Серологична диагностика на сифилис. Анализ на цереброспиналната течност. Фалшиви положителни и фалшиво отрицателни резултати

При извършване на серологично изследване за сифилис използвайте Реакция на Васерманс три антигена и Реакция на Колмер. Степента на положителност на тези реакции се обозначава с броя на плюсовете: + + + + (силно положителни), + + + (положителни), ++ или + (слабо положителни), ± (съмнителни), - (отрицателни). Ако резултатите от реакциите на Васерман и Колмер са рязко положителни, се извършва количествено определяне на реагини (по метода на Boas), което позволява да се прецени ефективността на терапията и помага да се разграничи ранният и късният латентен сифилис. Намаляването на реагиновия титър показва терапевтичната ефективност на лечението, а висок реагинов титър обикновено се открива при пациенти с ранен латентен сифилис.

Поради големия обем на профилактичните прегледи и сложността на извършване на КСО, в момента е широко използван експресен метод за серодиагностика на сифилис, който се използва като тест за подбор. Реакцията се извършва с кръвта на пациента.

За тази цел се използва и VDRL отговор(Лаборатория за изследване на венерически болести). В този случай се вземат кръвен серум и липоиден антиген на пациента. VDRL може да се използва за количествено определяне на циркулиращи антитела (1:2:4:8:16).

В някои случаи могат да се появят серологични реакции фалшив положителен резултат. Фалшиво положителни серореакции се наблюдават при малария, тиф, рецидивираща треска, проказа, бруцелоза, пневмония, скарлатина, със злокачествени тумори, по време на менструация, 2 седмици преди раждането и в рамките на 3 седмици след раждането, след пиене на алкохол, мазни храни, някои лекарства. , при хронични пиогенни процеси, чернодробни заболявания и др. С възрастта на пациентите се увеличава броят на неспецифичните фалшиво положителни резултати, базирани на стандартни серореакции.

По-конкретни реакцииза диагностика на сифилис са имобилизационният тест на Treponema pallidum (TIRT) и имунофлуоресцентната реакция (RIF). С тяхна помощ е възможно да се разграничат фалшиво положителни от истински положителни стандартни серологични реакции; те позволяват да се идентифицират пациенти с късни форми на сифилитична инфекция, които протичат с отрицателни класически реакции. Ролята на RIBT е безценна при разпознаването на фалшиво положителни резултати от серологични реакции при бременни жени, когато е необходимо да се реши дали детето е заразено.

Реакция на имобилизация на Treponema pallidum(RIBT). Материалът за изследването е серумът на пациента. Същността на реакцията е, че в присъствието на имобилизини, тестов серум и активен комплемент настъпва загуба на подвижност на Treponema pallidum. Имобилизините, принадлежащи към имуноглобулините от клас G, се появяват в кръвния серум на пациентите по-късно от други антитела. Следователно, той става положителен по-късно от стандартните серореакции и RIF. Реакцията се оценява, когато до 20% Treponema pallidum е имобилизиран - реакцията се счита за отрицателна; с имобилизация от 21 до 50% от Treponema pallidum - слабо положителен; с обездвижване от 50 до 100% - положителен. RIBT е положителен при пациенти с тропически трепонематози. Понякога реакцията дава фалшиви положителни резултатисъс саркоидоза, еритематоза, туберкулоза, цироза на черния дроб, атеросклероза и др. Процентът на фалшиво положителни резултати е леко повишен при по-възрастните хора. Имунофлуоресцентна реакция (RIF). Принципът се основава на откриването на флуоресцентни антитела, белязани с флуорохром и комбиниращи се със съответните антигени. Полученият комплекс свети добре в синьо-виолетовите лъчи на флуоресцентен микроскоп. Реакцията е силно чувствителна, като същевременно поддържа висока специфичност. Става положителен 3-4 седмици след заразяване със сифилис. Антителата, открити чрез тази реакция, принадлежат към групата на имуноглобулините А.

Реакцията се извършва в няколко модификации: RIF-10, RIF-200, RIF-abc. Първата реакция се счита за по-чувствителна, последните две са по-специфични. Следователно RIF-10 се предписва за ранна диагностика на сифилитична инфекция, RIF-200 се предписва за разпознаване на неспецифични резултати от CSR, както и за диагностициране на други форми на заболяването, включително латентен сифилис. Основните предимства на имунофлуоресцентната реакция с абсорбция с Treponema pallidum са нейната доста висока реактивност, както и бързото й начало.

Антигенът за тази реакция е суспензия от бледа трепонема от заешки тестиси, засегнати от сифилис, фиксирана с ацетон върху предметно стъкло. Може да се използва лиофилизирана Treponema pallidum, суспендирана в изотоничен разтвор на натриев хлорид. Инактивираният серум се инкубира със сорбент (трепонема на Reiter) за абсорбиране на антитела от неспецифична група. По-нататъшният ход на реакцията се провежда по метода RIF.

Реакция на имунна адхезия на Treponema pallidum(RIBBT). Основава се на способността на вирулентни тъканни трепонеми, сенсибилизирани със серум на болен от сифилис, в присъствието на комплемент и еритроцити да се придържат към повърхността на последния. Когато сместа с еритроцитите се центрофугира, прилепналата Treponema pallidum се утаява и изчезва от супернатанта. RIP се използва при диагностицирането на форми на сифилис, когато въз основа на анемнеза, клинични данни и резултати от CSR не е възможно да се потвърди диагнозата на заболяването, когато се диференцират неспецифичните резултати от CSR и по време на последващо наблюдение след края на лечение. По отношение на специфичност и чувствителност RIPBT се доближава до RIBT и RIF.

Реакция на пасивна хемаглутинация(RPGA). Принципът на метода е, че формализирани тонизирани агнешки червени кръвни клетки се комбинират с екстракт от патогенна Treponema pallidum и полученият комплекс се фиксира върху червените кръвни клетки. Това е корпускуларен антиген. Когато взаимодейства с хомоложни антитела, се създава имунен комплекс, който предизвиква аглутинация на червените кръвни клетки.

===================================

Ако сифилисът не се лекува, вътрешните органи на пациента започват да се влошават след няколко години. Човек може да страда десетилетия и смъртта ще бъде болезнена. Анализът за сифилис ви позволява да диагностицирате заболяването своевременно и да предпишете лечение, предимно антибиотична терапия. Колко време ще отнеме лечението зависи от стадия на заболяването и правилното лечение: в началния етап можете да се отървете от болестта за три до четири месеца. Сифилисът не може да се лекува самостоятелно.

Сифилисът се причинява от бактерия, наречена Treponema pallidum. Той може да проникне в тялото дори чрез леки наранявания и въпреки че се предава главно чрез полов контакт, човек може да се зарази и чрез битови предмети. Трябва обаче да знаете, че бактерията умира след половин час при температури над 48 градуса. Ето защо стерилизацията е важна.

Има първичен, вторичен, латентен и третичен стадий на сифилис. Първите признаци на заболяването са язва по кожата, която изчезва след около 5 седмици. След два месеца се появяват признаци на вторичен сифилис под формата на обриви, язви и възли. Едно от тежките усложнения на тази форма е увреждане на бъбреците. Това състояние е придружено от протеинурия - повишено съдържание на протеин в урината (над 2-3 g/l). Обривът обикновено изчезва в рамките на няколко седмици без лечение.

Ако заболяването не се лекува, се развива третичен сифилис. Проявява се след пет години, когато настъпи разрушаването вътрешни органи. Засяга се нервната система сърдечносъдова система, гръбначен мозък и мозък. Бъбреците, черният дроб, стомахът и червата се провалят.

Ситуацията е особено опасна, ако човек е болен с ХИВ. Подобно на сифилиса, ХИВ най-често се предава чрез сексуален контакт и е труден за лечение. В същото време пациентите със сифилис са изложени на риск от заразяване с ХИВ, а пациентите с ХИВ са изложени на риск от заразяване със сифилис. Ако сифилисът е заразен от ХИВ-инфектиран човек, ефективността на лечението зависи от стадия на заболяването: какво по-дълъг човеке болен с ХИВ, толкова по-голям е рискът от развитие на тежки усложнения на сифилис (особено ако заразеният с ХИВ човек не се лекува).

Как се прави анализът?

Ако говорим за това откъде се взема кръв за сифилис, отговорът е: точно както за определяне на ХИВ, материалът се взема от вена. Понякога Вашият лекар може да назначи проба от пръста, но само за неспецифични бързи тестове. Това се дължи на факта, че са разработени много стандарти за венозна кръв: в кръвта, взета от пръста, показателите са различни. Освен това можете да получите по-малко материал за изследване от пръст, отколкото от вена. Ако трябва да вземете проба за изследване на сифилис от пръст, се използват същите лабораторни техники, както при общ кръвен тест.

Ако кръвен тест от убождане на пръста покаже вероятност от Treponema pallidum, трябва да се проведе по-подробно, разширено изследване. В този случай кръвта за сифилис се взема само от вена: само в този случай може да се получи правилен отрицателен или положителен резултат.

Този вид анализ, като цитонамазка, е неефективен в случай на сифилис, както при ХИВ. Намазката не съдържа патогена на всички етапи на заболяването.

Видове изследвания

За определяне на антитела срещу Treponema pallidum в кръвта се използват следните тестове:

• RIF или FTA (имунофлуоресцентна реакция) - определя се реакцията на абсорбция на флуоресцентни антитела.
• RPHA или TPHA (реакция на пасивна хемаглутинация) - тест за сифилис, който открива IgM антителаи IgG.
• ELISA или ELISA - името означава ензимно-свързан имуносорбентен анализ, определя количественото съдържание на IgG и IgM антитела.

Сифилисът може да бъде открит чрез трепонемни и нетрепонемни тестове. Първият тест за сифилис открива антитела в кръвта срещу антигените на Treponema pallidum. Вторият открива антитела срещу тъкани, които бактерията е унищожила.

ELISA е ефективен метод за изследване, който се прави не само за определяне на наличието на инфекция, но и за определяне на стадия на заболяването. В допълнение, ELISA може да отговори на въпроса дали даден човек някога е имал сифилис. Чувствителността на ELISA може да достигне 90%.

ELISA анализът ви позволява да определите антитела срещу Treponema pallidum: имуноглобулини - G, M, A. Тяхната концентрация ви позволява да проследите болестния процес в неговата динамика.

Веднага след заразяването се произвеждат IgA антитела за борба с бактерията, а IgM антитела се произвеждат две седмици по-късно. След месец се появява IgG. Когато започнат да се появяват клиничните симптоми на заболяването, кръвта за сифилис показва достатъчно количество антитела от трите вида.

Изследванията показват, че специфичните за сифилис IgM антитела намаляват драстично след ефективно лечение. Особеността на IgG антителата е, че тестът за сифилис ги открива дори дълго време след лечението и през целия живот на пациента. Следователно положителният резултат от ELISA не винаги означава наличието на причинителя на сифилис. Положителният тест може да определи както етапа на развитие на заболяването, така и факта, че наскоро е проведено ефективно лечение и следователно антителата все още циркулират в кръвта. Отрицателният резултат от ELISA може да означава или липса на заболяване, или ранен стадий.

Реакция на пасивна хемаглутинация

RPGA се отнася до специфични трепонемни методи за идентифициране на патогена трепонема палидум. При извършване на RPHA анализ, по време на реакцията на антитела и червени кръвни клетки, последните се слепват и се утаяват. Колко утаени червени кръвни клетки се образуват по време на RPHA е право пропорционално на количеството антитела срещу трепонема.

Чувствителността на RPGA е много по-ефективна във вторичния и третичния период на сифилис - 99%, докато в първичния надеждността на анализа е 85%.

Спецификата на RPGA позволява да се използва за потвърждаване на диагнозата на други тестове, като RPR или MRP. В същото време RPGA не е толкова чувствителен към етапите на сифилис, колкото ELISA. Следователно RPGA и ELISA трябва да се разглеждат във връзка един с друг. Фалшиво положителен резултат от RPHA е възможен в 2,5% от случаите. Това е възможно поради сходството на имуноглобулините с други антитела, които се освобождават при някои други заболявания, например автоимунни заболявания.

Реакция на Васерман

Набор от серологични реакции (CSR), една от които е известна като реакция на Васерман, е ценен диагностичен метод. Той позволява както да се идентифицира инфекцията, така и да се определи стадият на заболяването. Кръвният тест за сифилис KSR трябва да бъде допълнен със специфични за трепонема методи за анализ (RIBD и ELISA). За извършване на CSR теста се използват антигени, извлечени от сърдечния мускул на едър рогат добитък, които са сходни по своите свойства с антигените на Treponema pallidum.

CSR не е специфичен тест за сифилис: положителен CSR е възможен при пациенти с туберкулоза, малария, автоимунни заболявания, онкология, по време на бременност и други състояния. Задължително е да се направи тест за сифилис по време на бременност, тъй като наличието на това заболяване при бременна жена може да доведе до спонтанен аборт или раждане на дете с вродено заболяване.

Експресният метод е ускорена версия на реакцията на Васерман. При извършване на бърз тест за сифилис се използва и кардиолипиден антиген, който се смесва със серум във вдлъбнатината на специална стъклена плоча.

Колко време отнема завършването на тест често зависи от използваната техника. Обикновено експресният метод отнема около половин час.

Резултатът от реакцията на експресния метод се оценява по същия начин като DFR, с положителни числа от 0 до +4. Чувствителността на експресния метод, въпреки че превъзхожда CSR, може да даде фалшиво положителен резултат поради друго заболяване.

ORS и UMSS са друг вариант на реакцията на Васерман или експресен метод. Съкращението UMSS означава ускорен метод за латентен сифилис. ORS означава селективна реакция към сифилис. При извършване на ORS се използват същите реактиви, както при реакцията на Васерман.

Как да оценим резултата

За да се получат точни данни, кръвта трябва да се изследва за сифилис на празен стомах. Концепцията за гладуване означава, че между храненията трябва да минават поне осем часа. Ако пациентът дойде да вземе теста на празен стомах, но последно е ял преди по-малко от осем часа, той трябва да изчака. Концепцията за празен стомах означава също, че не трябва да пиете никакви напитки, освен негазирана вода преди теста. Тестовете се вземат на празен стомах не само за диагностициране на сифилис: това е общо правило.

Отрицателният тест за сифилис се обозначава със знак „-“. Но отрицателен резултатне винаги означава, че в тялото няма патоген. По-често се получава фалшиво отрицателен резултат при декодиране на бързи тестове въз основа на реакцията на Васерман. Следователно можете да се отпуснете само когато данните от всички тестове дадат отрицателен резултат.

Най-високият рейтинг на доверие сред пациентите със сифилис е резултатът от PCR. Ако PCR е положителен, това означава, че е наистина положителен. Ако декодирането е отрицателно, значи е отрицателно. Но PCR може да покаже положителен резултат дори след успешно лечение, тъй като може да определи наличието както на живи, така и на мъртви бактерии. Други тестове също могат да дадат фалшив резултат след успешно лечение.

Анонимност на лечението

Хората, особено мъжете, рядко изразяват желание да бъдат редовно преглеждани от лекар. Що се отнася до сифилиса, причината за това може да бъде или симптомите на бавно заболяване, което не се проявява, или срам, или нежелание другите да знаят за болестта.

Затова много хора често се съгласяват да преминат анонимно изследване, но искат да получат гаранция, че лечението също ще бъде наистина анонимно. Разбира се, няма проблем да се изследвате за сифилис анонимно. Те възникват, когато пациентът иска да бъде лекуван анонимно. Факт е, че човек е носител на опасна венерическа болест и може да зарази както близки хора, така и непознат. Затова при никакви обстоятелства не трябва да се колебаете и по време на лечението трябва да следвате всички инструкции на лекаря.

Пункция на регионални лимфни възли

Серологична диагностика

• реакция на Васерман (WR),
• седиментни реакции на Кан и Сакс-Витебски (цитохолични),
• реакция върху стъкло (експресен метод),

• реакция на обездвижване на treponema pallidum (реакция на treponema pallidum),
• имунофлуоресцентна реакция (RIF).

Реакция на Васерман (WR)

RV обикновено се диагностицира с два или три антигена. Най-често използваните са високочувствителен кардиолипинов антиген (екстракт от говеждо сърце, обогатен с холестерол и лецитин) и трепонемален антиген (обработена с ултразвук суспензия от анатогенни култивирани трепонеми pallidum). Заедно със серумните реагини на пациента, тези антигени образуват имунен комплекс, способен да адсорбира и свързва комплемента. За визуално определяне на образувания комплекс (реагини + антиген + комплемент) като индикатор се използва хемолитичната система (смес от овчи еритроцити с хемолитичен серум). Ако комплементът е свързан във фаза 1 на реакцията (реагини + антиген + комплемент), хемолиза не настъпва - червените кръвни клетки се утаяват в лесно забележима утайка (PB положителен). Ако във фаза 1 комплементът не е свързан поради липсата на реагини в тестовия серум, той ще бъде използван от хемолитичната система и ще настъпи хемолиза (RT отрицателен). Степента на тежест на хемолизата при стадиране на RV се оценява чрез плюсове: пълна липса на хемолиза ++++ или 4+ (RV е рязко положителен); едва започнала хемолиза +++ или 3+ (RV положителен); значителна хемолиза ++ или 2+ (RV слабо положителен); неясна картина на хемолиза ± (RV е съмнителен); пълна хемолиза - (отрицателна реакция на Васерман).

В допълнение към качествената оценка на PB има количествена оценка с различни серумни разреждания (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титърът на реагин се определя от максималното разреждане, което все още дава рязко положителен (4+) резултат. Количественото стадиране на RV е важно при диагностицирането на някои клинични форми на сифилитична инфекция, както и при проследяване на ефективността на лечението. Понастоящем реакцията на Васерман се извършва с два антигена (кардиолипин и трепонемален щам на Reiter). По правило RV става положителен на 5-6 седмица след инфекцията при 25-60% от пациентите, на 7-8 седмица - при 75-96%, на 9-19 седмица - при 100%, въпреки че при последните годинипонякога по-рано или по-късно. В същото време титърът на реагин постепенно се увеличава и достига максимална стойност (1: 160-1: 320 и повече) в случай на генерализирани обриви (вторичен пресен сифилис). Когато RV е положителен, се поставя диагноза първичен серопозитивен сифилис.
С вторични свежии вторичен рецидивиращ сифилис, RV е положителен при 100% от пациентите, но при изтощени пациенти с отслабен имунитет може да се наблюдава отрицателен резултат. Впоследствие титърът на реагин постепенно намалява и при вторичен рецидивиращ сифилис обикновено не надвишава 1:80-1:120.
За третичен сифилис RV е положителен при 65-70% от пациентите и обикновено се наблюдава нисък реагинов титър (1:20-1:40). При късните форми на сифилис (сифилис на вътрешните органи, нервната система) положителен RV се наблюдава в 50-80% от случаите. Титърът на реагин варира от 1:5 до 1:320.
За латентен сифилисположителен RV се наблюдава при 100% от пациентите. Титърът на реагин е от 1:80 до 1:640, а при късен латентен сифилис от 1:10 до 1:20. Бързото намаляване на титъра на реагин (до пълна негативност) по време на лечението показва ефективността на лечението.

Недостатъци на реакцията на Васерман- недостатъчна чувствителност (в начална фазапървичен сифилис отрицателен). Отрицателен е и при 1/3 от пациентите, ако са били лекувани с антибиотици в миналото, при пациенти с третичен активен сифилис с лезии на кожата и лигавиците, костно-ставния апарат, вътрешните органи, централната нервна система и с късна вродена сифилис.
Липса на специфичност- реакцията на Васерман може да бъде положителна при хора, които не са имали и нямат сифилис. По-специално, фалшиво положителни (неспецифични) резултати от RV се наблюдават при пациенти, които страдат от системен лупус еритематозус, проказа, малария, злокачествени новообразувания, увреждане на черния дроб, обширни инфарктимиокарда и други заболявания, а понякога и напълно здрави хора.
Открива се краткотрайна фалшиво положителна реакция на Васерманпри някои жени преди или след раждане, при злоупотребяващи с наркотици, след анестезия или пиене на алкохол. По правило фалшиво положителният RV е слабо изразен, често с нисък реагинов титър (1:5-1:20), положителен (3+) или слабо положителен (2+). По време на масови серологични изследвания честотата на фалшиво положителни резултати е 0,1-0,15%. За да се преодолее недостатъчната чувствителност, те използват студения тест (реакция на Kolyar) и в същото време се провеждат с други серологични реакции.

Седиментни реакции на Кан и Сакс-Витебски

Реакция на имобилизация на Treponema pallidum (TPI)

Имунофлуоресцентна реакция (RIF)

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA)

Техника за вземане на кръв за серологични тестове

Серологична резистентност

• Вярно(абсолютно, безусловно) - необходимо е да се проведе допълнително антисифилитично лечение, комбинирано с неспецифична терапия за повишаване на имунните сили на организма.
• Относително- след пълно лечение treponema pallidus образува киста или L-форми, които са в тялото в ниско вирулентно състояние и в резултат на това допълнителното лечение не променя показателите на серологичните реакции, особено RIF и RIBT.

Псевдорезистентност- след лечение, въпреки положителните серологични реакции, Treponema pallidum отсъства в организма. В тялото няма антиген, но продължава производството на антитела, които се откриват по време на серологични реакции.
Серологичната резистентност може да се развие поради:

• неадекватно лечение, без да се вземат предвид продължителността и стадия на заболяването;
• недостатъчна доза и по-специално поради неотчитане на телесното тегло на пациентите;
• нарушение на интервала между прилагането на лекарството;
• персистиране на treponema pallidum в организма въпреки пълното специфично лечение, поради резистентността им към пеницилин и други химиотерапевтични лекарства при наличие на скрити, енцистни лезии във вътрешните органи, нервната система, лимфните възли, които са недостъпни за антибактериални лекарства (treponema pallidum често се откриват в белези много години след края на терапията, в лимфните възли понякога е възможно да се открие treponema pallidum 3-5 години след антисифилитична терапия);
• намаляване защитни силипри различни заболяванияи интоксикации (ендокринопатии, алкохолизъм, наркомания и др.);
• общо изтощение (приемане на храна, бедна на витамини, протеини, мазнини).

• съпътстващи неспецифични заболявания на вътрешните органи, заболявания на сърдечно-съдовата система, ревматизъм, дисфункция на ендокринната и нервната система, тежки хронични дерматози, злокачествени новообразувания;
• увреждане на нервната система (тежки наранявания, сътресение, психическа травма);
• бременност; хронична интоксикацияалкохол, никотинови лекарства; инфекциозни заболявания (малария, туберкулоза, вирусен хепатит, дизентерия, обрив, коремна и рецидивираща трескас).

Серологична диагностика на сифилис

Диагнозата на сифилис се основава на клинични и лабораторни данни. Диагнозата сифилис се поставя само след лабораторно потвърждение, т.е. откриване на бледа трепонема в секрет от шанкроид, ерозивни папули при първичен и вторичен сифилис и данни от серологично изследване. Серологичните реакции са изключително ценен метод не само за потвърждаване на диагнозата сифилис, но и за проследяване на динамиката на протичането му под въздействието на лечението и определяне дали заболяването е излекувано.

Стандартните компоненти на комплекса от серологични реакции (CSR) за установяване на сифилитична инфекция понастоящем се допълват от трепонемни реакции: RIBT (реакция на имобилизиране на treponema pallidum), RIF (имунофлуоресцентна реакция). Реакцията на Васерман (RW, PB) се основава на феномена на фиксиране на комплемента. За производството му се използва кардиолипинов антиген, който е холестеролизиран алкохолен екстракт от говежди сърдечен мускул и има сходни антигенни свойства с Treponema pallidum.

Реакция на Васерман.Комплементът се свързва от комплекс (липоиден антиген и реагин на тестовия серум). За индикация на образувания комплекс се използва хемолитична система (овчи червени кръвни клетки и хемолитичен серум).

В допълнение към реакцията на фиксиране на комплемента с кардиолипин и трепонемни антигени, групата KSR включва и реакция върху стъкло (експресен метод). Тежестта на хемолизата по време на RV се обозначава с плюсове:

рязко положителен - 4 +; положителен - 3 +; слабо положителен - 2 + или 1 +; отрицателен - -.

Също така е важно реакцията да се постави чрез количествен метод, т.е. с различни разреждания на серум (1:10; 1:20 и т.н. до 1:320). Големият брой стандартни серологични реакции се обяснява с антигенната мозаечна природа на Treponema pallidum, поради което в кръвта се появява съответното множество антитела (фиксиращи комплемента, аглутинини, преципитини, имобилини, антитела, които причиняват имунна флуоресценция и др.). серум на пациенти. На всеки етап от сифилиса може да преобладават определени антитела и следователно реакциите с някои антигени може вече да са положителни, докато с други все още могат да бъдат отрицателни. В допълнение, относителната специфичност на стандартните серологични реакции налага използването не на една от тях, а на комплекс от реакции, за да се избегнат диагностични грешки. CSR стават положителни в края на 3-та или по време на 4-та седмица след появата на шанкра. Тези реакции са рязко положителни и при значително разреждане на серума при почти всички пациенти с вторично пресни (98-99%), вторично рецидивиращи (100%), третично активни (70-80%) и третично латентни (50-60%) сифилис. CSR обаче не е строго специфичен набор от реакции за сифилис. Те могат да бъдат положителни при пациенти с проказа, туберкулоза, бруцелоза, малария, лупус еритематозус, както и пневмония, чернодробни заболявания, онкологични заболявания, след прием на алкохол, мазни храни, по време на бременност, особено през втората половина, както и през първите 2 седмици. след раждане. С възрастта броят на неспецифичните фалшиво-положителни резултати от DCS се увеличава.

За обоснована диагноза на сифилис, заедно с данните за CSR, клиничните данни, резултатите от изследването за Treponema pallidum при манифестните прояви на първичен и вторичен сифилис, се вземат предвид данни от други серологични реакции - RIBT и RIF.

РЕБРАсе основава на феномена на обездвижване на Treponema pallidum от антитела като имобилизини, присъстващи в кръвния серум на пациенти със сифилис. Като антиген за RIBT се използва суспензия от бледа трепонема, получена от тъкани на сифилитичен орхит на заек. Treponema pallidus, след добавяне на кръвния серум на пациента към тях, спират да се движат, т.е. те са обездвижени. Резултатите от реакцията се оценяват като процент: положителен RIBT се посочва при имобилизация от 51 до 100% Treponema pallidum, слабо положителен - от 31 до 50%, съмнителен - от 21 до 30% и отрицателен - от 0 до 20% . Реакцията протича в условия на анаеробиоза. Имобилизините се появяват в кръвния серум на пациентите по-късно от другите антитела, така че RIBT става положителен по-късно от CSR и RIF. RIBT е най-специфичната от съществуващите реакции към сифилис. Основната му цел е да разпознава фалшиво положителни резултати при извършване на CSR. Това е особено важно за пациенти, при които сифилисът протича латентно без външни прояви, но с увреждане на вътрешните органи или нервната система. RIBT е от особено значение при разпознаването на фалшиво положителни резултати от CSR при бременни жени. Трябва да се помни, че неспецифичните положителни резултати от RIBT са възможни и при пациенти със саркоидоза, лупус еритематозус, туберкулоза, цироза на черния дроб и др. Въпреки това, при тези заболявания RIBT е слабо положителен (от 30 до 50%) и никога не достига 100%). При лечение с антибиотици резултатите от RIBT стават отрицателни. Следователно изследванията с помощта на RIBT се провеждат само след 7 дни, ако са приложени водоразтворими антибиотици, и 25 дни след края на лечението с дълготрайни антибиотици.

РИФ- по-чувствителна реакция, поради което е положителна още в първичния серонегативен период на сифилис при 80% от пациентите. По отношение на специфичността RIF отстъпва на RIBT, което не му позволява да замести RIBT, въпреки че техниката му е много по-проста. Реакцията се провежда в няколко модификации: RIF-10, RIF-200 и RIF-abs. (абсорбиран). RIF-10 е по-чувствителен, докато RIF-200 и RIF-abs. по-точно. Принципът на реакцията е, че специфичен антиген (treponema pallidum) се комбинира с кръвен серум на пациента (антитела) и антивидов флуоресцентен серум (заешки серум срещу човешки глобулини, комбиниран с флуоресцеин, вещество, което свети под ултравиолетова светлина). При положителна реакция може да се види жълто-зелен блясък на бледа трепонема във флуоресцентен микроскоп, тъй като те са заобиколени от флуоресцентни антитела, прилепнали към тях. Степента на луминесценция се оценява с плюсове, както при CSR. Положителната реакция се отбелязва като 4 +, 3 + и 2. +. Ако степента на луминесценция е 1 + и няма луминесценция, реакцията се счита за отрицателна. При вторичен сифилис RIF е положителен в почти 100% от случаите. Винаги е положителен при латентен сифилис (99-100%), а при третични форми и вроден сифилис е положителен в 95-100%.

Експресен метод (микрореакция върху стъкло).При тази реакция, както и при CSR, се използва кардиолипинов антиген, една капка от който се смесва с 2-3 капки от кръвния серум на изследваното лице в ямките на специална стъклена плака. Реакцията протича по механизма на утаяване. Общата продължителност на реакцията е 10-40 минути. Резултатът се оценява от количеството на валежите и размера на люспите; тежестта на реакцията се обозначава с плюсове: 4 +, 3 + и т.н., като DAC. Микрореакцията върху стъкло е по-малко специфична за пациенти със сифилис, отколкото RV, но е малко по-добра по чувствителност. Фалшиво положителни резултати се получават по-често при експресния метод, отколкото при RT метода. Следователно, този метод е одобрен за използване само като селективна реакция по време на масови прегледи на населението, клиничен преглед и преглед на пациенти в клинико-диагностични лаборатории на соматични болници. Окончателната диагноза на сифилис въз основа на този метод е забранена. Само експресният метод не може да се използва при изследване на донори, бременни жени или за наблюдение след лечение на пациенти със сифилис.

За диагностициране на сифилис можете да използвате други методи: ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с реакция на микропреципитация (RPM) или реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA) с RMP (включително чужди аналози на RMP - RPR или VDRL).

При провеждане на клиничен и серологичен контрол след специфично лечение(за да се определи ефективността на терапията), е разрешено количествено изследване на рак на пикочния мехур (изследване на титъра на отговора във времето).

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA,Елиза).Принципът на реакцията е да се комбинира сифилитичен антиген, сорбиран върху повърхността на твърдофазен носител, с антигена на тествания кръвен серум и да се идентифицира специфичен комплекс антиген-антитяло, като се използва анти-видов имунен серум, маркиран с ензим. Чувствителността и специфичността на ELISA са подобни на RIF.

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA).Макромодификацията на тази реакция се нарича TRHA, микромодификацията се нарича MNA-TR, а автоматизираната версия се нарича AMNA-TR.

IgM серология. IN последните десетилетияДинамиката на образуване на антитела в тялото на пациенти със сифилис преди, по време и след лечението е широко проучена. Това се дължи на факта, че при пациенти, които са били напълно лекувани за сифилис, положителните резултати от специфични серологични реакции към сифилис остават дълго време, което усложнява решението за излекуване на пациентите, както и диагностицирането на ранен вроден сифилис . Диференциалната диагноза на рецидив на заболяването и реинфекция също е трудна. При изследване на образуването на антитела в тялото на пациенти със сифилис беше установено, че първите, които се произвеждат след инфекцията, са специфични IgM, които се откриват още на втората седмица след инфекцията и достигат максимална концентрация в кръвта на 6-9 седмици . След 6 месеца след края на терапията при повечето пациенти те не се откриват в кръвта. На четвъртата седмица след инфекцията тялото започва да произвежда специфични IgG. Този вид имуноглобулин се открива в най-голямо количество 1-2 години след заразяването. Трябва да се отбележи, че специфичният IgM престава да се произвежда, когато антигенът изчезне от тялото, а секрецията на IgG продължава от клонове на клетки на паметта. Освен това големите IgM молекули не преминават през плацентата от майката към плода и следователно тяхното присъствие в детето се използва, за да се определи дали детето е заразено с Treponema pallidum. Поради факта, че концентрацията на специфични IgM в кръвта естествено намалява с времето, повишаването на титъра на тези антитела може да служи като допълнителен признак за наличие на рецидив на заболяването или повторна инфекция.

Трепонемни тестове за сифилис. Общо описание.

За надеждно диагностициране на сифилис и идентифициране на антисифилитични антитела в тялото на пациента (в кръвен серум или гръбначно-мозъчна течност), използват специални технологии лабораторни изследвания- така наречените серологични методи.

При провеждане на диагностични тестове за сифилис се използват различни серологични реакции: аглутинация, утаяване, имунофлуоресценция, фиксиране на комплемента, ензимен имуноанализ и др. Всички тези серологични реакции се основават на взаимодействието на антигени и антитела.

Наричат ​​се специфични серологични тестове трепонематъй като тези тестове използват Treponema pallidum или техните антигени, т.е. антигени от трепонемален произход. Целта на трепонемните тестове е да се идентифицират специфични антитела към антигенните структури на причинителя на сифилис, т.е. антитела, насочени специално срещу самите бактерии T. Pallidum, а не срещу телесни тъкани, увредени от трепонема. Специфични анти-трепонемни антитела от клас IgM могат да бъдат открити още в края на втората седмица на заболяването.

7. Фалшиви положителни и фалшиво отрицателни резултати

Положителните RV резултати за сифилис при лица, които не страдат от това заболяване, се наричат ​​фалшиви положителни резултати. Честотата на фалшивите положителни резултати при здрави индивиди е 0,2-0,25%. Ако процентът на неспецифичните фалшиво положителни резултати от RT при здрави хора е много малък, тогава при някои заболявания той може да бъде висок.

Всички неспецифични резултати от серологични реакции могат да бъдат разделени на следните основни групи:

1. Заболявания, причинени от наличието на общи антигени в подобни патогени (спирохети): рецидивираща треска, фрамбезия, бежел, пинта, орална трепонема, лептоспира.

2. Положителни реакции, причинени от промени в липидния метаболизъм и промени в серумните глобулини. Те включват положителни резултати при бременни жени, пациенти с подагра, липидни нарушения в резултат на отравяне с олово, фосфор, след прием на натриев салицилат, дигиталис и др. Тези реакции трябва да включват и положителни реакции при някои инфекциозни заболявания ( петнист тиф, малария, пневмония, проказа, ендокардит, колагеноза, инфаркт на миокарда, мозъчно сътресение, рак, цироза на черния дроб и др.)

3. Технически грешки. Неправилен избор на доза на комплемента, неспазване на условията и сроковете за съхранение на реагентите, изключване на контролни проби от кръвен серум от теста, използване на замърсени епруветки и инструменти.

8. Модификация на реакцията на Васерман

Има модификации на реакцията на Васерман в качествена и количествена версия, на студено, с цереброспинална течност.

Модификация на RV на студеносе оказа по-чувствителен. Особеност на метода за поставяне на реакцията на Васерман в студа са трифазните температурни режими, при които се извършва фиксирането на комплемента. Тази реакция също се извършва с кардиолипин и трепонемни антигени.

В допълнение към качествената оценка на RF, има метод за нейното количествено изявлениес различни разреждания на кръвен серум (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титърът на реагин се определя от максималното разреждане, което все още дава рязко положителен резултат (4+). Количественото стадиране на RV е важно при диагностицирането на някои форми на сифилис и при проследяване на ефективността на терапията.

9. Обхват на приложение

В Русия RSKt е част от набор от стандартни серологични тестове за сифилис (SSR).

Реакцията на Васерман с трепонема и кардиолипинов антиген (RSKt) се използва за

• диагностика на всички форми на сифилис,
• наблюдение на ефективността на лечението,
• прегледи на лица, имали сексуален контакт с болен от сифилис,
• преглед на лица с клинично и анамнестично съмнение за сифилис
• по време на профилактични прегледи за сифилис на пациенти в психиатрични и неврологични болници, донори и бременни жени, включително лица, изпратени за аборт.

Понастоящем, със заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация, се препоръчва да се замени RSCT с по-чувствителни трепонемни методи (ELISA или RPGA).

В чужбина реакцията на Васерман с трепонемален антиген не се използва в клиничната лабораторна практика от дълго време и не е включена в списъка на препоръчаните стандартни тестове Световна организацияЗдравеопазване.

Комплекс от класически серологични реакции (CSR)

KSR- Това комплекс от реакции, използвани за серодиагностика на сифилис като стандартен метод. Този комплекс от реакции включва реакцията на Васерман с кардиолипинов антиген (екстракт от говеждо сърце, обогатен с лецитин и холестерол) и трепонемален антиген (обработена с ултразвук суспензия от апатогенни култивирани трепонеми pallidum), както и реакция на микропреципитация (MPR) с плазма или инактивиран серум, който се поставя с кардиолипинов антиген

CSR стават положителни в средата на първичния период (разделението му на серонегативни и серопозитивни се определя точно от CSR), във вторичния период CSR са положителни при 98-100% от пациентите, а в третичния период - само при 60-70%. Тоест, с увеличаване на продължителността на заболяването позитивността на КСО постепенно намалява.

Предимства на DAC:

1) Евтина, простота и скорост на монтаж. Това е особено вярно за реакцията на микропреципитация: RMP в момента е основният метод за скрининг (селекция);

2) Нетрепонемните тестове са удобни за използване за проследяване на лечението на сифилис.

Недостатъци на DAC:

1) Субективност при оценката на резултатите от реакциите („на око“);

2) Ниска чувствителност при късни форми на сифилис;

3) Липса на специфичност в сравнение с по-модерните тестове. Когато се извършват, често се наблюдават фалшиво положителни реакции (FPR).

LPR може да бъде причинено от кръстосана реактивност между бледа спирохета и други микроби, нарушения на липидния и протеиновия метаболизъм, нестабилност на клетъчните мембрани и образуване на автоантитела. LPRs се наблюдават при остри (малария, инфекциозна мононуклеоза и др.) И хронични (туберкулоза, проказа, хепатит, борелиоза и др.) инфекции, инфаркт на миокарда, цироза на черния дроб, колагенози (особено при SLE), онкопатология, ваксинация, употреба на наркотици, злоупотреба с алкохол и мазни храни. Фалшивите положителни резултати може да са включени DAC последните седмицибременност, след раждане и при някои жени по време на менструация. Фалшиво-отрицателните DSC резултати могат да бъдат свързани с HIV инфекция.

RIT, RIBT - реакция на имобилизация на Treponema pallidum

Тестът за имобилизация на Treponema pallidum (TPI) е класически метод, който се използва за откриване на специфични трепонемни антитела. Реакцията RIBT използва като антиген патогенна Treponema pallidum T. pallidum (щам Nichols), отгледан в тестис на заек. RIBT се основава на загубата на подвижност на жива Treponema pallidum след излагане на антитела от кръвния серум и комплемента на пациента. Резултатите се оценяват с помощта на микроскопия в тъмно поле. Въпреки че тестът RIBT е въведен в клиничната практика като специфичен тест за сифилис, той е трудоемък, технически сложен, отнема време и е скъп за използване.

1. История на метода RIBT

Тестът за имобилизация на Treponema pallidum (TPI) всъщност е първият специфичен тест за диагностициране на сифилис. Тази реакция е представена през 1949 г. от американските изследователи R. W. Nelson и M. M. Mayer и е обсъдена подробно в научни трудове през следващите десетилетия. И преди са правени неуспешни опити за използване на живи трепонеми в тестове. Благодарение на факта, че Нелсън успява да създаде среда, в която трепонемите остават жизнеспособни до 8 дни, неговото изследване е успешно.

2. Принципът на метода RIBT

Методът се основава на феномена на загуба на подвижност от treponema pallidums в присъствието на имобилизиращи антитрепонемни антитела на тествания кръвен серум и комплемент при анаеробни условия. Антигенът е жива патогенна Treponema pallidum, получена от зайци, изкуствено заразени със сифилис.

3. Настройка на теста RIBT

Реакцията включва тест серум, комплемент и антиген. Кръвен серум на субекта се добавя към жива трепонема, получена от тестикуларна тъкан на заек след изкуствена инфекция. Ако в серума има анти-трепонемни антитела-иммобилизини, treponema pallidums спират да се движат (имобилизират). Имобилизин антителата са късни антитрепонемни антитела.

Реакцията се провежда с топлинно инактивирани серуми или с проби от серуми, изсушени върху восъчна хартия (сухи капки). Инактивирането на серума чрез нагряване се извършва в продължение на 30 минути при температура 56°C. Преди вземане на кръв изследваното лице не трябва да приема лекарства, особено пеницилин. Приемът на лекарства се преустановява за срока им възможно забавянев организма.

Като антиген се използват бактерии от щам Nichols, получени от 7-10-дневен сифилитичен орхит (възпаление на тестисите) на зайци. Периодът от момента на задаване на реакцията до записването на нейните резултати продължава 18-20 часа, следователно е необходима среда за оцеляване, за да се поддържа жизнеспособността и добрата подвижност на микроорганизмите.

RIBT използва добавка от морско свинче. За да се получи комплемент, трябва да се вземе кръв при стерилни условия от няколко морски свинчета.

В случай на бактериално замърсяване, комплементът се отхвърля. Консервираният комплемент не може да се използва в реакцията на имобилизация на Treponema pallidum, т.к той е токсичен за микроорганизмите.

Реакцията на имобилизация използва излишък от комплемент. Неговото количество до голяма степен зависи от средата за оцеляване на Treponema pallidum.

РИБТ се поставя в стерилни кутии, предварително облъчени с бактерицидна кварцова лампа за 45-60 минути. Всеки кръвен серум се изследва в две епруветки: опитенИ контрол. Тестовият серум и антигенът се добавят към двете епруветки. необходими количества. Активният комплемент се излива в епруветката и същото количество инактивиран кръвен серум се излива в контролната епруветка. морско свинче. След пълнене, съдържанието на тубите се смесва чрез леко разклащане.

RIBT възниква при анаеробни условия. Епруветки със съставки се поставят в микроанаеростат, от който атмосферният въздух се изсмуква с вакуумна помпа и се изпомпва газова смес от цилиндър (95 части азот и 5 части въглероден диоксид). Микроанаеростатът с епруветки се поставя в термостат (35°С) за 18-20 часа.

Резултатите от RIBT се оценяват след отстраняване на тръбите от термостата и микроанаеростата (т.е. след 18-20 часа експеримент). С помощта на пипета на Пастьор капка от съдържанието на епруветката се нанася върху предметно стъкло, което се покрива с покривно и се изследва в микроскоп с тъмно поле (обектив 40, окуляр 10Х). Изследват се няколко зрителни полета в различни части на препарата, като се брои броят на подвижните и неподвижните бледи трепонеми във всяка. Броенето започва с лекарството от контролата и след това от епруветката.

При установяване на реакция се използват 5 контролни изследвания: с очевидно положителни и отрицателни кръвни серуми, с активен и инактивиран комплемент и среда за оцеляване на Treponema pallidum. Контролен отрицателен кръвен серум се използва за преценка на степента на подвижност на Treponema pallidum в този експеримент. Контролен положителен кръвен серум - за оценка на степента на имобилизираща активност при условията на този експеримент. Извършва се изследване на активен и инактивиран комплемент и среда, за да се определи ефектът им върху подвижността на Treponema pallidum.

Ако в експеримента има липса на комплемент, имобилизиращите антитела не показват правилно своята активност и трепонемите остават подвижни. Следователно след експеримента се определя остатъчният комплемент, за да се прецени дали подвижността на Treponema pallidum в епруветките се дължи на липсата на комплемент. За целта се използва хемолитична система - смес от суспензия от овчи еритроцити и разреден хемолитичен серум, съхранявани в термостат.

Остатъчният комплемент се определя чрез добавяне на необходимия обем хемолитична система към всяка епруветка. Епруветките се поставят в термостат при 37° за 45 минути. В епруветките трябва да настъпи хемолиза на червените кръвни клетки, в контролните епруветки трябва да има забавяне на хемолизата. Липсата на хемолиза в епруветките показва недостатъчно количество комплемент; в тези случаи изследването трябва да се повтори. Повторно изследване на кръвния серум не се извършва само ако се отбележи 100% имобилизация на Treponema pallidum.

4. Отчитане на резултатите от RIBT

Преброяването на имобилизираните трепонеми, които са загубили подвижността си, се извършва под микроскоп по метода на микроскопията в тъмно поле. От изследователя се изисква да има умението да оценява движението на трепонемите. Той трябва да обърне внимание на интензивността на движенията, извършвани от Treponema pallidum. При тази бактерия не винаги е възможно да се наблюдават вълнообразни контракции и флексионни движения, понякога само ротационни. Трябва също така да можете да разграничите активните движения на трепонемите от движението с поток от течност.

За да се оценят резултатите от реакцията, се изчислява процентът на имобилизация на бледа трепонема, т.е. съотношението на подвижните и неподвижните трепонеми в експеримента (с активен комплемент) и контрола (с неактивен комплемент) по формулата:

X = (M – C) × 100/M

където М е броят на подвижните трепонеми в контролата; C е броят на подвижните трепонеми в експеримента; X - % обездвижване. При практическата работа процентът на обездвижване се определя от предварително съставена таблица по горната формула.

Реакцията на имобилизация на Treponema pallidum се оценява като

• положителенпо време на обездвижване 51 - 100% трепонема,
• слабо положителен: 31 - 50% неподвижни трепонеми,
• съмнително: 21 - 30% неподвижни трепонеми,
• отрицателен: 0 - 20% неподвижни трепонеми.

Реакцията на имобилизация на Treponema pallidum става положителна в края на първичния - началото на вторичния период на сифилис (от 7-8 седмица от момента на инфекцията или повече). Въпреки това, RIBT е малко полезен за диагностициране на ранните стадии на сифилис, тъй като антителата, които имобилизират Treponema pallidum и се откриват в реакцията, се появяват само 3-6 седмици след заразяването. Към класа принадлежат антитела-иммобилизини IgG имуноглобулини. Те се появяват в кръвта по-късно от реагините (антикардиолипинови антитела), по-късно от флуоресцеиновите антитела (открити чрез RIF и ELISA) и преципитините (открити при рак на пикочния мехур).

В бъдеще RIBT остава положителен. Има висока чувствителност на реакцията при късните форми на сифилис. В случай на вторичен, късен сифилис, невросифилис, вроден сифилис, положителен резултат от RIBT се регистрира в 95–100% от случаите. При третичен сифилис със специфични лезии на вътрешните органи и нервната система, когато RV често е отрицателен, RIBT дава положителни резултати в 98 - 100% от случаите.

РЕБРА за дълго времее признат за най-специфичния тест за сифилис. Според литературата специфичността на RIBT е 99%, чувствителността варира от 79 до 94%. Според TsNIKVI чувствителността на RIBT (общо за всички етапи на сифилис) е 87,7%.

7. Обхват на приложение на метода

Обхватът на приложение на RIBT постепенно се стеснява поради продължителността на монтажа, високата цена и трудоемкостта. RIBT е доста сложен и скъп анализ, който изисква висококвалифициран персонал и наличие на вивариум. В тази връзка използването на този метод е намаляло значително през последните години. В САЩ този тест в момента се използва само в изследователски лаборатории.

Въз основа на сложността и високата цена на RIF и RIBT има смисъл да се използват за диагностициране на късни и латентни форми на сифилис. RIBT запазва позицията си на „реакционен арбитър” в диференциалната диагноза на ранните латентни форми на сифилис и фалшиво положителни резултати. Тази реакция може да бъде полезна при диагностициране на невросифилис и когато резултатите от други серологични тестове са несъответстващи.

RIBT става положителен много по-късно от RIF и RV. Поради това не се използва за диагностициране на инфекциозни форми на сифилис.

RIBT, подобно на RIF, много бавно се отрицава по време на антисифилитична терапия. В резултат на това не е подходящ за проследяване на напредъка на антисифилитичната терапия.

Фалшиво положителни резултати (FPR) с RIBT са редки и са отбелязани главно при редица трепонематози (фрамбезия, пинта, бежел), които не се срещат в Русия, както и при проказа, саркоидоза, SLE, туберкулоза, цироза на черния дроб. черен дроб и някои други редки заболяваниянесифилитичен характер. С възрастта на пациентите броят на фалшиво положителните резултати от RIBT се увеличава.

RIBT може да бъде фалшиво положителен, ако тестовият серум съдържа трепонемоцидни вещества (например пеницилини, тетрациклини, еритромицин), които причиняват неспецифична имобилизация на Treponema pallidum.Това може да е следствие от приема на пациента трепонемоцидни антибиотици, така че изследването не се провежда за лица, които са получавали антибиотици през последния месец. Кръвта за RIBT може да се изследва не по-рано от 2 седмици след приключване на приема на антибиотици и други антисифилитични лекарства.

9. Модификации на реакцията на имобилизация на Treponema pallidum

В допълнение към микроанаеростатната техника, има меланжен метод на RIBT според N.M. Овчинников. Анаеробните условия при провеждане на реакция се създават чрез поставяне на реакционната смес в меланжер (миксер за левкоцити), двата края на който са затворени с гумен пръстен. Техниката на реакцията на меланж ви позволява да правите без вакуумна помпа, цилиндър със смес от азот и въглероден диоксид или микроанаеростат. Сравнителното изследване върху голям клиничен материал даде резултати, които не отстъпват на класическата анаеростатична техника.

10. Характеристики, предимства и недостатъци на РИБТ

РИБТ е технически сложен и скъп диагностичен метод. Технологията изисква значителни средства за отглеждане на зайци и провеждане на изследвания. Този трудоемък тест в момента се използва главно за научни цели. В повечето чужди страни почти 40 години RIBT практически се използва не за диагностични цели, а само в изследователска работа.

Недостатъци на реакцията:

• RIBT изисква работа с живи патогенни Treponema pallidum от щама Nichols, които остават заразни за хората въпреки адаптирането към зайци
• поставянето на реакцията е сложно, отнема много време и е скъпо
• необходим е вивариум
• за настройка на реакцията, записване на резултатите и поддържане на вивариума е необходим висококвалифициран персонал
• субективност на оценката на резултатите
• липса на автоматизация
• не е възможно да се стандартизира този серологичен метод.
• реакцията не е приложима на фона на продължаваща антисифилитична терапия
• невъзможност за използване за контролиране на лечението. RIBT при пациенти със сифилис може да остане положителен в продължение на много години (и дори за цял живот), въпреки получаването на пълно лечение.
• реакцията може да даде фалшиво положителни резултати при пациенти със злокачествени тумори, диабет, проказа, автоимунни заболявания, пневмония и тежка сърдечно-съдова патология.

Предимствата на RIBT са:

1) Достатъчно висока чувствителност;

2) Висока специфичност.

RIF (имунофлуоресцентна реакция)

Имунофлуоресцентната реакция (RIF) е бърз диагностичен метод за идентифициране на микробни антигени или определяне на антитела. Тестовете, базирани на откриване на флуоресцентен сигнал, се считат за един от най-добрите тестове за сифилис.

1. История на метода

Тестът за флуоресцентни трепонемни антитела (FTA) е разработен за първи път през 1957 г. от Deacon и съавтори (Deacon, Falcone и Harris).

2. Принцип на метода

Методът RIF се основава на факта, че тъканните антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в намазка, обработена с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница

Като антиген в RIF се използва суспензия от жив патогенен блед Treponema щам Nichols от заешки орхит, който се изсушава върху предметно стъкло и се фиксира с ацетон. Кръвният серум на пациента се добавя към Treponema pallidum, изсушава се и се фиксира в стъкло с ацетон.

След промиване лекарството се третира със серум, съдържащ антитела срещу човешки имуноглобулини, белязани с флуоресцеин. Препаратът се промива отново и се изследва под флуоресцентен микроскоп. Ако тестовият серум съдържа анти-трепонемни флуоресцеинови антитела, ще се забележи жълто-зелен блясък на трепонемите.

3. Метод за провеждане на изследване по метода RIF

Антигенът, фиксиран върху предметно стъкло (патогенна Treponema pallidum), се третира с тестовия серум. След промиване лекарството се третира с флуоресцентен серум срещу човешки имуноглобулини, белязани с флуорохром. В този случай полученият флуоресцентен комплекс (античовешки глобулин + флуоресцеин тиоизоцианат) се свързва с човешкия глобулин на повърхността на treponema pallidum, осигурявайки блясъка на treponema pallidum под флуоресцентен микроскоп.

За откриване на комплекси антиген-антитяло се използва луминесцентен серум, представляващ антивидови (античовешки) имуноглобулини, конюгирани с FITC. Наличието на антитела срещу трепонемите в серума се определя от блясъка на трепонемите при изследване под флуоресцентен микроскоп. Тестът се провежда в качествен и полуколичествен вариант.

4. Отчитане на резултатите

Визуализацията на резултатите от RIF се извършва с помощта на флуоресцентен микроскоп. Резултатите се оценяват по степента на луминесценция на трепонемите в препарата. При наличие на антитела се вижда блясък на трепонемите, но ако в серума няма антитела срещу трепонема, тогава трепонемите не се виждат. Степента на луминесценция на изсушена бледа трепонема, фиксирана към стъкло, е посочена в „плюси“ (от „–“ до „++++“). Отрицателен резултат - без блясък или фоново ниво - 1+.

5. През какви периоди на заболяване е по-добре да се използва

Имунофлуоресцентната реакция (RIF) е доста чувствителна на всички етапи на инфекцията, от края на инкубационния период до късния сифилис. Първичният период на сифилис в класическия курс започва 3-4 седмици след заразяването. RIF става положителен в първите дни на първичния период или дори в края на инкубационния период, от 3-та седмица след инфекцията. Резултатите от RIF остават положителни във всички периоди, включително в късните форми.

RIF става положителен малко по-рано от RV. Според някои данни положителният RIF се среща при 80% от пациентите с първичен серонегативен сифилис. Във вторичния период RIF е положителен в почти 100% от случаите. Винаги е положителен при латентен сифилис и дава 95 - 100% положителен резултат при късни форми на заболяването и вроден сифилис.

6. Чувствителност и специфичност

Имунофлуоресцентната реакция (RIF) е група от методи с висока чувствителност и специфичност. RIF е чувствителен във всички стадии на инфекцията, от инкубационния период до късния сифилис. Според СЗО чувствителността на RIF за първичен сифилис е 70-100%, за вторичен и късен сифилис - 96-100%, специфичност - 94-100%. Според TsNIKVI чувствителността на RIF за всички форми на сифилис е 99,1%.

Специфичността на RIF може да се увеличи чрез предварителна обработка на тестовия серум със сорбент - ултразвуков трепонен антиген, който свързва групови антитела (RIF-abs).

7. Обхват на приложение на метода

RIF се прилага:

• като потвърждаваща реакция при ранен, латентен сифилис
• при установяване на ретроспективна диагноза
• за разграничаване на латентни форми на сифилис и фалшиво положителни резултати от теста за сифилис.
• като потвърждаващ тест за невросифилис.

RIF се използва широко като потвърдителен тест, но не е предназначен за рутинна употреба или скрининг, тъй като е технически труден за изпълнение. За извършване на RIF е необходимо наличието на вивариум или получаване на суспензия от патогенна Treponema pallidum, което ограничава възможностите за реакция. През последните години обаче на вътрешния пазар започнаха да се появяват тестови системи, които позволяват провеждането на реакцията при липса на вивариум и собствен лабораторен щам на патогенна Treponema pallidum.

8. Източници и причини за грешки по време на производство, фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати

LPRs са редки, когато се диагностицира RIF (при колагеноза, борелиоза).

RIF все още се смята за един от най-добрите тестове за сифилис, „златният стандарт“ на серодиагностиката. RIF е по-лесен за настройка от RIBT,

Въпреки високата си диагностична стойност, широкото въвеждане на RIF в ежедневната практика е възпрепятствано от необходимостта от използване на жив T. pallidum, високата цена и продължителността на изследването. Създаването на реакция е трудоемко. Освен това оценката на резултатите от RIF е субективна.

Предимства на RIFи RIBT са:

1) Висока чувствителност (особено за RIF);

2) Висока специфичност (особено за RIBT).

Недостатъци на RIFи RIBT:

1) Техническа сложност, висока цена на методите.

2) Субективност на оценката на резултатите, липса на автоматизация;

3) RIF и RIBT при пациенти със сифилис могат да останат положителни в продължение на много години (и дори за цял живот), въпреки получаването на пълно лечение. Следователно тези реакции не могат да се използват за проследяване на лечението.

10. Модификации на метода

На практика няколко модификации на реакцията на имунофлуоресценция се използват и са използвани за серодиагностика на сифилис:

• RIF-абс– най-чувствителният метод за серодиагностика на сифилис, той става положителен по-рано от други реакции (от 3-та седмица от инфекцията);
• РИФ-200(серумът на пациента се разрежда 200 пъти при поставяне на диагнозата) – високоспецифичен метод за серодиагностика на сифилис.
• РИФ-10(10-кратно разреждане на тестовия серум) е по-чувствителен метод от RIF-200.
• РИФ-цизвършва се с алкохол.
• RIF-abs-IgM- ранно откриване на антитрепонемни антитела от клас IgM.

1. Най-разпространената модификация е RIF-абс- реакция на имунофлуоресценция с абсорбция. Преди извършване на реакцията, серумът на пациента се обеднява със смес от непатогенни трепонеми, за да се елиминират кръстосаните реакции. Груповите антитела се отстраняват от тестовия серум с помощта на културни трепонеми, унищожени чрез ултразвук, което значително повишава специфичността на реакцията. Тъй като тестовият серум се използва в разреждане 1:5, RIF-abs е силно чувствителен.

Основните показания за употребата на RIF-abs в клиничната практика са:

• диагностика на латентни и късни форми на сифилис,
• идентифициране на фалшиво положителни резултати от CSR и рак на пикочния мехур, особено при бременни жени и соматични пациенти със съмнение за сифилис,
• за установяване на ретроспективна диагноза на заболяването.

RIF-abs не е много информативен при оценката на резултатите от лечението: при 85% от пациентите, които са получили адекватна антисифилитична терапия, положителните резултати от RIF продължават в продължение на много години.

Тази реакция се нарича "златен стандарт" за серодиагностика на сифилис. Използва се за арбитражни дела, но за надежден резултат е необходима прясна концентрирана суспензия от T. pallidum щам Nichols от седемдневен орхит при заек, която не може да се замразява.

2. В СССР е инсталиран в две модификации - РИФ-10И РИФ-200, т.е. с разреждане на тестовия серум 10 и 200 пъти. RIF-200 - тест серумът се разрежда 200 пъти, за да се намали броят на фалшивите положителни резултати. Това осигурява висока специфичност на реакцията, но нейната чувствителност намалява до известна степен. RIF-10 е по-чувствителен, но по-често дава неспецифични положителни резултати от RIF-200, който е силно специфичен. RIF-10 е по-чувствителен, RIF-200 и RIF-abs са по-специфични.

Чувствителността на RIF-200 и RIF-abs се оценява на 84–99%, а специфичността е 97–99%.

3. РИФ-цизвършва се с алкохол. Реакцията се извършва с помощта на цяла цереброспинална течност за идентифициране на специфични лезии на централната нервна система.

4. Реакция RIF-abs-IgMпредложен за откриване на ранни анти-трепонемни антитела от клас IgM. Тази реакция може да се използва за диагностициране на вроден сифилис, ранни форми на сифилис и диференциална диагноза на случаи на повторна инфекция и серорецидив.

Има 2 известни модификации на тази реакция:

– FTA-ABS-IgM, въз основа на използването във втората фаза на реакцията на анти-IgM конюгат (белязани с флуоресцеин антитела срещу човешки IgM) вместо античовешки флуоресцентен глобулин;

– Руска версия на RIF-abs-IgM, характеризираща се с това, че към тествания кръвен серум се добавя сорбент, който премахва IgG антителата, а RIF-abs се прилага с останалите IgM антитела.

Основни показанияза RIF-abs-IgM тестване са:

– серодиагностика на вроден сифилис при липса на манифестни прояви на вроден сифилис върху кожата и лигавиците на детето;

– диференциална диагноза на повторна инфекция и клинико-серологичен или серологичен рецидив на сифилис, при който RIF-abs-IgM ще бъде отрицателен, а RIF-abs ще бъде положителен;

– оценка на ефективността на терапията за ранно придобит или вроден сифилис: след адекватно лечение RIF-abs-IgM става отрицателен през следващите 3-6 месеца.

Тази реакция може да се използва за откриване на вроден сифилис. Известно е, че големи IgM молекули не могат да преминат през здрава плацента. Следователно, антитела от клас М срещу treponema pallidum могат да се появят в тялото на детето или поради нарушение на бариерната функция на плацентата, или се произвеждат от тялото на дете със сифилис. Антителата от клас IgM се появяват в кръвта на пациент със сифилис още през първите седмици от заболяването и антителата IgG классе появяват по-късно. Отделното определяне на антитела от двата класа се оказва изключително полезно при диагностицирането на вроден сифилис при деца, тъй като наличието на антитела от клас IgM при дете през първия месец от живота ще покаже, че те се образуват от тялото на дете със сифилис , докато откриването само на IgG антитела ще покаже майчиния произход на последните.

Настройка на реакция 19S(IgM)-RIF-absвключва предварително отделяне с помощта на гел филтрация на по-големи 19S IgM молекули от

фракции от по-малки 7S IgG молекули. Допълнително изследване на RIF-abs реакцията на кръвен серум, съдържащ само 19S IgM фракция,

елиминира всички възможни източници на грешки. Но техниката за поставяне на тази реакция е сложна и трудоемка, изисква специално оборудване и специализирано обучение.

Реакция на имунна адхезия (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Тази реакция се основава на използването на феномен, описан от Rieckenberg през 1912 г. RIP се основава на факта, че вирулентната тъканна трепонема, сенсибилизирана от серума на пациент със сифилис, в присъствието на комплемент и еритроцити, се придържа към повърхността на еритроцитите и по време на центрофугирането се отвежда с тях в утайката, изчезвайки от супернатанта.

За установяване на реакцията се използват следните съставки: тест серум, антиген, комплемент, донорни червени кръвни клетки, изотоничен разтвор на натриев хлорид. Като антиген се използва суспензия от щам бледа трепонема Nichols.

Този тест е най-широко проучен във връзка със серодиагностиката на сифилис от местни и чуждестранни автори през 50-60-те години. Доказателствата относно стойността на RIP като диагностичен тест са непоследователни. Реакцията изисква максимална точност, тъй като неточното дозиране на съставките или излишъкът или дефицитът на тестовия материал в препарата водят до ненадеждни резултати.

В Русия обширни изследвания са проведени от L.V. Сазонов, който получи подобни резултати при RIP и RIT, използвайки прясно приготвена суспензия от патогенен pallidum treponema щам Nichols. Въпреки това, използването на нагрят или консервиран с фенол антиген рязко изкривява резултатите от реакцията и прави антигена нестабилен. Препоръчвам този тестза замяна на RIT L.V. Сазонова го смяташе за невъзможно.

ЛИЧЕН ЛЕКАР. Авдеева, използвайки други температурни и времеви режими при производството на антигена, получи различни резултати при изследване на RIP. Според нейните данни чувствителността на тази реакция е по-висока от чувствителността на KCP и RIT, но малко по-ниска от RIF, а специфичността на RIP, RIT и RIF е близка.

Въпреки това, липсата на промишлено производство на антигена за RIP не позволи този тест да бъде по-широко проучен и въведен в практиката.

RPHA реакция на пасивна хемаглутинация

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA)е общ серологичен тест, който е твърдо установен в лабораторната практика. има доста високо ниво на ефективност в изследванията.

1. История на метода RPGA

За първи път използването на RPHA за диагностика на сифилис е докладвано от G. Blumental и W. Bachman (1932). През 1965 г. е предложен тест за индиректна или пасивна хемаглутинация за диагностициране на сифилис. Модифициране на реакцията с помощта на различни антигени е докладвано от Ratlev T. през 1965 - 1967 г. Микромодификацията на RPGA е предложена от Sokh R.M. и съавтори през 1969г. Първата търговска тестова система е разработена от японски учени Tomisava et. ал. през 1969г

2. Принципът на метода RPGA

От приготвена хомогенна суспензия от „заредени” с антигени еритроцити, при добавяне на тест серум, съдържащ антитела, се утаява утайка под формата на люспи. Получената утайка се състои от червени кръвни клетки, „слепени заедно“ с антитела, и се нарича "хемаглутинирам". Суспензия от червени кръвни клетки се приготвя предварително и се доставя като част от диагностичните тест системи.

Процесът на слепване на червени кръвни клетки, които имат антигени на повърхността си, се нарича "хемаглутинация". Свързването става под въздействието на специфични антитела (аглутинини). Реакцията се нарича "пасивен", защото собствените антигени на еритроцитите не реагират, а самите еритроцити изпълняват изключително спомагателна индикаторна функция.

Реакцията на пасивна (индиректна) хемаглутинация е вид реакция на аглутинация, при която за носители на антиген се използват еритроцити (от гръцки háima - кръв), а не други частици. По принцип при реакцията на аглутинация, под въздействието на антитела, микробите или други клетки се слепват и се утаяват - не непременно червените кръвни клетки, но например частици от латекс, бактерии или други корпускулярни частици, носещи антиген.

В реакцията на пасивна хемаглутинация за диагностициране на сифилис като антиген се използват еритроцити от овце или птици, покрити с антигени на Treponema pallidum. Когато се добави серум, съдържащ специфични антитела, червените кръвни клетки се слепват (аглутинация).

Реакцията RPGA се класифицира като имунологичен метод, т.к основава се на специфичното взаимодействие на патогенния антиген на Treponema pallidum с антитяло. Според „теорията на решетката“ аглутинацията е резултат от „кръстосано свързване“ на повърхностни антигенни молекули с молекули на антитела (имуноглобулини).

3. Създаване на реакция на пасивна хемаглутинация

RPHA се поставя в пластмасови таблетки или в епруветки с разреждания на кръвния серум на пациента, към който се добавя еритроцитна диагностика.

Процесът на свързване на антигена с еритроцитите се нарича сенсибилизация, а така полученият изкуствен корпускуларен антиген се нарича сенсибилизирани еритроцити. Диагностиката на червените кръвни клетки се нарича червени кръвни клетки, сенсибилизирани с антиген.

За приготвяне на диагностикума се използват еритроцити от овце или птици (обикновено пиле), първо третирани с формалин и след това с танин, които се сенсибилизират с ултразвуков антиген на патогенна трепонема палидум (щам на Николс) или рекомбинантни протеини на трепонема палидум (TpN15). , TpN17, TpN47). Могат да се използват и овчи еритроцити, сенсибилизирани с ултразвуков антиген на култивирана Treponema pallidum.

Тества се само серум (не използвайте кръвна плазма). Хемолизирани и мътни проби не са подходящи. Несенсибилизираните еритроцити служат като отрицателна контрола (за да се изключи наличието на антиеритроцитни антитела). Във всяка серия от продукции се използват положителни и отрицателни контроли.

Проби от тестовия кръвен серум и тестовите червени кръвни клетки се добавят към ямките (ямките) на имунологичната таблетка. Ако кръвният серум на пациента съдържа специфични анти-трепонемни антитела, тогава, когато тестовият серум се добави към ямката с антигена, възниква образуването на комплекси антиген-антитяло, свързани с повърхността на носителите (еритроцити). Визуално това се проявява чрез залепване на червени кръвни клетки, т.е. хемаглутинация, която се вижда с просто око. Имунните комплекси "антитяло-антиген-еритроцит", които постепенно падат под въздействието на гравитацията, се разпределят по цялата повърхност на дъното на дупката и образуват характерна картина на "обърнат чадър".

В зависимост от количеството антитела, съдържащи се в тестовата проба, изображението на „обърнатия чадър” варира от максимално, заемащо цялата повърхност на дъното на ямката, до малка зона в централната, най-ниска част (с просвет в центъра и образуването на по-интензивен пръстен от утаени червени кръвни клетки по периферията).

Имунни комплекси не се образуват, ако в пробата няма специфични антитела или когато към реакцията се добавят контролни (интактни) червени кръвни клетки. В същото време червените кръвни клетки постепенно се събират в най-ниската точка на дъното на дупката, образувайки фигура под формата на компактно петно ​​или „бутон“, понякога с леко изчистване в центъра.

Ако кръвният серум на човек съдържа антиеритроцитни антитела, тогава във всеки случай ще се образува „чадър“ - както в реакция с тестови еритроцити, така и с контролни еритроцити. В този случай се препоръчва използването на други медицински технологии за идентифициране на специфични антитрепонемни антитела.

Възможен е феноменът на прозон (невъзможност за реакция поради излишък от антитела), който може да бъде елиминиран чрез разреждане на серума.

4. Отчитане на резултатите от реакцията на пасивна хемаглутинация

Резултатите от RPGA се отчитат визуално след 60-120 минути при настройка на микрометода и след 2-4 часа или на следващия ден при настройка на макрометода. При използване на по-големи (ядрени) птичи еритроцити се получава по-ясна картина и резултатите се записват по-рано.

Възможно е да се определи титърът (висок титър RPHA ≥ 1:2 560).

Резултатите от изследването се оценяват по система 4+ (от „–” до „++++”) въз основа на размера на образувания филм. Когато настъпи аглутинация, червените кръвни клетки се намират на повърхността на дупката под формата на "чадър", а ако резултатът е отрицателен, червените кръвни клетки свободно се плъзгат надолу и се натрупват на дъното в центъра на дупката в под формата на „копче“.

Общоприета оценка на резултатите от RPGA:

4+ - положителен RPHA. Аглутинираните червени кръвни клетки под формата на "чадър" равномерно очертават цялата повърхност на дупката;

3+ - положителен RPGA. Червените кръвни клетки покриват цялата повърхност на дупката, но някои от тях се „плъзгат“ към центъра. В този случай се образува забележим пръстен по периферията на утайката;

2+ - слабо положителен RPGA. Червените кръвни клетки образуват филм върху малка част от долната част на дупката, образувайки плътен пръстен от утайка на червените кръвни клетки със забележимо изчистване в центъра;

1+ - неопределен RPHA, червените кръвни клетки образуват рохкава утайка на дъното на ямката с неясни ръбове и лек лумен в центъра;

(–) - отрицателна RPGA, всички червени кръвни клетки лежат на дъното на ямката под формата на компактна утайка („копчета“ или пръстени) на чист заобикалящ фон (без заобикаляща гранулирана утайка).

В чуждестранната практика резултатите от RPGA също се оценяват като реактивни (при образуване на аглутинат), слабо реактивни (ако образуванията са незначителни) и нереактивни (ако не се наблюдава аглутинация).

Резултатите от реакцията могат да се записват автоматично с помощта на специални анализатори. В допълнение към качественото изследване, всички тестови системи осигуряват количествен анализ с определяне на титъра.

5. През какви периоди на заболяването е по-добре да се използва RPHA?

RPHA става положителен в средата на първичния период (7-8 седмици от момента на инфекцията, 3-4 седмици след появата на шанкра) и остава положителен години след лечението.

При много високо ниво на антитела срещу трепонема в тестовия серум (което е най-типично за вторичния сифилис) е възможен фалшиво отрицателен резултат от RPGA (така нареченият феномен на "прозона").

Специфични аглутининови антитела се откриват в кръвта на хора, които са имали сифилис от дълго време, така че RPGA не може да се препоръча за диференциална диагноза на повторна инфекция или определяне на тежестта на инфекциозния процес.

RPGA не се използва за контрол на лечението, т.к може да остане положителен много години след възстановяване. В същото време може да се използва като допълнителен (към рак на пикочния мехур или към RPR) метод за проследяване на ефективността на лечението чрез изследване на динамиката на намаляване на титрите на антителата. Предпоставка за това е използването на същата тест система RPGA, както при първия (преди лечението) преглед на пациента, както и изследването в същата лаборатория.

6. Чувствителност и специфичност на RPGA

RPGA се счита за силно чувствителен и специфичен тест. Тази реакция е ценен диагностичен тест за всички форми на сифилис, но е особено чувствителна при късните форми на заболяването. В зависимост от стадия на заболяването, чувствителността на RPGA варира. При първичен сифилис чувствителността на RPGA е 76% (и по-висока), при вторичен сифилис - до 100%. За латентен ранен сифилис - 97%, за късен сифилис - 94%, със специфичност 98–100%. По-ниската чувствителност при свежите форми на заболяването се обяснява с по-късното образуване на аглутинини.

Според държавната институция „ЦНИКВИ Росздрав“ чувствителността на RPGA при диагностицирането на различни форми на сифилис е 99,4%. Повечето изследователи отбелязват 98-99% специфичност за RPGA.

По чувствителност и специфичност РПГА не отстъпва, а при късни форми и вроден сифилис дори превъзхожда РИФ и РИБТ.

7. Обхват на приложение на метода RPGA

RPGA може да се използва както като скринингов, така и като потвърдителен тест; може да се използва в полуколичествена версия с изчисляване на титър на антитела. Разработено количествен методстадиране на РПГА, микрометод, както и автоматизирана реакция на микрохемаглутинация.

8. Характеристики, предимства и недостатъци на RPGA

Според литературата RPGA постоянно заема водещо място в клиничната практика в повечето страни по света. RPGA е най-широко използваният тест в STI клиники в чужбина.

Техниката RPGA е лесна за изпълнение и не изисква специално оборудване: всичко, от което се нуждаете, е хемаглутинационна плака. Изследването не отнема много време; реакцията е силно чувствителна и специфична. Тестването на метода в клиничната практика показа, че той е изключително прост, евтин и чувствителен. Подобно на ELISA, RPGA е лесен за изпълнение, не изисква висококвалифициран персонал и специално оборудване и е възможно автоматизирането му.

Предимства на RPGA теста:

• лесен за настройка и интерпретация,
• не изисква специално оборудване,
• време за получаване на резултат – 45 минути,
• подходящ за масов скрининг (необходими са само 25 µl серум, разреден 1:20),
• висока степен на стандартизация,
• наличие на вътрешен контрол,
• дълъг срок на годност,
• приемлива цена
• възможност за автоматизация на счетоводството.

Трябва да се отбележат и недостатъците на RPGA:

• възможността за неспецифични реакции в присъствието на антиеритроцитни антитела,
• липса на корелация между титъра и стадия на сифилис,
• по-късна положителна реакция в ранните стадии на сифилис,
• възможността за фалшиви положителни реакции при хора, които са приемали алкохол, наркомани,
• чувствителност към вибрации и температура в лабораторията.

Предимствата на RPGA в сравнение с RIBT и RIF са:

• използване на индустриални тестови системи,
• възможност за автоматизиране на реакцията,
• не е необходимо да се работи с жива Treponema pallidum,
• няма нужда от вивариум.

9. Източници и причини за грешки при извършване на RPGA, фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати

Тестът за пасивна хемаглутинация е сравнително прост тест; при извършването му е необходимо да се спазват всички препоръки на производителите на диагностикума и правилата за работа в клинико-диагностичната лаборатория. Допуснатите грешки могат да доведат до появата и регистриране както на фалшиво отрицателни, така и на фалшиво положителни резултати от реакцията. Фалшиво положителните резултати от RPGA може да се дължат на влиянието на човешки и биологични фактори.

Възможно е да се получат фалшиви положителни резултати

• при изследване на кръвни серуми на пациенти с невенерически трепонематози,
• поради ревматоиден фактор
• поради антитела, реагиращи кръстосано с трепонемния антиген, образувани по време на различни системни или индуцирани от лекарства метаболитни нарушения,
• поради ненормални нива на имуноглобулини;
• при новородени - поради образуването в тялото на плода или детето на IgM антитела срещу IgG на майката, което усложнява тълкуването на резултатите и диагностицирането на вроден сифилис.

Грешки, причинени от влиянието на човешкото участие върху изследването:

• замърсени микроплаки
• неправилно пипетиране
• наличие на вибрации в лабораторията
• Температурата на въздуха в лабораторията е извън температурния диапазон: 18–25 градуса

Най-типичните технически грешки при изпълнение на RPGA, водещи до ненадеждни резултати, включват:

• неточно разреждане на съставките,
• нарушение на температурата,
• нарушаване на времето за инкубация на реагентите,
• нарушаване на сроковете за прилагане на реактиви към таблета,
• несъответствие между pH на разтворите и необходимите,
• замърсяване на лабораторна стъклария.

Следните технически проблеми също могат да бъдат източник на грешки при настройването на RPGA:

• изключване на контролни кръвни серуми от реакцията;
• неравномерна концентрация на червени кръвни клетки в диагностикума поради недостатъчно смесване преди употреба;
• нарушение на условията за съхранение на диагностикум и контролни червени кръвни клетки; използване на комплекти с изтекъл срок на годност;
• използване на замърсени епруветки, накрайници за пипети, пипети, имунологични плаки, разтвори при извършване на реакции;
• неточности в първоначалното разреждане на серумната проба;
• недостатъчно внимание при извършване на серийни двойни разреждания;
• неспазване на температурните условия и времето за инкубация;
• наличието на външни вибрации и разклащане на имунологичната таблетка по време на инкубация;
• нарушение на процедурата за стадиране на RPGA, изразяващо се в отказ от извършване на изследването с контролни еритроцити.

Използването на кръвна плазма, съдържаща антикоагуланти, които могат да причинят неспецифична еритроцитна аглутинация (RPGA), може да доведе до резултати, които не могат да бъдат интерпретирани.

Броят на фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати е по-нисък, отколкото при други серологични тестове. LPR при стадиране на RPHA са редки и са възможни при трепонематози (фрамбезия, бежел, пинта). Също така са регистрирани фалшиви положителни резултати (общо по-малко от 1%) при наркомани, при пациенти инфекциозна мононуклеоза, борелиоза, проказа, колагенози, цироза на черния дроб, лимфосаркома, както и при бременни жени.

Фалшиво отрицателните резултати от теста може да се дължат на конкуренция между IgM и IgG антитела. Фалшиво отрицателни резултати са възможни и при HIV-инфектирани пациенти.

10. Модификации на метода RPGA

Има микро- и макро-модификации на настройката на RPHA, като първата се използва по-често поради своята ефективност, скорост на настройка и запис на резултатите.

Освен това беше разработен автоматичен диагностичен комплекс за анализ на изображения, който позволи извършването на количествена автоматична оценка на резултатите и премахване на субективизма при интерпретацията на получените данни. Хардуерно-софтуерният комплекс разпознава изображението, обработва данните и дава отговор в относителни единици.

За автоматизиране на записа на резултатите от RPGA се използват също четци и автоматични анализатори.

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) - реакция на аглутинация на изкуствени частици за откриване на антитела срещу Treponema pallidum

Кратко описание на TPPA теста

Понастоящем за диагностициране на сифилис се използва и модификация на метода на пасивна хемаглутинация - TPPA (аглутинация на частици Treponema pallidum), при която антигенът на Treponema pallidum се фиксира върху желатинови частици. Тъй като изкуствените полимерни частици нямат собствени антигени, които определят биологичната активност, комплектите за серодиагностика на сифилис, базирани на тях, имат основание да се считат за по-напреднали. Използването на биологично инертни изкуствени частици минимизира неспецифичната аглутинация, която обикновено се наблюдава при други носители.

TPPA се използва за серологична диагностикаантитела към различни видове и подвидове патогенни Treponema. Този тест може да се използва за откриване на антитела срещу патогените сифилис, пинта, бежел и фрамбезия.

Процедурата на изследване е много проста и не изисква специално оборудване - използват се стандартни микроплаки с U-образна форма. Тестът се основава на аглутинация на желатинови частици, сенсибилизирани с антигени на T. pallidum, антитела, съдържащи се в кръвния серум на пациента.

TPPA е потвърждаващ трепонемален тест, който е полезен както за тестване на малки проби, така и за масов скрининг. TPPA се използва в чужбина като потвърждаващ тест и за замяна на микрохемаглутинационния тест MHA-TP (микрохемаглутинационен анализ за антитела срещу T. pallidum).

Чувствителността на TPPA теста е между 85% и 100%, а специфичността е между 98% и 100%. Чувствителността на TPPA за първичен сифилис е 88%, за вторичен и късен латентен сифилис 98%-100%.

Ако TPPA се използва за диагностициране на сифилис, антителата срещу други трепонеми (като T. pallidum endemicum, pertenue или carateum) могат да причинят фалшиво положителни резултати. Има редица налични методи за отстраняване на тези антитела от серумни проби преди тестване.

Принцип на TPPA теста

TPPA е метод за пасивна аглутинация на желатинови частици в човешки серум или плазма. Серум, съдържащ антитела срещу патогенна трепонема, реагира с желатинови частици, сенсибилизирани с антигена на бледа трепонема щам Nichols, подложен на ултразвук. В резултат на реакцията се образува гладък филм от аглутинирани желатинови частици в ямката на микротитърната плака.

Ако антителата отсъстват, тогава частиците се утаяват на дъното на ямката на плаката, образувайки компактен „бутон“ от неаглутинирани частици. Контролните ямки с несенсибилизирани желатинови частици също трябва да показват този компактен „бутон“ за всеки серум, т.е. без аглутинация.

Приложение на TPPA теста

TRPA е универсален тест, който може да се използва еднакво успешно както по време на задължителен превантивен преглед на групи от населението за сифилис (скрининг), така и в специализирани дерматовенерологични институции. Предимството на TPPA теста е неговата висока чувствителност, която не отстъпва на класически тестове, които доскоро бяха „златен стандарт“ за серодиагностика на сифилис. Други предимства на теста включват висока възпроизводимост, както и простота и скорост на настройка на реакцията.

Тестът TPPA се използва за потвърждаване на положителни резултати от нетрепонемни скринингови тестове за сифилис, като VDRL теста, и за оценка на пациенти с отрицателни резултати от нетрепонемни тестове, но които имат признаци или симптоми, предполагащи късен сифилис. Не се препоръчва използването на TPPA като единствен скринингов тест за сифилис.

В допълнение, тестът за аглутинация TPPA може да се използва за изследване на проби от цереброспинална течност при диагностицирането на невросифилис. В този случай, както и при други серологични изследвания, интерпретацията на резултатите трябва да се извършва в задължителна комбинация с други показатели и симптоми на заболяването.

Резултати от TPPA тест

Резултатът се оценява по системата "плюси" - от (–) до (2+). Резултатите от теста се виждат с невъоръжено око и се интерпретират, както следва:

Резултатите се вземат предвид, за да се определи съответствието с описанието по-горе. Пробите, които показват неопределен резултат (±), трябва да бъдат тествани повторно. Ако дадена проба покаже неопределен резултат при няколко TPPA теста, се препоръчва да се тества с други методи.

Резултатите от анализа не трябва да се разглеждат изолирано. Например, в ранните етапи на инфекцията, броят на антителата е все още твърде малък, в резултат на което TPPA и много други методи нямат чувствителност. Следователно, ако има съмнение за сифилис, дори ако резултатите от теста са отрицателни, пробите трябва да бъдат тествани отново. За да се постави диагноза, е необходимо да се вземат предвид клиничните симптоми, налични при пациента, клинична историяи други данни.

Както при RPHA реакцията, TPPA може да прояви прозонов феномен и фалшиво отрицателен резултат, ако серумната проба съдържа твърде висок титър на антитела.

ELISA - Ензимен имуноанализ

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е един от многото методи за серологична диагностика на инфекциозни заболявания. Имуноензимният анализ (ELISA) при серодиагностиката на сифилис е тест за антитела от класове M, G и A (IgM, IgG, IgA) срещу антигените на Treponema pallidum. Възможно е провеждането на ELISA с цереброспинална течност.

Въвеждането в практиката на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) вместо реакцията на Васерман и други кардиолипинови тестове значително подобри качеството на лабораторната диагностика на сифилис. Съществено предимство на този метод е възможността за автоматизиране на изследователския процес, което намалява влиянието на човешкия фактор.

1. История на метода ELISA

Основните принципи на ензимен имуноанализ на повърхността на твърдофазов носител са разработени от E. Engvar и съавтор. (1971), B. Van Weeman и A. Schuurs (1971). Разработеният от тях ензимен имуноанализ е предложен за първи път за диагностика на сифилис през 1975 г. от J. Veldkamp и A. Visser, които оценяват потенциала на този автоматизиран тест. ELISA започва широко да се използва при диагностицирането на сифилис през 80-те години на миналия век, когато диагностичните тестове са разработени и сертифицирани и методите за изследване са стандартизирани. В СССР методът ELISA за диагностициране на сифилис е разработен от V.N.Bednova, A.V.Babiy и A.V.Kotrovsky (1982, 1983).

2. Принцип на метода ELISA

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е подобен на механизма на реакция с RIF (откриват се същите антитела). Реакцията на ензимен имуноанализ се класифицира като имунологична реакция, основана на високоспецифичното взаимодействие на антигените на treponema pallidum с антителата на пациент със сифилис.

В сифилидологичната практика се използва предимно индиректната версия на ELISA. Принципът на най-често използваната индиректна реакция е следният. На повърхността на ямките на полистиролова таблетка са фиксирани имунни комплекси, които се образуват, когато антителата на пациент със сифилис взаимодействат с антигените на Treponema pallidum. След това те се откриват в цветна реакция, като се използват специфични конюгати и подходящи субстратно-хромогенни добавки.

Процедурата за извършване на теста е следната: серумът на пациента се поставя върху твърдофазов носител с прикрепен към него антиген. Ако в него има антитела, на повърхността на носителя се образува комплекс антиген-антитяло. За да се „проявят” резултатите от реакцията, се използват анти-човешки Ig антитела, конюгирани с ензимни маркери. В случай на положителна реакция, ензимът, прикрепен към комплекса антиген-антитяло, разлага добавения към системата субстрат, което води до развитие на цветно оцветяване с различна интензивност.

В реакцията определянето на комплекса от AG и AT, сорбиран върху твърдата фаза, се извършва с помощта на антиглобулинови антитела, белязани с ензима, въз основа на цветната реакция на ензима със субстрата.

В реакцията определянето на комплекса от антигени и антитела, сорбирани върху твърдата фаза, се извършва с помощта на антиглобулинови антитела, маркирани с ензим.

ELISA дава възможност за откриване на серумни Ig от различни класове. На пазара има системи, които ви позволяват да определяте отделно IgM и IgG и общите антитела.

Специфичните антигени, използвани за ELISA, могат да имат различен произход:

ултра-глас- получават се чрез унищожаване на бактериалната клетка T. pallidum чрез ултразвук или друг метод;

рекомбинантен- те се получават чрез технологии за генно инженерство чрез въвеждане в генома на бактериална клетка (например E. Coli) на ген, отговорен за синтеза на специфичен антиген на T. pallidum, последвано от увеличаване на бактериалната маса на произвеждащите микроорганизъм, унищожаване на тези клетки, изолиране и пречистване на антигена;

пептид- получени в резултат на последователни химичен синтезантигенни епитопи на протеини на T. pallidum.

Тялото е способно да образува антитела към почти всяка част от молекулата на антигена. При нормален имунен отговор това обикновено не се случва. Един или повече имуногенни пептиди, изолирани от протеинов антиген, имат специална антигенност и повечето антитела се образуват специално за тях. Към тях се развива най-интензивният имунен отговор. Имунодоминантните региони на протеините на Treponema pallidum с молекулно тегло 15 kD, 17 kD и 47 kD. Като антиген се използва детергентен екстракт или ултразвук от патогенни трепонеми от щама Nichols.

3. Метод за провеждане на изследване с помощта на метода

Принципът на метода е да се открие специфичен комплекс антиген-антитяло, сорбиран върху твърдата фаза (повърхността на ямките на пластмасова плака) с антиглобулинови антитела, белязани с ензим (пероксидаза), като се използва цветна реакция със субстрата, взет в отчетете количествено спектрофотометрично.

Антигените, използвани за сенсибилизиране на ямките на полистиролова плака, могат да бъдат:

• лизат- получени в резултат на унищожаването на Treponema pallidum чрез ултразвук;
• пептид- получени в резултат на химичен синтез на протеинови фрагменти от Treponema pallidum и притежаващи антигенна реактивност, подобна на оригиналните протеини на патогена;
• рекомбинантен- получени чрез методи на генно инженерство, носещи антигенни детерминанти, идентични с Treponema pallidum.

В сифилидологичната практика обикновено се използва индиректна версия на ELISA.

4. Отчитане на резултатите

При ELISA се използва ензимна реакция за визуализиране на реакцията антиген-антитяло ( алкална фосфатазаили пероксидаза от хрян) със субстрата, който променя цвета си. Интензитетът на цвета определя положителността на реакцията (от “–” до “++++”). Резултатите от ELISA могат да бъдат оценени визуално с помощта на 4-точкова система или инструментално под формата на цифрови индикатори за оптична плътност, получени на специални четци (като Multiscan) при дължина на вълната 492 nm. защото Резултатите се оценяват спектрофотометрично, което елиминира субективното тълкуване.

5. През какви периоди на заболяване е по-добре да се използва

Времето за положителност на ELISA е от 4-та седмица от заразяването. Резултатите от ELISA (както и RIF) стават положителни в първите дни на първичния период или в края на инкубацията и остават положителни през всички периоди. ELISA е особено ценен при ранната диагностика на сифилис - положителни резултати за откриване на антитела могат да бъдат получени още в края на инкубационния период на заболяването (т.е. 4-6 седмици след инфекцията).

6. Чувствителност и специфичност

ELISA е високочувствителен и специфичен тест, което е неговото предимство. ELISA е близо до RIF по отношение на механизма на реакцията, чувствителността и специфичността, т.к И в двете реакции участват едни и същи антитела. Повечето изследователи отбелязват висока специфичност и чувствителност на всички етапи на заболяването. Чувствителността на различните варианти на ELISA, според Г. А. Дмитриев, достига 98–100%, а специфичността - 96–100%. Според TsNIKVI чувствителността на ELISA за сифилис е 99,1% (Заповед № 87 M3 на Руската федерация).

Вариантът на твърдофазния ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ, ELISA) е една от най-чувствителните серологични реакции, позволяваща откриването на 0,0005 μg/ml антитела и 0,000005 μg/ml антигени.

7. Обхват на приложение на метода

Методът се препоръчва за изследване на бременни жени, контактни лица, донори и представители на рискови групи. ELISA може да се използва както като скринингов, така и като потвърждаващ тест. За сравнително краткото време на своята история ELISA еволюира от показателен тест до потвърдителен. При диагностицирането на сифилис тестът се използва и като потвърждаващ тест за проби, демонстриращи положителни резултати, като се използват различни нетрепонемни тестове и RPGA.

Методът ELISA може да се използва в количествена версия с изчисляване на индекса на положителност или реактивност, което ви позволява да оцените нивото на антитела в пробата.

Понастоящем в Русия използването на ензимен имуноанализ за диагностика на сифилис се регулира от Заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация № 87 от 26 март 2001 г. „За подобряване на серологичната диагностика на сифилис“ (Приложение № 1 „ Скрининг за стадиране и диагностични тестове за сифилис”). Поръчката предвижда замяна на RSC в комплекса от серореакции (SRC) с ELISA и RPGA.

8. Източници и причини за грешки по време на производство, фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати

Ензимният имуноанализ е сложно многоетапно изследване, при което е необходимо стриктно да се спазват всички препоръки на производителите на диагностични комплекти, правилата за настройка и конфигуриране на оборудването, използвано в изследването.

Източникът на грешки при извършване на ELISA може да бъде следните точки:

Изследване на реакцията на хиперлипидемичен, хемолизиран кръвен серум или проби с признаци на бактериален растеж;

Не практикувайте замразяване на проба от биологичен материал два или повече пъти; ако е необходимо, повторете изследването, използвайте серум от двойна епруветка;

Нарушаване на условията за съхранение на имуносорбента и промивния разтвор; използване на тестови комплекти с изтекъл срок на годност;

Използване на реакционни компоненти от други диагностични комплекти;

Нарушаване на времето на етапите на реакция;

Изсушаване на ямките на имунологичната плака на реакционните етапи;

Повторно използване на пластмасови съдове (пластмасови тави) за приготвяне на смес от хромоген и субстрат;

Неспазване на периодичността на метрологичен контрол на работните параметри на използваните уреди (шайба и спектрофотометър);

Използване на замърсена лабораторна стъклария при провеждане на реакции: колби, градуирани цилиндри, епруветки, пипети, накрайници за пипети;

Липса на грижи при разрежданията на пробите биологичен материал;

Грешки при въвеждане на проба от биологичен материал в съответната ямка на плаката;

Грешки при прехвърляне на резултатите от изследването в регистъра за регистрация, протокола от изследването или формуляра за отговор.

Внимателното изпълнение на препоръките на инструкциите за използване на комплекти за диагностични тестове, редовната проверка на точността на дозаторите за пипети и автоматичните устройства и използването на вътрешни положителни и отрицателни контроли позволяват получаването на резултати от ELISA теста с висока възпроизводимост.

9. Характеристики, предимства и недостатъци

ELISA е съвременен, обещаващ метод за серодиагностика на сифилис поради своята простота, възпроизводимост и достъпност. Определянето на антитела чрез ELISA е идеален диагностичен метод, подходящ за едновременно изследване на голям брой проби. Благодарение на своите предимства, той придоби популярност във всички страни.

Изследователската технология ELISA изисква спазване на всички препоръки на производителите на търговски комплекти за диагностични тестове и задълбоченост на изследователската процедура. За провеждане на изследвания в ELISA е необходимо да се закупи допълнително специално оборудване. Техниката на поставяне отнема повече време в сравнение с RMP, RPR и RPGA.

Наличието на автоматизация на няколко етапа или на целия процес като цяло ви позволява да изучавате едновременно голям бройпроби от биологичен материал с висока степен на стандартизация на изследването, минимизиране на субективния елемент при оценката на резултатите, възможност за съхраняване на фиксирани протоколи за изследване, което ви позволява да архивирате данните от изследването и да ги достъпвате отново за ретроспективен анализ.

Предимства:

• Позволява диференцирано и общо определяне на IgM и IgG антитела към причинителя на сифилис.
• висока чувствителност и специфичност, приближаваща се до 100%,
• възпроизводимост
• възможности за автоматизация

Предимствата на ELISA включват висока специфичност (96-100%) и чувствителност (98-100%), отбелязани от повечето изследователи.

Наличието на автоматизация на няколко етапа или на целия процес като цяло ви позволява едновременно да изследвате поток с голям брой проби от биологичен материал с висока степен на стандартизация на изследването, минимизирайки субективния елемент при оценката на резултатите , способността за съхраняване на фиксирани протоколи за изследване, което ви позволява да архивирате данни от изследвания и да имате достъп до тях отново за ретроспективен анализ.

Значителни недостатъци на ръчните методи, включително определянето на антитела срещу антигените на T. pallidum чрез ELISA, са:

~ възможни грешкиперсонал по време на изследването (недоглеждане, небрежност, нарушение на технологията);

~ невъзможността за пълна стандартизация на изследователския процес с ръчната версия на ELISA;

~ повишен риск от инфекция на персонала.

10. Модификации на метода

Наред с класическия индиректен ELISA методът капан ELISA. Предложено е през 1989 г. от O. E. Ijsselmudien et al. за откриване на IgM антитела срещу Tr антигени. палидум. Методът има висока специфичност и чувствителност.

Пречистените антитела към човешки имуноглобулини от клас М се сорбират върху повърхността на ямките на плаката и след инкубиране на тестовия серум всички IgM се свързват с носителя. Наличието на антиген-специфични Tr. сред свързаните IgM. pallidum се открива с помощта на Tr. pallidum, конюгиран с ензима.

Този метод ви позволява да откриете антитела не само от клас IgM, но и от класове IgG и IgA. За да направите това, ямките на плаките се сенсибилизират с афинитетно пречистени антитела от определен клас срещу човешки имуноглобулини. В този случай антителата от този клас се улавят от серума и откриването на трепонемни специфични антитела се извършва чрез комбинирането им с конюгат, представляващ връзката на трепонемния антиген с ензима.

Използването на капан версия на ензимно-свързан имуносорбентен анализ намалява риска от фалшиво положителни реакции, медиирани от ревматоиден кръвен фактор, кръстосани реакции между имуноглобулини от класове M и G. При изследване на новородени, в този случай, фалшиво положителен тест резултатите, свързани с откриването на IgM, насочен срещу майчиния анти-трепонемален IgG, също са изключени.

ELISA са намерили широко приложение в чужбина като опции. ензимен имунен анализ (EIA)и система ICE Сифилис. В последния, смес от антитела срещу IgM и IgG, както и три рекомбинантни протеини на T. pallidum, се сорбират в клетките на плаката. Положителните резултати се тестват в същата тестова система в два екземпляра, за да се получи крайният резултат.

В Русия са разработени редица тестови системи за серодиагностика на сифилис, използвайки метода ELISA с домашни реактиви. Тези системи имат висока специфичност и чувствителност.

В допълнение към горното, има и други опции за ELISA, включително тези, които позволяват директно откриванепатоген в кръвта (директен ELISA), dot-ELISA с реакция върху нитроцелулозни ленти, ELISA с капилярна кръв, както и имуноблотинг или Western Blot, с едновременно откриване на антитела към различни компоненти на патогена.

Модерна подобрена модификация на ELISA е имуноблотинг.

ICA (имунохемилуминесцентен анализ), ICL (имунохемилуминесценция)

С развитието на лабораторната диагностика в контекста на модернизацията на здравеопазването в Руската федерация автоматизацията на лабораторните изследвания навлезе в практиката на лабораториите, което прави възможно стандартизирането на аналитичните етапи на изследването. Това помага да се подобри качеството на диагностиката. С въвеждането на автоматизацията започнаха да се използват нови високотехнологични методи с висока чувствителност и специфичност, като хемилуминесцентен имуноанализ (CLIA)

Хемилуминесценцията е процесът на излъчване на фотони по време на прехода на електронно възбудени продукти от окислителни химични реакции към първоначалното им енергийно състояние. По време на реакцията на хемилуминесценция се освобождава значително количество енергия и квантовият добив на излъчената светлина е доста висок. От всички неизотопни методи хемилуминесценцията осигурява най-висока чувствителност. За имунометричните методи чувствителността на хемилуминесценцията е с порядък по-голяма от чувствителността на радиоимуноанализа.

Методът на имунохемилуминесценцията (ICL) в момента е намерил своето приложение в диагностиката на туморни маркери, автоимунни заболявания, диабет, сърдечни маркери, хормони ( щитовидната жлеза, надбъбречни жлези, женски и мъжки полови хормони), факелни инфекции, вирусен хепатит, вируси от херпесната група.

Въз основа на имунохемилуминесцентния метод са разработени редица високочувствителни и специфични (98-100%) тест-системи за диагностика на сифилис, които се използват главно в чужбина.

Методът използва като антигени рекомбинантни липопротеини, получени по методите на генното инженерство, които са пълни аналози на антигените на T. pallidum.

Въз основа на резултатите от клинично проучване методът ICA е признат и се препоръчва за използване в лабораторната диагностика на сифилис в Руската федерация като скрининг и потвърждаващ тест, ако в лабораториите има подходящо оборудване. През 2012 г. ICA беше включен като скрининг и потвърждаващ тест за диагностика на сифилис в Клиничните насоки за лечение на пациенти с полово предавани инфекции и урогенитални инфекции

По този начин използването на високотехнологична ICA, която с въвеждането на автоматизацията стана част от практиката както на световната, така и на местната лабораторна диагностика, осигурява следните предимства:

• елиминиране на влиянието на субективни фактори на аналитичния етап на изследването
• безопасност на персонала при извършване на изследвания на потенциално заразен биологичен материал
• увеличаване на скоростта, с която пациентът получава резултати
• стандартизация на изследванията и контрол на качеството на изследванията
• предоставяне на надеждни и надеждни резултати на пациентите
• високо качество на клиничните лабораторни изследвания.

По отношение на чувствителността методът ICA е сравним с радиоимунологичния метод, а по отношение на лекота на изпълнение, безопасност за персонала и много други параметри го превъзхожда.

Методът ICA, който има висока чувствителност и специфичност (98–100%), дава възможност за количествено определяне на нивото на антитела срещу причинителя на сифилис и може да се използва за потвърждаване на сифилитична инфекция и скрининг. Ограничения за употреба: не може да се използва за наблюдение на ефективността на терапията, може да даде фалшив положителен резултат.

Имунохроматография (ICH).

Методите за откриване на трепонем-специфични антитела, базирани на методите на имунохроматография (ICH), са сравнително нови за използване в Руската федерация. Както при метода ICA, като антигени се използват рекомбинантни липопротеини, получени чрез методи на генно инженерство (например: антигени Tp15, Tp17, Tp47) и биосинтетичният пептид TmpA. Изброените антигени се използват и в различни комбинациикато част от имуносорбенти в ELISA и имуноблотинг.

Методът ICG ви позволява бързо да определите съдържанието на трепонем-специфични антитела към причинителя на сифилис в проби от серум и цяла кръв без използването на специално лабораторно оборудване и се използва при предоставянето на първична здравна помощ, включително за епидемиологични показания.

Ограничения за употреба: не може да се използва за наблюдение на ефективността на терапията, може да даде фалшив положителен резултат.

PBT (прости бързи тестове до леглото)

Сравнително наскоро в серодиагностиката на сифилис започна да се развива посоката на така наречените прости бързи тестове (SRT) или тестове на леглото (Point-of-care - POC). Обикновените бързи нощни тестове или имунохроматографски тестове позволяват бързо определяне на съдържанието на трепонем-специфични антитела срещу причинителя на сифилис в проби от серум и цяла кръв без използването на специално лабораторно оборудване и могат да се използват в първичната здравна помощ, включително за епидемиологични показания. Ограничения за употреба: не може да се използва за наблюдение на ефективността на терапията, може да даде фалшив положителен резултат.

Тези тестове се основават на имунохроматографско определяне на антитела срещу трепонемни антигени на Treponema pallidum и се извършват върху ленти; в този случай могат да се използват както цяла кръв, така и серум (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Форматът на теста позволява изследването да се извършва при липса на специално оборудване и без използване на електричество. Въпреки това, поради относително ниската чувствителност и специфичност, тези тестове все още не са намерили своето широко приложениена практика.

Имуноблотинг (Western Bloting)

През последните години се появиха методи за изследване, насочени към откриване и анализ на съдържанието на антитела към всеки антиген Treponema pallidum отделно. Един от тези методи е методът на имуноблотинг (или блотинг, имуноблотинг, Western blotting), който се използва за определяне на IgG или IgM антитела срещу Treponema pallidum. Имуноблотинг методът е модификация на ензимния имуноанализ – разновидност на ELISA.

Имуноблотингът е един от най-модерните методи за серодиагностика на сифилис и се използва активно в чужбина. Той получи името си („Western blotting“) като хумористичен отговор на имената на техниките за определяне на ДНК („Southern blotting“) и РНК („Northern blotting“).

1. История на метода

Имуноблотинг (Western blot) се използва за определяне на IgG или IgM антитела срещу антигени на treponema pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Класически имуноблот

Класически имуноблот(Western Blot анализ) съчетава ензимен имуноанализ и използването на електрофоретичен метод. Антигенните протеини на причинителя на сифилис се разделят предварително чрез електрофореза и се пренасят върху носител - нитроцелулозна мембрана (лента). Този трансфер се нарича блотиране. След това този носител с отделени точки (петна) се третира с тестовия серум и антитела срещу IgG или IgM, белязани с ензими или радиоактивни вещества. Методът включва използването на естествени или рекомбинантни трепонемни протеини.

Електрофорезае разделянето на заредени съединения въз основа на тяхната подвижност в електрофоретично поле. Когато в среда се приложи потенциална разлика, положително заредените молекули се движат към отрицателно заредения електрод, а отрицателно заредените молекули се движат към положителния електрод.

Повечето глобуларни протеини са сглобени по такъв начин, че повечето от заредените групи, а именно хидрофилните, са разположени на повърхността на протеина, докато незаредените, хидрофобни остатъци са вградени във вътрешността на глобулата. В електрическо поле протеините мигрират според заряда си към противоположно заредения електрод.

Електрофоретичното разделяне на протеини се извършва в синтетична гелова среда на базата на полиакриламид. За да се разделят протеините според тяхното молекулно тегло, протеиновата смес се инкубира предварително в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS) преди електрофореза.

Подробни изследвания на чуждестранни учени Weber и Osborn (1969) показват, че след такава обработка единственият фактор, който може да повлияе на мобилността на протеините в полиакриламиден гел (PAGE), е размерът на протеина или по-скоро неговото молекулно тегло. Това направи възможно използването на метода на PAGE електрофореза в присъствието на SDS за сравнително точно определяне на молекулното тегло на протеини и пептиди. В чуждестранната литература този метод се нарича SDS-PAGE (натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел електрофореза).

Профил на реактивност при класически WB тест с естествени антигени (метод на електрофореза с натриев додецилсулфат и полиакриламиден гел). (1) - контролен положителен резултат, (2) - контролен отрицателен резултат, (3-6) - клинични проби.

При тестове за сифилис, използващи този метод, Treponema pallidum, предварително пречистена и унищожена на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза в полиакриламиден или агарозен гел. В този случай антигените, включени в състава му, се разделят по молекулно тегло.

След това, използвайки вертикална електрофореза, антигените се прехвърлят върху лента от нитроцелулоза, която сега съдържа спектър от антигенни ивици, невидими за окото, характерни за Treponema pallidum.

При извършване на анализ тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху нитроцелулозна лента (лента). Ако в пробата има специфични антитела, то по време на инкубационния процес те силно се свързват със строго съответстващи (комплементарни) антигенни ленти и образуват комплекс „антиген-антитяло”.

След отстраняване на несвързаните имуноглобулини по време на измиване на лентата, следва инкубиране с конюгат - ензимно маркирани антитела срещу човешки имуноглобулини (антитела срещу човешки IgG или IgM), при което ензимно маркирани антитела се прикрепват към съществуващите комплекси антиген-антитяло на повърхността на мембраната.

След отстраняване на несвързания конюгат по време на инкубацията с разтвора на субстрата, ензимът взаимодейства със субстрата, което води до развитие на цветна реакция - оцветяване на мембранни участъци (под формата на ивици), където се намират отделни антигени на treponema pallidum, антитела към които бяха в тестовия серум. Интензивността на оцветяването зависи от количеството на свързаните антитела от серума. Резултатът от реакцията се оценява визуално.

Наличието на ивици в определени области на нитроцелулозната пластина потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени антигени на Treponema pallidum.

Имунодетерминантите 15, 5, 17, 44,5, 47 kD, определени с помощта на този метод, имат диагностично значение за сифилис. Ig G имуноблотингът е подобен по чувствителност и специфичност на RIF с абсорбция (RIF abs). Ig M имуноблотингът може да служи като диагностичен тест за вроден сифилис.

3. Имуноблот във формат на линеен имуноанализ

Линейният имуноанализ (LIA) позволява едновременното определяне на антитела срещу антигени на Treponema pallidum в човешки серум или плазма. Антигените се прилагат предварително към тест ленти, които се доставят като част от търговски диагностични комплекти.

Лентите са изработени от нитроцелулозна мембрана, полиамид с пластмасова подложка или найлонова мембрана с пластмасова подложка. По време на производството няколко отделни антигена се поставят върху тест лентата под формата на отделни антигенни линии. В допълнение към тези антигени на сифилис, към всяка лента се прилагат още четири контролни линии: стрептавидин и контролни проби (3 +, 1 + и ± линия на срязване).

Лентите използват изкуствени антигени, получени чрез методи на генното инженерство - рекомбинантни протеини или синтетични полипептидни конструкции. Това са аналози на повърхностните антигени на Treponema pallidum - TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с молекулни тегла 15, 17, 47 kDa и 44.5 (TmpA), където kDa = килодалтони. С тяхна помощ се определят серумни антитела към различни имунодоминантни компоненти на патогена.

Тестовата проба се инкубира в кювета, където се поставя и индикаторна лента. Антителата срещу T. pallidum се определят чрез свързване с антигени, нанесени върху тест ленти. Ако T. pallidum-специфични антитела присъстват в пробата, те образуват връзки с различни антигенни линии. Когато антителата, съдържащи се в тестовия серум, взаимодействат с дискретни антигени на T. pallidum, поставени върху тестовата лента, се образува комплекс антиген-антитяло под формата на визуално откриваеми цветни ленти.

Когато се вземат предвид резултатите от имуноблотинга, реактивността на серума към всеки от антигените се оценява отделно. Общ положителен отговор се дава, когато се получи резултат едновременно с два или три от представените антигени.

Изследователските процедури се извършват ръчно или на специален анализатор, с тълкуване на резултатите с помощта на специализирани компютърна програмаза инфекциозни заболявания.

Благодарение на високата степен на пречистване на рекомбинантните антигени и едновременното откриване на антитела към най-имуногенните детерминанти на причинителя на сифилис, методът има висока чувствителност и специфичност.

4. Отчитане на резултатите

За отчитане на интензитета на оцветяване на антигенни ивици върху ленти са разработени фотометри, чиято работа се основава на отразяване на сигнала, което елиминира субективната оценка и осигурява потенциал за автоматизация.

5. През какви периоди на заболяване е по-добре да се използва

Тестовете, използващи имуноблотинг, могат да открият специфични антитела срещу антигените на Treponema pallidum в много ранен стадий на заболяването. Най-значимите антитела при диагностицирането на сифилис са антителата срещу антигените на Treponema pallidum TpN15, TpN17, TmpA и TpN47. Тези антигени са мембранни протеини с молекулни тегла съответно 15, 17, 44,5 и 47 kDa.

Когато Treponema pallidum се въведе в човешкото тяло, антисифилитичните антитела се появяват в следния ред: първо се развива имунен отговор към антигени TpN17, след това към TpN47, след TpN15 и по-късно към всички TmpA. Когато се вземат предвид резултатите от теста, серумната реактивност към всеки от тях се оценява отделно. Например, когато линеен блот показва реактивност само към антигенните линии TpN17 и TpN47, това означава, че заболяването е в ранен стадий. Колкото повече антигенни линии стават реактивни, толкова по-напред напредва инфекцията. При лечение на сифилис моделът на реактивност в този тест се променя.

Определянето на IgM към протеини с молекулно тегло 15,17, 41, 47 kDa позволява да се идентифицират 29,2% от пациентите с вторичен сифилис, 12,5% с ранен латентен сифилис и 8,0% със серорезистентност. Търсенето на IgG към същите молекули се характеризира с чувствителност от 61,6% за серорезистентност и 100% за вторичен и ранен латентен сифилис.

6. Чувствителност и специфичност

Според литературните данни чувствителността и специфичността на теста са много високи - съответно 99,6-100 и 99,3-99,5%. При класическия метод това се постига чрез електрофоретично разделяне на протеини, глико- и липопротеини и максимална специфичност на откриване на имунни серуми или моноклонални антитела. При оптимални условия имуноблотингът може да открие антиген в количества под 1 ng в тестовия обем.

Чувствителността на линейния блот също е 99,6%, а специфичността варира между 99,3% и 99,5%.

Според експерти имуноблотингът с рекомбинантни високоспецифични антигени е подобен по чувствителност и специфичност на RIF-abs.

Според данни от чуждестранна литература и резултати от проучване в TsNIKVI, методът на имуноблотинг има висока чувствителност (98,8-100%) и специфичност (97,1-100%) за диагностициране на сифилис.

7. Обхват на приложение на метода

Имуноблотингът (иммуноблот) е високоспецифичен и силно чувствителен референтен метод. Високата чувствителност и специфичност позволява този метод да се счита за потвърждаващ тест за сифилис. Методът може да се използва за потвърждаване на диагнозата, както и в случаите, когато други трепонемни изследвания дават съмнителни и противоречиви резултати. Използвайки имуноблотинг, можете да потвърдите диагнозата при пациенти с положителни или неопределени резултати от теста, включително тези, получени с помощта на RPGA или ELISA.

8. Източници и причини за грешки по време на производство, фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати

Фалшивите положителни резултати са много редки. Фалшиво-отрицателните резултати също са доста редки и се наблюдават при пациенти с имунна недостатъчност - по-често при HIV-инфектирани хора и с ефекта на диагностичен „прозорец“ поради забавяне на синтеза на антитела, както и в случай на грешки на етап диагностика.

Използването на съвременни тест системи налага стриктно спазване на всички изисквания както към материала, така и към изпълнението на реакцията. По принцип източникът на грешки е нарушение на реда и технологията на изследването (особено за класическия Western blot) и неспазване на препоръките на производителите на тестови комплекти. . Грешки могат да възникнат и по време на събирането, доставката, съхранението на серумни проби и по време на тестването. В допълнение към развалените проби, други възможни причини включват използването на тестови комплекти с изтекъл срок на годност, както и грешки в анализа на резултатите от изследването.

9. Характеристики, предимства и недостатъци

Уникалността на имуноблота се състои в неговата висока информативност и надеждност на резултатите.

Тестът не изисква високо пречистени антигени, референтни или контролни серуми. Идентифицирането на мишената на антитялото се основава на молекулното тегло на протеина, с който реагират антителата от серума на пациента. В една реакция може да се открие антитяло, свързващо се с множество антигени, всеки от които може да бъде прецизно характеризиран. Поради това имуноблотингът има редица предимства пред другите методи за откриване на антитела, резултатите от които зависят от стандартизацията, чувствителността, качеството на субстрата, нестабилността или неразтворимостта на определени антигени

Методът е лесно възпроизводим, сравнително лесен за изпълнение и интерпретиране на резултатите, дава възможност да се определи спектърът на антителата към няколко антигена на T. pallidum наведнъж и да се оцени приносът към обща реакцияантитела с различна специфичност.

Използването на високо пречистени рекомбинантни и пептидни антигени минимизира неспецифичната серумна реактивност. Използването на метода позволява да се избегнат трудоемки и субективни методи, които представляват опасност за изследователя (инокулация на щамове G. pallidum, работа с патогенен T. pallidum при поставяне на реакция). Това определя предпочитанието на метода имуноблотинг пред другите трепонемни тестове (RIF и особено RIBT) за диагностициране на сифилис.

10. Модификации на метода

Има няколко търговски системи за тестване, базирани на този метод. Някои от тях са направени във формат Western blot, се състои от ленти, върху които се пренасят протеиновите компоненти на T. pallidum, предварително разделени чрез електрофореза в полиакриламиден гел.

Други са във формата линеен блот, се състоят от ленти, върху които са сорбирани рекомбинантни и синтетични полипептиди под формата на дискретни линии - аналози на повърхностните антигени на T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

Резултатите от Western blot са по-трудни за тълкуване, тъй като лентите разкриват голямо разнообразие от антитела, много от които са групово специфични. За разлика от това, тълкуването на резултатите от линейния блот е лесно; В допълнение, допълнителните контролни линии, приложени към лентата, позволяват полуколичествена оценка на нивото на антитела срещу четири антигена на T. pallidum.

xMAP технология

xMAP е модерна технология, която позволява многопараметрични изследвания чрез едновременно откриване на множество аналити в една биологична проба. Като твърда фаза се използват оцветени микросфери, покрити с реагенти за улавяне (олигонуклеотиди, антитела, антигени).

Тестовата проба се добавя към разтвора, съдържащ микросферите. Аналитите, открити в пробата, се свързват със съответната микросфера, след което към разтвора се добавя агент за откриване (антитела за откриване, флуоресцентен етикет). За откриване на определяния аналит се използва система от два лазера, която позволява както качествена оценка на наличието на аналита в пробата (за това се използва червен лазер, класифициращ микросферите по цвят), така и количествена оценка на съдържанието на аналита в пробата (за това се използва зелен лазер).