate rakkude summa. .

Embrüonaalsed tüvirakud

Joonis 20a. Embrüoidkehade moodustumise stimuleerimine riputatud tilkades.

Joonis 20b. Rakkude kasvatamine Maximovi kambris. Selles asetatakse väikesele katteklaasile koetüki või rakkudega tilk. Veetilga ja kapillaarjõudude abil kinnitub väike katteklaas suurele, mis omakorda asetatakse alusele ja suletakse parafiiniga.

Viiteteave Diaemi rakukultuuridega töötamise kohta

Kas soovite rohkem teada saada rakukultuuridega töötamise keerukusest või näha, kuidas rakulabor on korraldatud?

Lisainfo teemal "Rakutehnoloogiad".