Клетъчни биотехнологии в растениевъдството. Технологии, използващи ГМО и биотехнологии

Специална област на приложение на клетъчните култури и клетъчните технологии е тъканното инженерство, свързано с разработването на биоизкуствени органи и тъкани. Понастоящем въз основа на натрупаните фундаментални знания са усвоени технологии за поддържане на клетъчни култури от различен произход (растителни клетки, клетки от насекоми и бозайници), включително в индустриален мащаб.

Растителните клетки и растителната тъканна култура правят възможно регенерирането на цяло растение от протопласти и клетки. Характеристика на растителните клетъчни култури е тяхната способност към тотипотентност, т.е. в определена среда и определени условия е възможно да се регенерира цяло растение от една клетка. Тази техника осигурява относително краткосроченполучаване на множество клетъчни популации при контролирани условия и прави възможно идентифицирането на растителни линии с повишена биологична продуктивност.

Инженерството на растителни клетки се основава на използването на изолирани клетъчни култури, тъкани и протопласти. Има няколко направления за използване на тези технологии в растениевъдството.

Първият е свързан със способността на изолирани растителни клетки да произвеждат ценни биологично активни съединения в култура, включително женшен или идиолити, етерични масла, алкалоиди, глюкозиди и др.

Второто направление е използването на изолирана тъканна култура за клоново размножаване на растения и подобряване на посадъчния материал.

Третото направление е използването на изолирани клетки в растениевъдството. Растителните клетки, култивирани върху изкуствени среди, се характеризират с голяма хетерогенност; В този случай е възможно да се подберат клетки, които са устойчиви на определени неблагоприятни фактори - суша, ниска температура, фитопатогени и др.

Растителните клетъчни култури се използват за биотрансформация на химични съединения и за ефективен de novo синтез на биологично активни съединения. В клетъчната култура се запазва способността за производство на биологично активни съединения, характерни за оригиналното цяло растение, което прави възможно организирането на условия, които осигуряват синтеза на ценни продукти, които не са открити преди в оригиналните непокътнати растения. Например, в растителните клетъчни култури стана възможно получаването на такива ценни съединения като перицин, перикалин, хинокиол, феригинол, аквамалин и др.

Внедрени са широкомащабни системи за култивиране на растителни клетки за получаване на различни ценни вещества- ментол, женшен, убихинон-10, бетанин, камптотецин (антиканцероген), полипептиди - фитовирусни инхибитори, агар-агар и др. Например ефективен и скъп цитостатик паклитаксел, традиционно получен от кората на средиземноморския тис ( 8 тона суровини осигуряват 1 kg от лекарството), в момента се получава с по-голяма ефективност в клетъчна култура.

Процесите, използващи имобилизирани растителни клетки, се оказват още по-ефективни. Такива биологични системи са по-устойчиви на механични повреди и фазата на растеж на клетките съвпада с фазата на образуване на продукта; клетките лесно се прехвърлят в нова среда или други условия на култивиране. След като беше установена способността на апикалната меристема (малката област от недиференцирани клетки на върха на стъблото) да расте, за да образува цяло растение, тази техника беше използвана за клониране на растителни линии.

Културата на растителна тъкан, подобно на клетъчната култура, позволява бързо получаване на здрави растителни клонове и на тази основа обещаващ посадъчен материал в почти неограничен мащаб.

Клетъчните култури от насекоми правят възможно получаването на нови видове биологични агенти за борба с насекомите вредители без отрицателно влияниеза жизнеспособност полезни видовенасекоми, както и такива, които не се натрупват в околната среда. Предимствата на биологичните методи за борба с вредителите са известни отдавна, това са бактериални, гъбични и вирусни препарати, чието производство изисква специализирано оборудване и условия. Това важи особено за лекарствата от вирусната група, чието производство се основава на масовото размножаване на насекомото гостоприемник върху изкуствени среди. Поради доста трудоемкия характер на производството, тези лекарства не са намерили широко приложение доскоро.

Използването на клетъчни култури от насекоми може напълно да реши този проблем. Техниката на клетъчните култури от насекоми за размножаване на вируси е много обещаваща. Това изисква получаване на високопродуктивни клетъчни линии, оптимизиране на хранителна среда и избор на ефективни системи вирус-клетъчна. Използвайки тази технология, лекарството "Elkar" се произвежда в САЩ. Развитие на рекомбинантни бакуловируси с гени, кодиращи обмен на воданасекоми След използване на това лекарство, насекомите умират в рамките на 5 дни от дехидратация или пренасищане с вода.

Новите биотехнологични методи могат да повлияят на цената на вирусните лекарства. В допълнение, точно както растителните клетки, клетките на насекомите могат да се използват за синтез лекарства. Започна внедряването на потенциала на клетките на насекоми за производството на VLP ваксини (VLP - вирусоподобни частици), предназначени за лечение на инфекциозни заболявания като напр. атипична пневмонияи грип. Тази техника може значително да намали разходите и да премахне опасенията за безопасност, свързани с традиционния метод с използване на кокоши яйца.

Културите от животински клетки се използват широко като тестови обекти за оценка на безопасността и ефективността на нови лекарства. Освен това клетките на бозайници са подходящи за синтез на лекарства, особено на някои животински протеини, които са твърде сложни, за да бъдат синтезирани с помощта на генетично модифицирани микроорганизми, както и моноклонални антитела и ваксини.

Например Sanofi Pasteur (САЩ), по поръчка на Министерството на здравеопазването и човешките услуги на САЩ, разработва методи за култивиране на клетки от бозайници с цел ефективно синтезиране на противогрипни ваксини. Специална област на приложение на клетъчните култури, особено на стволовите клетки, и технологиите е терапията и реконструктивна хирургияувредени органи и тъкани.

Списъкът от заболявания, чието лечение става възможно чрез използването на клетъчна терапия и трансплантация, бързо нараства. Най-напредналите в момента са използването на клетъчни технологии в кардиологията за лечение на миокарден инфаркт, възстановяване на кръвотока в исхемични органи и тъкани, повишаване на помпената функция на сърцето, както и лечение на дислипидемия и атеросклероза. В неврологията технологиите за клетъчна трансплантация започнаха да се използват за лечение на болестта на Паркинсон и болестта на Хагинтън.

Има примери за положително използване на стволови клетки от костен мозък за заздравяване на изгаряния и дълбоки кожни рани и лечение на системни и локални костни дефекти. Във връзка с установената антитуморна активност на слабо диференцираните хемопоетични клетки и способността им да потискат директно туморния растеж, се провеждат изследвания, насочени към клинично приложение на стволови клетки в онкологията.

Търсенето на нови технологии за възстановяване на загубената функция на даден орган или система доведе до появата на тъканното инженерство (регенеративна медицина и органогенеза) в пресечната точка на биотехнологиите и медицината. Бъдещето на медицината е пряко свързано с развитието на клетъчните технологии, които позволяват, без да променят увредения орган, да „подновят“ клетъчния му състав. Това „обновяване“ на структурните и функционални елементи на даден орган прави възможно решаването на същите проблеми като трансплантацията на органи. В същото време тази технология значително разширява възможностите за трансплантационно лечение, което го прави достъпно за широк кръг от различни категории пациенти.

Основата за развитието на най-новите реконструктивни технологии са функциониращи клетки, способни да образуват тъкани от различен тип, в зависимост от микросредата.

Списъкът от заболявания, за които клетъчните технологии вече се използват или се планира да бъдат използвани в близко бъдеще, нараства бързо. Този списък явно ще включва всички болести лечение с лекарствакоито са неефективни. Интердисциплинарният подход, използван в тъканното инженерство, е насочен основно към създаване на нови биокомпозитни материали за възстановяване на загубените функции на отделни тъкани или органи като цяло.

Основните принципи на този подход са разработването и използването на носители, направени от биоразградими материали, които се използват в комбинация с донорни клетки и/или биоактивни вещества, когато се имплантират в увреден орган или тъкан.

Революционните трансформации на традиционните биотехнологични процеси са свързани с използването на методи генното инженерство. Методът на рекомбинантната ДНК е крайъгълният камък на съвременната биотехнология. Създаването на рекомбинантна ДНК означава комбиниране (рекомбиниране) на две части ДНК от различни видове.

С помощта на генното инженерство са разработени и използвани различни социално значими технологии и процеси:
- производство на нови лекарства и безопасни ваксини;
- лечение на някои генетични заболявания;
- създаване на агенти за биоконтрол за селското стопанство;
- повишаване на производителността и намаляване на производствените разходи;
- намаляване на алергенността на някои продукти;
- подобрение хранителни свойствапродукти;
- разработване на биоразградими пластмаси;
- намаляване нивото на замърсяване на водата и въздуха;
- забавяне на скоростта на разваляне на храната;
- контрол на вирусни заболявания.

Молекулярното или генетичното клониране - процесът на създаване на генетично идентични ДНК молекули - е основата на молекулярната биология, основен метод на биотехнологичните изследвания и основата за развитието и комерсиализацията на биотехнологиите. По-голямата част от практическите приложения на биотехнологиите, от разработването на лекарства до създаването на трансгенни култури, се основават на методи за генетично клониране.

С помощта на молекулярното клониране стана възможно: идентифициране, локализиране и описание на гени; създаване на генетични карти и секвениране на цели геноми; правене на паралели между гените и свързаните с тях черти; установяване на молекулярната основа за проявата на симптомите. Обхватът на клонирането е изключително широк.

Към номера обещаващи посокибиотехнологията се отнася до модификацията на генома на култивираните растения с цел увеличаване на производителността и подобряване на тяхната устойчивост срещу вредители и неблагоприятни условиязаобикаляща среда. Естествено, най-голям интерес предизвиква възможността за трансформация на едносемеделни растения (предимно житни).

Трансформацията на генома на висшите растения се извършва по два метода: балистичен и с помощта на естествена система за пренасяне на генетичен материал - част от Ti-плазмида (T-DNA) - Agrobacterium tumefaciens, причинител на бактериален рак или коронарна жлъчка в двусемеделни растения. Като маркерна система се използват гени за антибиотична резистентност, както и нови системи - Lux гени или бактериалният Р-глюкуронидазен ген, който предизвиква оцветяване на селективната среда. Ti плазмидите, модифицирани с различни гени, се прехвърлят в растенията. Прехвърлянето на генетична информация с помощта на Ti плазмид също беше извършено на примера на едносемеделни растения: използва се тъкан от луковици на гладиол с отстранени странични части.

Цилиндричните експланти бяха заразени с вирулентни щамове на Agrobacterium, носещи Ti плазмид, който съдържа гени, кодиращи синтеза на опини; след 24 часа на повърхността на заразеното растение се появяват тумори. Експерти от университета Карнел (САЩ) предложиха нов метод - прострелване на растителни клетки с волфрамови куршуми, покрити с генетичен материал. „Обстрелването“ на клетките гостоприемници става със скорост над 1000 км/ч с милион метални топчета, покрити със слой от ДНК фрагменти; методът се оказа универсален.

С помощта на генното инженерство стана възможно да се получат растения, устойчиви на сол, хербициди и замръзване. Според експерти в САЩ годишните щети от замръзване се оценяват на 6 милиарда долара. Оказа се, че най-активните центрове на кристализация са отделни бактерии (представители на Pseudomonas, Erwinia), способни да предизвикат образуване на лед при 0 °C; те бяха наречени INA бактерии - активни водни кристализатори (Ice-nucleation Active). В тези бактерии е идентифициран специфичен мембранен протеин, който причинява кристализация; ледените гени са клонирани и модифицирани.

Отстраняването на средната част доведе до загуба на способността за отделяне на протеинова кристализация. В резултат на това бактериите с модифициран леден ген губят способността да кристализират вода при -1-5 oC. Инокулирането на растения с тези генетично модифицирани бактерии при разпукване на пъпките предотвратява колонизацията от други бактерии, така че растенията са ефективно имунизирани срещу инфекция от див тип INA бактерии и са имунизирани срещу краткотрайни студове.

Втората вълна на „зелената революция” е насочена към получаване на генетично модифицирани „самооплождащи се” растения. Установено е, че геномът на азотфиксиращите симбиотични бактерии съдържа група гени, отговорни за симбиозата с растенията и локализирани в големи симбиотични плазмиди pSym; процесът на образуване на нодули се контролира от nod гени и, накрая, nif гените са отговорни за синтеза на нитрогеназа, т.е. фиксация на азот.

В момента големи суми пари в САЩ и други страни се инвестират в програма за производство на трансгенни зърнени култури с гени за фиксиране на азот. Въпреки това, когато гените за фиксиране на азот се прехвърлят към висши растения, в допълнение към трудностите генетична природа, има и други. Регулирането на връзката между гените за фиксиране на азот и гените, отговорни за синтеза на електронни носители и кофактори, необходими за функционирането на ензима нитрогеназа, все още не е достатъчно проучено.

Последният трябва да бъде защитен от инхибиторните ефекти на кислорода. Провеждат се и интензивни изследвания върху генетиката на растенията за избор на ефективни растения гостоприемници, както и изследвания, насочени към модифициране на генома на микроорганизмите, за да се произведат организми, които могат да съществуват в симбиоза не само с бобови растения (например зърнени култури). Основни изследванияотносно прехвърлянето на гени за фиксиране на азот във висши растения очевидно ще доведе до обещаващи открития и радикална революция в практиката на азотно хранене на растенията.

Втората, много важна област на приложение на генното инженерство е да се даде устойчивост на културните растения към инфекция от листоядни насекоми. Естествените растителни патогени, като бактериите Bacillus thuringiensis (Bt), които произвеждат токсини, ефективни срещу листоядни насекоми, са се превърнали в източник на гени, които правят растенията устойчиви на тези вредители. Синтезът на Bt токсини се контролира от един ген; наличните методи позволяват работа, насочена към подобряване на съществуващите производители и продукти на Bt.

Известно е, че гените, контролиращи синтеза на Bt кристали, са локализирани върху малък брой плазмиди със значително молекулно тегло. Токсичният протеин, произведен от Bt, е клониран в E. coli и B. subtilis и е бил експресиран дори по време на вегетативната фаза на растеж. Има информация за клониране на токсичен за пеперудите протеин в клетки на тютюн.

В напълно пораснало тютюнево растение всяка клетка произвежда токсин. По този начин растение, което е придобило самия токсин, става устойчиво на насекоми: като яде листата, гъсеницата умира, без да причинява значителна вреда на растението.

Американските компании Monsanto и Agrocetus са провели полеви тестове и са пуснали сортове памук, соя и редица други култури с Bt геном, вграден в хромозомата. Устойчивостта на гъсениците се предава на семената и следващите поколения растения. Започва производството на трансгенен разсад от картофи и домати с въведен Bt ген, който е токсичен за лепидоптерите. Създадена е трансгенна топола, устойчива на насекоми, с въведен в тъканните клетки антитрипсиназен ген. Ензимът намалява усвояването на протеини от насекомите, което води до намаляване на популацията.

Гените за устойчивост на хербициди са клонирани; тяхното клониране в растения има за цел да гарантира безопасността на употребата на пестициди в селското стопанство. Въпреки това клонирането на гени в културни растения е свързано с определени рискове. Притесненията са свързани с възможността генетичните вектори и трансгенните растения да излязат от контрола на биотехнолозите. Поради това има опасения относно превръщането на генетично модифицираните растения в плевели, въпреки че комплексът „плевелност“ (набор от признаци, който осигурява бързо разпространение в ущърб на култивираните растения, устойчивост на неблагоприятни фактори, ефективни механизми за разпространение на семена и др.) едва ли може да се образува в резултат на трансплантация на един или няколко гена.

В същото време резистентността към хербициди, кодирана от един единствен ген, може да причини значителни проблеми в практиките на сеитбооборот. По този начин растение, устойчиво на определено лекарство, култивирано в определен район, ще действа по отношение на него като плевел, устойчив на този хербицид през следващата година при смяна на културите в това поле. Това изисква внимателно тестване на всички генетично модифицирани растения, преди да бъдат пуснати на полето.

Нов начин за модификация на генома е използването на антисенс РНК, т.е. потискане на синтеза на определен протеин. Въвеждането на комплементарен иРНК олигонуклеотид в клетката предотвратява четенето на информация. Използването на тази технология направи възможно получаването на сорт домати, който се запазва дълго времечрез блокиране на функцията на полигалактуроназния ген (разгражда въглехидратите в клетката, стимулирайки узряването) или кафе с ниски нива на кофеин в резултат на въвеждане на ген, който потиска производството; тези. Това е начин за премахване на неприятните горчиви и други вещества от земеделските продукти, потискане на вирусни инфекции и др.

Генното инженерство на животните е насочено към отглеждане на животни с високи продуктивни свойства.

Методите на генното инженерство, заедно с клонирането на животни, също позволяват получаването на модели за изследване на човешките заболявания, процесите на стареене и образуването на злокачествени новообразувания. В бъдеще тези техники могат да се използват за разработване на нови лекарства и оценка на ефективността на лечения като генна и клетъчна терапия. Клонирането на животни също дава възможност за спасяване на застрашени видове.

Биотехнологичните методи за възпроизвеждане на животни включват изкуствено осеменяване, предизвикване на раждане, трансплантация, регулиране на съотношението мъжки и женски женски полв населението това включва и ранна диагностика на бременността, използване на хормони за регулиране на репродуктивните функции и растеж и др.

Изкуственото разделяне на ембриони е рутинен метод за клониране. Методът дава възможност за получаване голямо числореплики на животни от производители с висока стойност. Възможно е да се получат голям брой копия на еднояйчни близнаци чрез разделяне на ембриони на етап бластула или морула на части. Тези части от ембриона се въвеждат в празните черупки на свински яйца, поставят се в агарови цилиндри за няколко дни, след което се въвеждат в яйцепроводите на овцете.

Нормално развитите ембриони се трансплантират по хирургичен път в крави реципиенти на 6-7-ия ден от репродуктивния цикъл. Процентът на оцеляване на половинките е до 75%, за четвъртините е по-нисък, около 40%. Получените ембриони се имплантират в матката на сурогатната майка, която осигурява тяхната бременност и раждане. Тъй като ембрионите идват от една и съща зигота, те са генетично идентични.

Манипулирането на ембриони се използва за получаване на ембриони на различни животни. Подходът позволява да се преодолее междувидовата бариера и да се създадат химерни животни. По този начин са получени например овце-кози химери.

Първите експерименти показаха възможността за трансформиране на генома на животни с човешки гени; в САЩ беше възможно да се получат прасета, носещи гена на човешкия растежен хормон. В Биотехнологичния център в Единбург са получени овце с пренесен човешки фактор 9, който се секретира в млякото.

Новият метод - ядрен трансфер на соматични клетки (или препрограмиране на яйцеклетки) започва с изолирането на соматична клетка от тялото - всяка клетка, която не участва в процеса на размножаване (т.е. всяка различна от зародишни клетки - сперматозоиди и яйцеклетки). При бозайниците всяка соматична клетка съдържа пълен двоен набор от хромозоми (във всяка двойка една хромозома се получава от яйцеклетката на майката, втората от спермата на бащата). Геномът на всяка зародишна клетка се състои само от един набор от хромозоми.

За да създадат овцата Доли, изследователите прехвърлиха ядрото на соматична клетка, получена от възрастна овца, в яйцеклетка, чието ядро ​​преди това беше отстранено. След определени химични манипулации яйцеклетката със смененото ядро ​​започва да се държи като прясно оплодена яйцеклетка. В резултат на разделянето му се образува ембрион, който се имплантира в сурогатна майка и се носи през цялата бременност. Появата на Доли демонстрира възможността за премахване на генетичната програма от ядрото на специализирана соматична клетка и препрограмирането й в лаборатория чрез поставянето й в яйцеклетка.

В рамките на 5-6 дни яйцеклетката се развива в ембрион, който е генетично идентичен с животното донор. Клетките на този ембрион могат да се използват за получаване на всякакъв вид тъкан, която при трансплантация няма да бъде отхвърлена от тялото на донора на ядрото. Този метод може да се използва за отглеждане на клетки и тъкани за заместителна терапия. Този метод за клониране на животни се използва много активно в момента.

Подобряване на биотехнологичните методи и средства за диагностика и лечение, способността за създаване на ефективни породи селскостопански животни и сортове култивирани растения с помощта на ускорени методи - всичко това спомага за подобряване на качеството на човешкия живот.

Нека усетим приноса на биотехнологиите за увеличаване на минералните и енергийните ресурси, както и за опазване на околната среда. Във връзка с последното особено значение придобива посоката, насочена към разработването на екологично чисти нови материали. Създаване на екологично чисти материали с полезни свойстваостава един от основните проблеми на нашето време. Към днешна дата производствените обеми на синтетични пластмаси, които не са разградими в естествената среда, достигнаха 180 милиона тона/годишно, което създаде глобален екологичен проблем.

Радикално решение на този проблем е разработването на полимери, способни да се разграждат биоразграждащи до компоненти, безвредни за живата и неживата природа. В тази връзка през последните години се наблюдава значителен напредък в синтеза на разградими биополимери - високомолекулни полимерни материали, способни да се разграждат в естествена среда до безвредни продукти (въглероден диоксид и вода).

НА. Войнов, Т.Г. Волова

Микроорганизмите се различават значително един от друг по морфология, размер на клетките, отношение към кислорода, изисквания към растежни фактори, способност за усвояване на различни компоненти на субстрата и др.
От повече от 100 000 известни вида микроорганизми сравнително малко се използват в промишлеността - около 100 вида. Те трябва да отговарят на следните изисквания:
1. Отглеждане на евтини и достъпни субстрати;
2. Притежавам висока скорострастеж на биомаса и осигуряване на висока производителност на целевия продукт при икономична консумация на хранителен субстрат;
3. Проявяват целенасочена биосинтетична активност с минимално образуване на странични продукти (фиг. 2.1);

Ориз. 2.1. Микроорганизми, използвани в промишления синтез различни връзки
А – А cetobacter aceti; B – Aspergillus niger; B – Penicillium chrysogenum; D – Lactobacillus delbruecki; E – Производство на леван по време на ферментация на среда, съдържаща Zymomonas mobilis

4. Да са генетично хомогенни, стабилни по отношение на продуктивността и изискванията към хранителния субстрат, както и условията на отглеждане;
5. Да са устойчиви на фаги и друга чужда микрофлора;
6. Да са безвредни (да нямат патогенни свойства) за хората и околната среда;
7. Желателно е производителите да са термофилни и ацидофилни, тъй като в този случай е по-лесно да се защити ферментиращият субстрат от нахлуване на чужда микрофлора;
8. Целевият продукт на биосинтезата трябва да има икономическа и националностопанска стойност и лесно да се изолира от ферментиралия субстрат.
Анаеробните микроорганизми представляват все по-голям интерес, тъй като не изискват енергоемки устройства за аериране по време на култивиране.
суперсинтез,способността на микроорганизма да синтезира определен продукт в количества, надвишаващи неговите физиологични нужди, е доста често срещана в природата. Често един или друг метаболитен продукт (органични киселини, алкохоли, антибактериални вещества), освободен от микроорганизъм в околната среда, е токсичен за други видове и служи на производителя като средство за защита на обитаваното пространство или като хранителен резерв. Микроорганизмите с такива свойства са били привлечени първи стопанска дейностхората преди хиляди години и е извършена спонтанна селекция на най-продуктивните форми. Сега такива естествени щамове микроорганизми, понякога след преднамерена селекция, се използват за производство на микробна биомаса (микробен протеин) като бактериални азотни торове, биопестициди, в производството на храни и други сектори на националната икономика. Основният контингент от промишлени микроорганизми обаче е представен от изкуствено селектирани щамове.
В момента в индустрията се използват три вида щамове:
1. Естествени сортове, често подобрени чрез естествена или изкуствена селекция;
2. Щамове, променени в резултат на индуцирани мутации;
3. Културни щамове, получени чрез методи на генетично или клетъчно инженерство.
Принципи на селекция на организми.Започвайки съзнателния подбор на микроорганизми, човекът си постави за цел да създаде промишлени организми със свойства, необичайни за дивите микроби. Методологически човек решава тази цел по два начина:
1. Корекция на генетичната информация на микробната клетка, изключване на свойства, които не са желани за промишлен синтез и подобряване на желаните характеристики.
2. Индукция на напълно нова информация в генетичната програма на клетката.
За да направите това, също е необходимо да разрешите следните проблеми:
1. Значително повишаване на продуктивността, характерна за даден вид микроб и неговия метаболитен продукт;
2. Генетично програмирайте биосинтезата на вещества, които са необичайни за даден вид или дори необичайни за микробния свят.
За разлика от селекцията на културни растения и домашни животни, която има хилядолетна история и богат опит, целенасочената селекция и селекция на микроорганизмите започва едва след разпознаването на микрокосмоса и се развива успоредно с постиженията на генетиката като научна дисциплина.
При подбора на който и да е жив организъм човек разчита на естествените движещи сили на еволюцията – наследствени изменения и подбор на положителни екземпляри. Въпреки това, микроорганизмите като обекти на селекция имат редица характеристики:
1. Отглеждането на микробна култура от една клетка – обичайна техника за микробен подбор – води до факта, че индивидуален клонинг (притежаващ генетична еднородност) винаги се озовава в ръцете на селекционера като изходен материал за селекция. От друга страна, един клонинг на микроорганизми бързо достига такава численост, че поради естествени мутации се превръща в популация - съвкупност от клетки с различни генотипове;
2. Повечето микроорганизми са хаплоидни, с едно копие на хромозомите, така че нямат скрита променливост, която е в основата на селекцията на висшите организми;
3. Способността за хибридизация (полово размножаване) е все още неизвестна при повечето микроорганизми от индустриално значение. Това означава, че клетъчната селекция може да се извърши само вегетативно;
4. Микроорганизмите се характеризират с изключително бърза смяна на поколенията, поради което микробиологът има много повече възможности за избор на положителни проби. Оценката на избрания микроорганизъм може да се извърши в рамките на няколко дни култивиране, за разлика от макроорганизмите, при които резултатите от работата са видими след няколко години;
5. Микробният селекционер има огромен брой индивиди за селекция, което фундаментално разширява неговите възможности, но оценката на продуктивността на всеки клонинг изисква трудоемка работа.
Културата, която ще бъде избрана, може да бъде избрана от културите, събрани в колекцията (музейни култури); могат да се използват известни индустриални производители; микробите могат да бъдат изолирани от естествени субстрати.

Идеите за биохимията и физиологията на микроорганизмите насочват селекционера към определени групи микроорганизми с най-вероятен потенциал суперсинтезаинтересно вещество. Производителите на антибиотици се срещат главно сред аскомицетните и актиномицетните гъби; суперсинтезът на аминокиселини се получава по-лесно в коринебактериите; извънклетъчните ензими често се синтезират от дрожди. Основните етапи на селекция на микроорганизми са показани на фигура 2.2.

Ориз. 2.2. Схема за селекция на микроорганизми

Таблица 2.1. Групи методи на клетъчна технология

Методи за създаване на далечно родствени хибриди

Клетъчни технологии в растениевъдството . Обогатяването на генофонда на зърнените култури може да се постигне с огромни генетични ресурситехните диви роднини. Видове зърнени култури с висока устойчивост на:

• болести и вредители,
• температурен и воден стрес,
• соленост и висока киселинност на почвите.

В развъдната работа, за да се преодолее междувидовата (или дори междуродовата) несъвместимост, се използват следните методи:

• ин витро оплождане,
• ембрионална култура,
• обратно кръстосване и други съвременни техники (Feldman and Sears, 1984).

Генното инженерство на растенията създава напълно нов механизъм на генетична променливост - трансгеноза, който, за разлика от съществуващите преди това (рекомбиогенеза, мутагенеза), се характеризира с възможността за прехвърляне на отделни гени. Вярно е, че тази функция затруднява използването на методи генното инженерствоза подобряване на редица икономически ценни признаци, унаследени полигенно. Но вече са получени химерни растения, които носят гени за устойчивост на болести, насекоми, хербициди и др. (Килчевски, Хотилева, 1997).

Дистанционна хибридизацияна култивирани зърнени култури с диви роднини, целта е да се прехвърлят единични гени или малки фрагменти от хромозоми от диви в генома на култивирани видове. Но за това е необходимо да се преодолее бариера за несъвместимост- липса на хромозомна конюгация в мейозата. В пшеницата бяха открити гени, влияещи върху хромозомната конюгация на хромозома 5B, и по този начин беше разкрита способността да се контролира този процес до известна степен.

В Мадридския университет (Испания) и Института за развъждане Макс Планк (Кьолн, Германия) метод за директен генен трансфер, което прави възможно получаването на трансгенни растения по сравнително прост начин in vivo, елиминирайки необходимостта от регенериране на растения от клетки. Най-обширната работа се извършва с бактериите Azospirillum (Postgate, 1989). В поредица от експерименти, проведени в различни щати на Индия, инокулирането на семена от пшеница, ориз, сорго и просо с ризосферни азотфиксатори осигурява увеличение на добива на зърно с до 30% (Subba Rao, 1982).

Друга важна област на съвременната биотехнология вече получи по-широко практическо приложение - избор на клеткакато метод за създаване на нови форми на растения чрез изолиране на мутантни клетки и сомаклонални вариациипри селективни условия. Клетъчната селекция е, така да се каже, развитие на мутационна селекция, но се прилага на ниво отделни клетки, използвайки in vitro технология, което му дава, от една страна, по-големи възможности, а от друга страна, създава значителни трудности поради до необходимостта от регенериране на пълноценни клетки от отделни клетки.

ПредимствоИзборът на клетки преди традиционните методи се състои от:

• липса на сезонност в работата,
• възможността за използване на милиони клетки по време на селекция,
• посока на подбор чрез използване на селективни медии,
• извършване на работа в лабораторни условия

С развитието на in vitro културата съществува реална възможност за по-широко използване на хаплоидията в отглеждането на култури. Използването на метода на клетъчната култура направи възможно регенерирането на растения от генеративни клетки, съдържащи хаплоиден наборхромозоми. Масовото производство на хаплоиди стана възможно. Практическо значениев селекция текущо получена култура прашници (андрогенеза), яйчници и яйцеклетки (гиногенеза) и хаплопродуцентния метод, което е вид гиногенеза

Конспект на лекцията

Тема 5.6. Подготовка за селско стопанство. Протеин на едноклетъчни микроорганизми

ПОЛУЧАВАНЕ НА МИКРОБНА БИОМАСА

МОДУЛ 2.

Формат на лекцията:мозъчна атака

1 Биотехнологии и растениевъдство.

2 Биотехнологии и животновъдство.

3 Технологична биоенергия.

4 Производство на фуражен протеин.

5 Използване на дрожди и бактерии.

6 Използване на водорасли и микроскопични гъби.

Проблем за решаване:области на приложение на биотехнологиите в селското стопанство.

Учениците изразяват идеи за решаване на този проблем. След това идеите се анализират от група експерименти с помощта и съветите на учителя. Правилото на мозъчната атака е, че всяка идея, дори и най-абсурдната, е забранена в момента на атаката. Всички идеи се записват от фасилитатора и се гарантира, че се преглеждат от участниците. Такава лекция активира умствената дейност на учениците и развива евристични способности.

Културните растения страдат от плевели, гризачи, насекоми-вредители, нематоди, фитопатогенни гъби, бактерии, вируси, неблагоприятни метеорологични и климатични условия. Тези фактори, заедно с ерозията на почвата и градушките, значително намаляват добива на селскостопански растения. Колорадският бръмбар и гъбата причиняват огромни щети на отглеждането на картофи. Фитофтора- причинител на ранно гниене (късна болест) на картофи.

Царевицата е податлива на опустошителни атаки от южно листно гниене, щетите от което в САЩ през 1970 г. се оценяват на 1 милиард долара.

В последните години голямо вниманиесе дават при вирусни болести по растенията. Наред с болестите, които оставят видими белези по културните растения (мозаечна болест по тютюна и памука, зимна болест по доматите), вирусите причиняват скрити инфекциозни процеси, които значително намаляват добива на земеделските култури и водят до тяхното израждане.

Биотехнологичните начини за защита на растенията от разглежданите вредители включват:

Отглеждане на сортове растения, устойчиви на неблагоприятни фактори;

Химикалиборба (пестициди), плевели (хербициди), гризачи (ратициди), насекоми (инсектициди), нематоди (нематоциди), фитопатогенни гъби (фунгициди), бактерии, вируси.;

Наред с растителната защита, задачата е да се повиши производителността на селскостопанските култури, тяхната хранителна (фуражна) стойност и да се създадат сортове растения, растящи на солени почви, в сухи и блатисти райони. Разработките са насочени към повишаване на енергийната ефективност на различни процеси в растителните тъкани, от абсорбцията на кванта на светлината до асимилацията на CO 2 и водно-солевия метаболизъм.

Повечето биомедицински изследвания се извършват върху клетки инвитро(т.е. не върху жив организъм, а върху клетки „ин витро“). Клетките се използват като модел на биологичен обект в научни изследвания, тестване и производство на лекарства. Освен това учените са се научили да коригират генетичните грешки в клетките и да им дадат способността да устояват на определени заболявания, което служи като основа за бъдещи медицински технологии - генни и клетъчни терапии. Тази статия ще обсъди методите за работа с клетки, както и възможностите и ограниченията, свързани с тяхното използване.

Генералният партньор на цикъла е компанията: най-големият доставчик на оборудване, реактиви и Консумативиза биологични изследвания и производство.

Партньор за тази статия -

Един жив обект се състои от по-малки компоненти: органи, тъкани, клетки, органели, биомолекули и в същото време е част от по-големи системи - като хранителни вериги, екосистеми, общности. Дори Хипократ и Аристотел са се чудили за връзката между цялото и неговите части и са се съгласили с разбирането, че цялото е повече от сбора на частите. въпреки това съвременна наукаразчита почти изцяло на алтернативен принцип – редукционизма – според който познаването на цялото се осъществява чрез познаване на съставните му части. При този подход се губят връзките между частите, в нашия случай между клетките. Въпреки че всяка клетка по същество също е едно цяло, извън тялото вече не е точно същата клетка, която е била в неговия състав. Какво се променя с този преход?

Ясна илюстрация се предоставя от слузестите плесени. Тези едноклетъчни организми имат способността да комбинират десетки хиляди клетки в плазмодий, които в търсене на храна могат да се движат бързо и да хвърлят спори на голямо разстояние, след което отново да се разпадат на отделни клетки (видео 1). Много бактерии също имат способността да образуват плътни конгломерати - биофилми, или биофилми, в които вътрешните клетки са защитени от външни от околната среда. Тоест асоциирането в многоклетъчни структури води до появата на нови функции, които липсват в отделните клетки. Конкурентните предимства чрез придобиване на нови способности предизвикаха обединяването на едноклетъчните организми в многоклетъчни преди около 1 милиард години.

Видео 1. Dictyostelium discoideum- едноклетъчна слузеста плесен.Когато слузестите плесени търсят храна, отделните клетки се обединяват и образуват плазмодий с дължина до 2 мм.

В многоклетъчните организми клетките съществуват в неразривна връзка една с друга в продължение на стотици милиони години еволюция и през това време те са били напълно реорганизирани, за да изпълняват специфични функции. Спектърът от гени, експресирани от една клетка, нейните функции и активност, форма и размер, скорост на делене и смърт се регулират от връзки с други клетки на тялото. При бозайниците тази връзка се основава на всякакви сигнали: химически (хормони, цитокини, растежни фактори, хранителни вещества, кислородни производни, метални йони и др.), механични и електрически (предавани от неврони) (фиг. 4).

Фигура 4. Основни типове клетъчно-клетъчни взаимодействия.В тялото клетките са тясно свързани помежду си и техните дейности са строго координирани. За тази цел се използват: електрически сигнали ( по-горе), предавани от неврони, химически сигнали ( по средата), предавани по кръвен път (ендокринни) или междуклетъчна течност(паракрин), както и механични сили ( отдолу). Тези връзки съществуват както между съседни клетки, така и между дори най-отдалечените клетки на тялото. Клетката преобразува входящите сигнали в инструкции за промяна на спектъра на активните гени и следователно свойствата на самата клетка.

Междуклетъчната комуникация е в основата на процесите, изучавани от почти всички медицински дисциплини, по-специално от ендокринологията, неврологията, кардиологията, хематологията и др., но все още не се говори за пълно дешифриране на тези взаимодействия. Ако една клетка в тялото е нарушена в нормалните си връзки с околната среда, тя или умира (за това има специални механизми за самоунищожение - апоптоза и аноикис), или става „асоциална“, тоест ракова. При изолиране от тялото и прехвърляне в петриево блюдо клетките също губят почти всички външни връзки, но при благоприятни условия живеят и се делят известно време (но могат да станат и ракови).

В новите, изкуствени условияклетките запазват само генома, а всички други свойства се променят - размер, скорост на растеж, генна експресия, функционална активност, чувствителност към лекарства, метаболизъм, мембранен състав и други. В тази връзка днес има активно търсене на условия инвитро, които максимално възпроизвеждат условията in vivo. Повечето телесни тъкани съдържат няколко типа клетки, имат сложна структура на извънклетъчния матрикс и са проникнати от мрежа от съдове и нерви (фиг. 5). Напълно пресъздайте такава архитектура инвитровсе още не е възможно, което означава, че клетките в културата все още остават само приближение на клетките в тялото.

Фигура 5. Сложна организация на съединителната тъкан in vivo състоящ се от: няколко вида клетки (фибробласти, мастни клетки, макрофаги и други левкоцити), няколко вида влакна (1 - еластични, 2 - ретикуларни и 3 - колагенови), нерви и съдове, затворени в хидрогел от полизахариди.

Клетъчно изолиране и култивиране

Източник на клетки може да бъде всяка тъкан в тялото. В повечето тъкани клетките се намират в т.нар извънклетъчен матрикс, който разделя тъканта на региони и оформя нейната архитектура (фиг. 5 и 6). Екстрацелуларният матрикс се състои от протеини, които образуват фибрили: колаген, фибронектин, еластин и протеогликани с дълги полизахаридни разклонения (гликозаминогликани). Последните перфектно задържат течността и образуват така наречения хидрогел в по-голямата част от извънклетъчното пространство. В случай на кост, матрицата се формира от кристализиран калциев фосфат. Най-често срещаният човешки протеин е колагенът: той представлява до 30% от масата на всички протеини в тялото. Компонентите на матрицата се синтезират от много клетки, но фибробластите са специализирани в това.

Фигура 6. Как изглеждат тъканите под микроскоп:интравитална многофотонна микроскопия различни областикожа, съдържаща отпусната ( А ) и плътен ( b ) съединителни тъкани, мускулест ( V ) И нервни влакна (Ж ), мастни клетки ( д ) и микровезикули ( д ). Колагеновите влакна са показани в червено (с изключение на V ), кръвоносни съдове - зелени, клетки и микровезикули - сини (на b - зелен). Размерна скала: 50 µm. За да видите снимката в цял размер, щракнете върху нея.

За да се изолират клетките, е необходимо да се разруши извънклетъчната матрица и да се разрушат връзките между клетките, след което клетките се „разпръскват“ (фиг. 7). Клетъчна култура може да се получи и по друг начин: като се постави цяла част от тъканта в културална среда, след което някои от клетките постепенно ще изпълзят и ще засят околното пространство. Този тип култура се нарича експлант. Изолирането и манипулирането на клетките обикновено се извършва в специална стерилна кутия - капак с ламинарен поток (фиг. 8). А ).

Фигура 7. Схема на изолиране на клетки от тъкан.Тъканен фрагмент, получен интравитално (чрез биопсия) или след смъртта, се раздробява механично и се третира с протеолитични ензими, които разграждат извънклетъчния матрикс (трипсин, колагеназа, хиалуронидаза, папаин или комбинации от тях). В допълнение към ензимите се използват калций-свързващи съединения (хелатори), които отнемат калций от клетъчните адхезионни молекули и отслабват връзката им помежду си и с извънклетъчния матрикс. Добавянето на DNase предотвратява слепването на клетките в лепкави съсиреци поради електростатични взаимодействия с ДНК, освободена от увредени клетки. След това клетките се отделят от матрични фрагменти (отломки) чрез центрофугиране и/или филтриране и се засаждат в колби за култура или петриеви панички.

Някои тъкани нямат извънклетъчен матрикс или клетките не са свързани с него, което значително опростява процедурата за изолиране. Това се отнася главно за кръвните клетки и техните прекурсори, намиращи се в костния мозък. Поради лесното изолиране и запазване на повърхностните молекули за тези клетки, разнообразието от видове и пътищата на тяхното образуване от кръвни стволови клетки (хемопоетични СК) са най-добре проучени.

След изолиране клетките се поставят в хранителна среда и се отглеждат в петриеви панички или колби в атмосфера на въглероден диоксид (5% CO 2 ) и близо до 100% влажност в CO 2 инкубатори (фиг. 8). b ). Хранителната среда се състои от физиологични соли, pH буфер, аминокиселини, витамини и глюкоза, както и фактори за растеж на протеини и хранителни вещества (вижте карето по-долу). Индикаторът фенолно червено, добавен към средата, ви позволява да наблюдавате визуално pH и придава на средата червен цвят.

Фигура 8а. Основното оборудване за културна работа е ламинарен шкаф.Шкафът с ламинарен поток осигурява равномерен вертикален поток от стерилен въздух, предпазвайки клетъчната култура от микробно замърсяване.

Фигура 8b. Основното оборудване за културна работа е CO 2 инкубатор. Въглероден двуокисв CO 2 инкубатор, първо, ви позволява да възпроизведете по-добре условията in vivo, и второ, необходимо е да се поддържа рН на средата, в която по правило се използва буферна система, зависима от бикарбонат CO 2 . Инкубаторът поддържа влажност близо до 100%, което предотвратява изпаряването на течността и концентрацията на нейните компоненти.

Растеж на протеини и хранителни фактори

Протеиновите фактори са най-деликатната област при култивиране на клетки. Най-често срещаният източник на тези фактори е животински серум, обикновено фетален телешки серум, по-рядко конски серум или от същото животно като самите клетки. Клетките се допълват с филтриран цял серум, разреден до 1–10%. При изследване на ефекта на каквито и да е вещества върху клетките (растежни фактори, протеинови хормони, цитокини), серумът създава силен фон, който трябва да бъде намален чрез отглеждане на клетки без серум (депривация) за 2–72 часа преди експеримента. Използването на серум е почти невъзможно да се стандартизира и е потенциален източник на инфекция, което значително ограничава използването му в производството на биомедицински продукти. Алтернатива на суроватката са протеинови добавки със стандартен състав, направени от пречистени и рекомбинантни протеини.

Проблеми на култивирането и възпроизводимостта при експерименти с живи клетки (решения от Diaem)

Някои култури са много чувствителни към външни влиянияили колебания в химическия състав на околната среда, което повдига редица въпроси:

• Как да осигурим условия за отглеждане инвитродо условия, сравними с тези in vivo? Някои процеси, протичащи в живите организми, изискват създаването на специални условия (микросреда) за клетките.
• Как да организираме дългосрочен експеримент и да наблюдаваме във времето? Клетъчните култури са идеален обект за дългосрочни експерименти. Но възниква проблемът с хомеостазата на околната среда: клетките непрекъснато консумират хранителни вещества и освобождават метаболити. Ако проблемът се реши чрез проста смяна на културалната среда, тогава концентрацията на вещества в средата между замените няма да бъде постоянна. В допълнение, клетъчната култура ще трябва редовно да се изважда от инкубатора, за да се смени средата или да се наблюдава под микроскоп.
• Как да предпазим клетъчна култура от замърсяване с бактерии, микоплазми и гъбички, които могат да провалят всички усилия за изолиране на клетки от тъканите?
• Как да постигнем възпроизводимост на експеримент? Клетките са живи обекти, чието поведение може да бъде повлияно дори от незначителни фактори: често отваряне на вратата на инкубатора, различно временаличието на култура извън инкубатора, осветление при наблюдение на култури под микроскоп - всичко това може да окаже значително влияние върху появата на артефакти в експеримента. Така че втората задача е да се постигне стабилност на експерименталните параметри.

Решение:

Раковите клетки, дори в тялото, са много различни от нормалните, а в културата тази разлика само се увеличава. По този начин много ракови линии имат увеличен брой хромозоми (анеуплоидия), което ги прави по-устойчиви на увреждане на ДНК. В допълнение, много видове рак се причиняват от вирусни инфекции, които се предават на клетъчни култури, което не позволява използването на тези клетки при производството на ваксини (виж по-долу). В това отношение линиите от „нормални“ - неракови - клетки са широко търсени във фармакологията и научните изследвания.

Именно производството на ваксини послужи като основен мотив за получаване на култура от „нормални“ клетки. За тази цел Леонард Хейфлик (фиг. 10 b ) изолира клетки от абортивен материал и открива наличието на ограничение на броя на клетъчните деления в културата, наречено ограничение на Хейфлик. За човешките клетки тази граница е 50-70 деления и се дължи на скъсяване на теломерите, основен механизъм на клетъчното стареене.

През 1965 г. Хейфлик получава белодробна фибробластна линия WI-38 (Фиг. 10 А ), който е смъртен, но е произведен и замразен в достатъчни количества, за да подпомогне изследванията по света до ден днешен. Поради човешкия си произход, липсата на вирусни инфекции и ракова трансформация, тази линия е намерила широко приложение в производството на ваксини. Сега обаче фармацевтичните компании се опасяват, че ограниченият ресурс на тази линия няма да им позволи да завършат започнатите изследвания и преминават към други линии. В момента тази линия се използва широко за изследване на молекулярните механизми на стареене.

Има някакъв компромис между ракови и нормални увековечениклетки: получени от нормална тъкан, те са придобили способността да претърпят неограничен брой деления. Такъв преход към безсмъртие може да възникне спонтанно или в резултат на изкуствено въвеждане на определени гени или сливане с ракови клетки, както в случая хибрид. Онкогените могат да дадат „безсмъртие“ на клетките: голям Т-антиген на вируса SV40, H-Ras, c-myc, E1A. Тези гени по същество причиняват туморна трансформация на клетки с всички съпътстващи недостатъци (геномна нестабилност, загуба на физиологични функции и т.н.). Най-деликатният и все по-широко разпространен метод за обезсмъртяване е въвеждането в клетката на гена за теломеразната обратна транскриптаза (TERT), който завършва теломерите и предотвратява тяхното скъсяване по време на деленето (фиг. 11). Нобеловата награда за физиология или медицина беше присъдена през 2009 г. за откриването на теломераза.

Въпреки че такава трансдукция също е по същество онкогенна, тя позволява по-добро запазване на физиологичните функции и по-малко дестабилизиране на генома в сравнение с трансдукцията с други онкогени. Също така си струва да се отбележи, че този метод не работи за всички клетки: например не работи за Т и В клетки.

Фигура 11. Краищата на хромозомите - теломерите - се скъсяват с всяко клетъчно делене,и когато се изчерпят, в клетката се задейства механизъм за самоунищожение. Теломерите при гръбначните се състоят от повтарящи се нуклеотидни последователности TTAGGG. При всяко делене тези участъци се съкращават, но теломераза TERT осигурява своя собствена едноверижна ДНК като матрица, с която синтезира първо една верига, а след това ДНК полимеразата завършва втората верига на теломерната ДНК. По този начин теломераза е в състояние да поддържа клетъчното безсмъртие.

Диференцирани клетки(които са придобили окончателната си специализация) съставляват по-голямата част от клетките на тялото и практически не се делят. Като основни компоненти и „работни коне” във всички органи и тъкани, те служат като мишена на действие на повечето лекарства, което ги прави много популярни за изследване. Те могат да бъдат получени в култура чрез насочена диференциация плурипотентни стволови клеткив желания тип клетка (вижте по-долу), но този път има значителни технически, а в случая на човешките клетки също и етични трудности.

Най-често срещаните диференцирани клетъчни култури са първични клетъчни култури- клетки, изолирани от зряла тъкан и непасирани инвитро(фиг. 12). Броят на деленията на такива клетки зависи критично от условията на култивиране, но рядко възлиза на повече от 5–10 пъти. Изключенията са стволови, прогениторни и някои специализирани клетки, например активирани Т и В лимфоцити. В допълнение, при продължително култивиране, първичната култура е склонна към заместване с фибробласти.

Много изследвания се провеждат специално върху първични клетъчни култури, които имат редица предимства в сравнение с раковите и обезсмъртените клетки:

1. Те пасват на клетките много по-добре in vivo: невроните провеждат електрически импулси, хепатоцитите отделят албумин, макрофагите фагоцитират бактерии и др.
2. Ако говорим за животински клетки, те са лесно достъпни, ако имате вивариум - остава само да ги набавите (което обаче е доста трудоемко). Наличието на човешки клетки се определя от вида тъкан: култури от ендотелни клетки от пъпната вена (HUVEC, фиг. 12d) и мезенхимни стромални клетки от мастна тъкан, източниците на които са странични продуктисъответно акушерство и хирургия.
3. Те носят генотипа на донора и следователно могат да се използват за изследване на причините за патологиите при конкретен пациент на молекулярно ниво.

Клетъчни култури от хора, мишки, плъхове, зайци и други животни се събират в колекции, съхранявани в течен азотпри температура от −196 °C (фиг. 13 А ). Най-пълната колекция - ATCC в САЩ - съдържа повече от 4600 еукариотни клетъчни култури. В Московския държавен университет сега създават хранилище на живи системи, уникално по своя мащаб, „Ноев ковчег“, в което сред всички видове образци на живи обекти има и животински и човешки клетки (фиг. 13). b ). Някои институти също имат свои собствени колекции: например в Института по биоорганична химия на Руската академия на науките колекцията е организирана на принципа на облачно хранилище с общ журнал и клетки, разпределени между различни лаборатории.

Могат да бъдат закупени клетъчни линии от колекциите; съществуват за почти всеки тип тумор и здрава тъкан и са описани подробно. Това ви позволява да изберете най-подходящите линии за конкретно изследване и да сравните резултатите с тези, получени преди това във вашата или в други лаборатории.

Diaem: всичко необходимо за работа с клетъчни култури

Оборудване за клетъчни технологии:

Културална пластмаса, среда, серум, заместители, добавки:

Материал предоставен от нашия партньор - фирма Диаем

Използване на клетки в научни изследвания

Клетъчните култури са преди всичко инструмент за научно изследване. Какви възможности предоставя този инструмент и за какво може да се използва? За клетките в култура има богат арсенал от методи за манипулиране и анализ: някои са включени в 12-те метода на този специален проект, а много други са описани в отделни статии за Biomolecule. Тук ще обсъдим накратко основните, но преди това ще обсъдим уникалните предимства на клетъчните култури като моделни обекти.

За разлика от клетките в тялото, за клетките в културата изследователят напълно определя външните условия. Въпреки че тези условия често не отговарят на условията in vivo, възпроизводимостта и контролът позволяват провеждането на прецизни експерименти и разкриването на реакцията на клетките към специфични стимули. Тази възможност е уникална за изучаване на вътреклетъчните процеси, но трябва да помним това, а не по-силни клеткиколкото клетките в културата се различават от клетките в тялото, толкова по-вероятно е механизмите на тези процеси също да се различават.

Клетката не съдържа разреден разтвор, използван в биохимични и структурни изследвания, а много плътна и богата микросреда ( претъпкана среда) (фиг. 14 и видео 2). В резултат на това дейностите на молекулите в изкуствен разтвор и „в реалния живот“ понякога се различават с няколко порядъка. Ето защо клетката е много по-адекватен модел при изучаване на активностите и взаимодействията на биомолекулите и при анализиране на ефекта на потенциални лекарства върху таргетните молекули във фармакологията.

Видео 2. Триизмерна реконструкция на различни вътреклетъчни структури в срез от Фигура 14.подпис

Жълто - ендоплазмен ретикулум, синьо - свързани с мембрана рибозоми, оранжево - свободни рибозоми, светлозелени нишки- микротубули, сини - везикули с плътна сърцевина, бели - клатрин-отрицателни везикули, светлочервени - клатрин-съдържащи везикули, лилаво - клатрин-отрицателни компартменти, кухини със светло и тъмнозелени вътрешни и външни повърхности - митохондрии. Не са показани отделни молекули и малки комплекси.

Как да доставим ген в клетка?

Ако молекулата, която ни интересува, е протеин, тогава най-лесният начин да я поставим в клетка и да я изследваме е да я принудим да се синтезира директно „на място“, като въведем гена за този протеин в клетката. Има много методи за доставяне на гени в клетките (фиг. 15), и двата базирани на чисто физикохимични принципи ( трансфекция), и използване на вируси като носител ( трансдукция).

Ефективност трансфекциязависи значително от типа на клетката и техниката: за ракови и обезсмъртени клетки обикновено е 30–80%, но за първични клетки рядко е повече от 10%. Изключение е методът на електропорация, който понякога позволява високоефективно доставяне на ген до първични култури. Химични методитрансфекциите не са предназначени да интегрират въведения ген в генома на клетката и с течение на времето въведената ДНК се губи.

Малка част от ДНК все още може да се фиксира в генома по време на трансфекцията и да бъде наследена, което прави възможно получаването на линия със стабилна експресия на въведения ген. Селекцията се извършва чрез избиране на такива клетки за антибиотична резистентност (заедно с изследвания ген обикновено се вмъква ген, който осигурява такава резистентност) или чрез използване на няколко цикъла на клетъчно сортиране.

Фигура 15. Методи на трансфекция и трансдукция.За да се въведе ген в клетка, е необходимо да се преодолее външната мембрана. Най-често за целта се използват наноразмерни комплекси от ДНК с липидни везикули (липофекция), полимерни носители или калциеви кристали, които сами се абсорбират от клетката. Можете също така временно да перфорирате мембраната с помощта на електрически разряд - електропорация. В случаите, когато генът трябва да бъде въведен само в няколко клетки (например при изследване на единични неврони), се използва методът на микроинжектиране. При трансдукцията се използват вирусни частици, в които вместо част от собствения геном се поставя необходимия ген. В същото време вирусите запазват способността си да проникват в клетките, ефективно да доставят гена до ядрото и, в случай на някои вируси, да го интегрират в ДНК на клетката.

Вирусни методи трансдукцияимат редица предимства пред трансфекцията: висока ефективност по отношение на първичните клетъчни линии, възможност за вмъкване на гена в генома, приложимост in vivoи селективност на действието на вирусите върху определени видове клетки и тъкани.

За трансфекцията се създават изкуствени вирусни частици, които външно са подобни на естествените вируси и проникват в клетката, използвайки същите механизми. Но вътре, вместо част от собствената си ДНК, те носят нужните на изследователя гени и са лишени от програма за самовъзпроизвеждане (тоест такива частици не са заразни). Днес около дузина конструкции на генното инженерство, базирани на различни вируси, се използват широко. За да се промени селективността на вирусните частици, те могат да бъдат допълнително модифицирани с определени повърхностни молекули.

Редактирайте това

Възможностите на клетъчните технологии вече достигат ново ниво след неотдавнашния пробив в методите за редактиране на генома, базирани на системата CRISPR/Cas-9. Техниката вече се използва активно и комплекти за селективно отстраняване на определени гени от клетки (генетичен нокаут) са налични в търговската мрежа. Предимството на CRISPR/Cas-9 е неговата простота в сравнение с наличните преди методи за редактиране на генома (цинкови пръсти, TALEN). Използвайки CRISPR/Cas-9, можете не само да изтривате и изключвате гени, но и да ги променяте и възстановявате. Днес големи надежди се възлагат на CRISPR/Cas-9 при лечението на моногенни наследствени заболявания.

Нека бъде светлина

Относителната лекота на въвеждане на желаните гени в клетките отваря достъп до богатите възможности на може би най-мощния инструмент на молекулярната биология днес - генетично кодираните флуоресцентни протеини. Те ви позволяват да проследявате отделни клетки в тялото и дори молекули в клетките, да оцветявате определени органели, да изучавате междумолекулни взаимодействия и конформация на протеини, да измервате концентрациите на вторични посредници (Ca 2+, H 2 O 2, cAMP, H +, ATP/ ADP, NADH и др.), визуализират и определят активността на различни протеини.

В допълнение, през последните пет години оптогенетиката стана широко разпространена - метод, при който, използвайки генетично кодирани светлочувствителни протеини, можете да контролирате клетъчните процеси с висока времева и пространствена разделителна способност, буквално чрез насочване на лазер в желаната област (фиг. 16).

Фигура 16. Оптогенетични конструкциипозволи използването на лазер за дадена точкаклетки и стартира различни процеси в даден момент: 1 - йонен ток през мембраната и електрически импулси, 2 - генна активност, 3 - протеинова активност, 4 - рецепторна активност и предаване на сигнал в клетките, 5 - абсорбция на вещества отвън, 6 - взаимодействия между протеини, 7 - движение на вътреклетъчни везикули, 8 - синтез и разграждане на протеини, 9 - митохондриална дихателна верига и клетъчна смърт, 10 - предаване на сигнал от вторични посредници.

Флуоресцентните протеини и оптогенетиката показват пълния си потенциал, когато са съчетани със съвременни техники за флуоресцентна микроскопия. Тези методи са постигнали чувствителност на единични молекули с пространствена разделителна способност от няколко десетки нанометра и с времева разделителна способност до няколко десетки микросекунди (фиг. 17). Въпреки че тази пространствена разделителна способност е по-ниска от тази на електронната микроскопия, наличието на времева разделителна способност (т.е. приложимост към живи клетки) и способността да се анализират множество молекули едновременно правят методите на оптичната микроскопия уникални за широк спектър от приложения.

Фигура 17. Пространствена и времева разделителна способност на модерни техники за оптична микроскопия с висока разделителна способност. Обозначения: FRET - Forster resonant energy transfer (Форстър резонансен енергиен трансфер); SPT - single particle tracking (микроскопия на траектории на единични частици); PALM/STORM - фотоактивираща локализационна микроскопия/стохастична оптична реконструкционна микроскопия (фотоактивирана локализационна микроскопия/стохастична оптична реконструкционна микроскопия); STED - stimulated emission depletion (stimulated emission suppression microscopy); FCS - флуоресцентна корелационна спектроскопия (флуоресцентна корелационна спектроскопия); TIRF - пълно вътрешно отражение (микроскопия на пълното вътрешно отражение); SIM - структурна осветителна микроскопия; - конфокална микроскопия (конфокална микроскопия).

Въвеждане и сортиране

Друг мощен метод, който се отнася само за клетките инвитроИ ex vivo(веднага след избора), е поточна цитометрия- индивидуално изследване на клетки в поток от течност: клетките една по една преминават през лазерния лъч, а специални детектори улавят сигнала за флуоресценция и разсейване на светлината от клетката, осветена от лазера. За разлика от микроскопията, това е първоначално количествен метод, т.е. позволява точно измерване на интензитета на флуоресценция и има висока производителност: скоростта на обработка достига милион клетки в минута. Това позволява „преброяване“ на хетерогенни клетъчни популации, които са първични клетъчни култури. По-специално, няма алтернативи за него при идентифициране, преброяване и сортиране на редки клетки в популация, като стволови клетки или антиген-специфични лимфоцити, от които може да има само няколко клетки на милион. Цитометрията е най-разпространена в имунологията за анализ на субпопулации от левкоцити, без да ги прехвърлят в култура. Важен тип цитометрия е сортирането на поточни клетки, което позволява не само да се анализират, но и да се изолират отделни субпопулации от хетерогенни клетъчни смеси с чистота над 99%.

От клетки към организми, използващи стволови клетки

Преди това разгледахме традиционните методи за работа с клетки, много от които бяха предложени през втората половина на миналия век. По онова време това бяха авангардни технологии, които впоследствие допринесоха значително за развитието на биомедицинските науки и молекулярната биология и сега са част от рутинната лабораторна практика. Днес напредналите клетъчни технологии позволяват постигането на впечатляващи резултати. Но в научните и особено в научно-популярните статии авторите често са склонни да преувеличават мащаба на откритието и да премълчават трудностите и ограниченията. Това създава донякъде изкривена картина, в която вече днес някъде има лекари, които отпечатват органи на 3D принтер, спасяват хора от ХИВ и слепота и са в състояние да излекуват почти всеки рак. Наистина, успехът на клетъчните технологии ни позволява да се надяваме, че това наистина ще стане възможно в бъдеще, но засега водещите експерти призовават да не бързаме с прогнозите, тъй като тялото и тъканта са много по-сложни от просто сбора от съставните им клетки .

Ембрионални стволови клетки

Фигура 20а. Стимулиране на образуването на ембриоидни тела в суспендирани капки.

Фигура 20b. Култивиране на клетки в камера на Максимов.При него върху малко покривно стъкло се поставя капка с парче тъкан или клетки. С помощта на капка вода и капилярни сили, малкото покривно стъкло се прилепва към голямото, което от своя страна се поставя върху основата и се запечатва с парафин.

Основна информация за работа с клетъчни култури от Diaem

Искате ли да научите повече за тънкостите на работата с клетъчни култури или да видите как е организирана една клетъчна лаборатория?

Допълнителна информация по темата „Клетъчни технологии“.