Защо в онкологията се прави изследване на риба? Откриване на рак на гърдата: как да не пропуснете коварна болест? Противоречие на теста за FISH

Предлага се от клиника Assuta. Флуоресцентната хибридизация, известна още като FISH, е генетичен тест, който дава представа за природата на тумора. Чрез изследване на тумор с помощта на FIS, лекарят ще разбере дали ракът е положителен или отрицателен за HER2 гена. Копия на гена, налични в клетките на тялото, стимулират растежа на атипични ракови клетки. След завършване на диагнозата лекарят ще може да изготви по-подробен план за лечение.

Модерният лабораторен комплекс на клиниката Assuta провежда FISH анализ за оценка на патологиите на рака на гърдата:

• Уникалното изследване дава точна представа за естеството на тумора и неговите характеристики.
• Една частна болница има мощни ресурси за постигане на резултати.
• При нас работят най-добрите лекари в Израел, диагностиката и терапията се извършват по индивидуални схеми.

Обадете се, за да разберете как да кандидатствате за лечение. Възстановете здравето си в най-голямата болница в Близкия изток.

Запишете се за консултация

Рибен тест за рак на гърдата - механизмът на развитие на онкологията

HER2 генните рецептори са отговорни за производството на HER2 протеини, които са рецептори, присъстващи в злокачествените клетки. Когато рецепторите се активират, раковите клетки получават сигнал за делене и размножаване. Обикновено HER 2 рецепторите регулират растежа на клетките на гърдата, поддържайки баланса на здравето в тъканите.

Въпреки това е доказано, че генът HER 2 се произвежда свръхпродукция при всеки пет случая на рак. Това означава, че вместо да има едно копие на гена, човек има ген от всеки родител. Това обяснява излишъка от HER рецептори в тялото, причиняващ неконтролиран и агресивен растеж на тумора.

Необходимо е да се подложи на рибен тест за рак на гърдата, за да се установи до каква степен причината за развитието на патологията в тялото е свързана с ненормалното производство на рецептори. Трябва да знаете дали типът рак е HER2 положителен или отрицателен. Има лечения, специално предназначени за HER 2 позитивен рак на гърдата. Анализът ви позволява да не губите време в търсене на ефективни методи за въздействие.

Когато се извършва реакция на риба за рак на гърдата, лекарят използва субстанции за оцветяване на профила, за да визуализира хромозомни аномалии. Разтворът, приложен върху изследваната тъкан, позволява да се видят аномалии. Предимството на FIS анализа е, че той може да открие генетични аномалии, които са твърде малки, за да бъдат изследвани под микроскоп с алтернативни методи.

Друго предимство на изследването е, че пациентът получава резултатите след няколко дни, докато други методи дават резултат едва след няколко седмици. В допълнение към определянето на злокачествен тумор на млечната жлеза, тестът за риба се използва при диагностицирането на раковата патология на пикочния мехур, при определянето на левкемия.

Видове анализи

За да определят положителния или отрицателния характер на HER2, лекарите от клиниката Assuta насочват пациента за изследване в собствената си лаборатория. Има два вида тестове:

• Имунохистохимия – IHC открива големи количества протеин. По време на теста патолог изследва тъкан под микроскоп, като използва специални оцветители. Не се изисква допълнително тестване за резултат 1+ или резултат 0. Резултат от 2+ се счита за неопределен и изисква допълнително тестване. Резултат 3+ потвърждава негативния сценарий.
• MOG тестът (хибридизация) е следващата стъпка, ако се подозира рак. Важно е анализът да се извърши от опитен патолог, което ще елиминира грешките при тълкуването на получените резултати. Има два основни типа тестове - тестване с риба за рак на гърдата и тестване със светло поле. Положителният рибен тест е окончателният диагностичен метод.

Много рядко анализът на рибата е неясен или двусмислен. При такива обстоятелства е необходима още една биопсия и нов рибен тест за рак на гърдата, за да се потвърди диагнозата.

Как се провежда тестът с риба при рак на гърдата - ръководство за пациента

За да диагностицира правилно HER 2 статуса, лекарят извършва биопсия, по време на която се отстраняват проби от тъкани, променени от патологията. В повечето случаи се използва локална анестезия, за да се неутрализира всеки дискомфорт. Впоследствие извлечената тъкан се изпраща за изследване в лабораторията, където с нея работи патолог. Много е важно лабораторията да е авторитетна в медицинската среда, защото животът на пациента зависи пряко от правилната диагноза. Доказано е, че рибният тест за рак на гърдата е безопасна процедура. Не изисква много време, отделни процедури освен биопсия и допълнителна тъканна травма.

Защо изобщо се извършва IHC тест? Това е по-просто и по-достъпно. Въпреки това, ако тестовете са неубедителни, тестът FISH е задължителен. В редки случаи може да е възможна повторна биопсия с вземане на проби. Но това всъщност се случва изключително рядко. Ако рибният тест за рак на гърдата покаже положителен HER2 резултат, ще Ви бъде дадено ефективно лечение за HER2 позитивен рак. Въпреки че това е агресивна форма на заболяването, перспективите за хората, диагностицирани с него, се подобриха значително през последните години. Това се дължи на нови и ефективни лечения за рак на гърдата в Израел, които са насочени към HER 2 рецепторите.

Кандидатствайте за лечение

Ракът на гърдата (РМЖ) е често срещан вид онкология и, за съжаление, все още не е разработен нито един метод на лечение, който да дава пълна гаранция за излекуване. Затова най-доброто решение за пациента е профилактиката и навременната диагностика на рака на гърдата. Рибният анализ за рак на гърдата е най-модерният метод за изследване, който ви позволява да насочите лечението на пациента по най-правилния път.

Въпреки огромния натрупан опит в изследването и лечението на това заболяване, медицината все още не е в състояние да посочи външните фактори, които причиняват злокачествен тумор на млечната жлеза. Нито един от известните канцерогени не може надеждно да се свърже с появата на това заболяване. Съвременните диагностични методи като цяло дават добри резултати и позволяват точно да се определи наличието или отсъствието на заболяването и етапа на развитие. Въпреки това, не всички от тях предоставят изчерпателна информация, която ви позволява точно да предписвате лечение.

1. Пълна кръвна картина - проверява нивото на белите кръвни клетки, скоростта на утаяване на еритроцитите и хемоглобина. Първите два показателя се увеличават в онкологията, последният, напротив, намалява. Този анализ обаче ни позволява да преценим само наличието на определени проблеми в тялото. С негова помощ е невъзможно да се постави точна диагноза „рак на гърдата“, особено в ранен стадий на развитие на тумора.
2. Биохимия - определя нивото на ензимите и електролитите, което ни позволява да преценим наличието на метастази. Тези данни обаче не винаги са обективни. Това изследване също така показва наличието на определени туморни маркери в кръвта, които помагат да се проследи наличието на раков тумор и неговото местоположение.
3. Спектралният анализ ви позволява да определите наличието на рак с вероятност над 90%, включително на ранен етап.Методът се основава на изследване на кръвта под инфрачервено лъчение, което ви позволява да определите неговия молекулен състав.
4. Биопсия - извършва се чрез вземане на тъканна проба от гърдата и допълнителен цитологичен анализ, който определя наличието на ракови клетки и техния брой, който зависи от степента на развитие на заболяването.
5. Генетичното изследване определя предразположеността на пациента към развитие на рак на гърдата.То се извършва чрез откриване на определени гени в кръвта, които са отговорни за предаването на рака от поколение на поколение.

Но най-новият и ефективен метод за изследване днес е така нареченият FISH тест. Съкращението в превод от английски звучи като „вътреклетъчна флуоресцентна хибридизация“.

Phish тестването е сравнително нов метод - използва се от 1980 г. Но въпреки сложността и високата си цена, той успя да спечели положителни отзиви както от лекари, така и от пациенти, които благодарение на него успешно се отърваха от рака.

Ген, наречен HER2, е отговорен за растежа на клетките на гърдата в човешкото тяло. Името в превод от английски означава човешки естрогенен рецептор - 2. Обикновено рецепторите на този ген произвеждат HER2, протеин, който регулира деленето на клетките на жлезата. Раковият тумор (обикновено карцином) в началото си „измамва“ този ген, принуждавайки го да расте допълнителна тъкан, която ще бъде използвана от тумора за неговото развитие. Тази аномалия се среща в приблизително 30% от случаите и се характеризира с термина „амплификация“.

По този начин самият организъм на пациента подпомага развитието на рака. Ако този процес не бъде спрян, тогава дори най-модерните и мощни методи на лечение може да не помогнат на пациента.

Тестването за амплификация на HER2 ген обикновено се извършва на два етапа:

• IHC (имунохистохимичен тест);
• директен FISH анализ (флуоресцентна хибридизация).

Под местна анестезия на пациента се прави биопсия - вземат се тъканни проби, които се изпращат в специализирана лаборатория.

Първата стъпка обикновено е имунохистохимия, микроскопски анализ на проба от ракова тъкан. Той определя фундаменталното присъствие на гена HER2 в туморната тъкан. Това изследване е много по-евтино от рибния тест, а също така е по-лесно и по-бързо за провеждане. Толкова точна информация обаче не дава.Резултатът се определя в числа от нула до три точки. Ако резултатът е по-малък или равен на единица, тогава HER2 генът липсва в тумора и няма нужда от допълнителни изследвания. От две до три точки - гранично състояние, над три - злокачественото образувание е в процес на растеж и е необходимо да се премине към втори етап на диагностика.

Рибният тест за рак на гърдата се извършва по следния начин: в кръвта се въвеждат елементи от ДНК молекули (дезоксирибонуклеинова киселина), маркирани със специално багрило. Тези маркери се вмъкват в ДНК молекулите на пациента и определят дали и какво ниво на амплификация на HER2 възниква. Анализът се извършва в реално време, лекарят сравнява скоростта на делене на гена на мястото на предполагаемия тумор със скоростта на делене на нормална област на гърдата.

За рак на гърдата тестът FISH може да осигури следните резултати:

• реакцията е положителна - скоростта на делене на гена HER2 в туморната тъкан е два пъти по-висока от нормалната или по-висока, в който случай е необходима допълнителна терапия;
• реакцията е отрицателна - HER2 не участва в процеса на делене на раковите клетки и, ако все още има тумор, този ген няма да катализира развитието му.

По този начин анализът позволява да се определи анормалното поведение на гена HER2 и да се коригира лечението, като се използва паралелна терапия, насочена към потискане на този ген. В момента за това се използва лекарството Herceptin.

Ако не извършите навреме тест за риба или не обърнете внимание на резултатите от него, лекарят няма да има данни за поведението на HER2. В този случай лечението ще бъде предписано, без да се отчита възможната агресивна активност на този ген. Най-вероятно такава терапия няма да доведе до резултати - туморът ще продължи да се развива агресивно.

В допълнение към описаното по-горе, наблюдението на поведението на гена HER2 дава на онколозите разбиране за степента на агресивност на тумора и способността да предскажат скоростта на неговия растеж и разпространение. Това играе много важна роля при планирането на лечението на пациента. Определя се дали има нужда от тежко лечение (например лъче- или химиотерапия), дали хормоналната терапия ще бъде достатъчна, дали операцията има смисъл или не е необходима.

Плюсове и минуси на анализа на рибата

Както всеки друг диагностичен метод, FISH изследването има положителни и отрицателни страни.

1. Изследването се извършва бързо - резултатът е готов в рамките на няколко дни, докато други диагностични методи отнемат до няколко седмици. Тази точка е изключително важна в борбата с рака.
2. В допълнение към изследването на рака на гърдата, анализът ви позволява да разберете предразположеността на конкретен пациент към онкология на всеки орган на коремната кухина. На пациента се предоставя подробен доклад, въз основа на който той може да се подложи на допълнителни изследвания за предотвратяване на евентуално развитие на рак.
3. Поради спецификата на анализа на рибите, той може да се използва за откриване на най-незначителните генетични аномалии, които не могат да бъдат диагностицирани с други методи.
4. За разлика от някои други видове тестове, рибният тест е безопасен за пациента. Освен биопсия, не изисква допълнителни травматични ефекти.

Някои онколози смятат ефективността на рибния тест за спорна. Те разчитат на проучвания, които не са разкрили значително предимство на този метод пред по-евтиното IHC изследване.

• висока цена на изследването;
• поради факта, че маркерите, въведени в ДНК, са донякъде специфични, те не могат да се използват върху някои части от хромозомите;
• анализът не открива всички генетични увреждания, което може да доведе до диагностични грешки.

Като цяло, въпреки критиките, рибният анализ е най-бързият и точен метод за диагностициране на карцином на гърдата. Също така е важно да се предвиди развитието на някои други видове онкология.

Всеки рак е най-лесен за лечение в ранните си стадии. За съжаление, по ирония на съдбата, повечето от известните видове злокачествени тумори са изключително трудни за диагностициране в ранните стадии. Освен това много от използваните диагностични методи отнемат много време и не дават напълно обективна картина. Анализът на рибата не само дава най-точната картина на състоянието на тумора, но също така ви позволява да предпазите пациента от форми на лечение, които са разрушителни за тялото (например химиотерапия), тъй като степента на агресивност на тумора е определя и, съответно, вероятността от метастази.

Съвременен метод за цитогенетичен анализ, който дава възможност за определяне на качествени и количествени промени в хромозомите (включително транслокации и микроделеции) и се използва за диференциална диагноза на злокачествени кръвни заболявания и солидни тумори.

Синоними руски

Флуоресцентна in situ хибридизация

FISH анализ

английски синоними

Флуоресценция на мястохибридизация

Изследователски метод

Флуоресцентна in situ хибридизация.

Какъв биоматериал може да се използва за изследване?

Тъканна проба, тъканна проба в парафинов блок.

Как правилно да се подготвим за изследване?

Не е необходима подготовка.

Обща информация за изследването

Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH, от английски флуоресценция в- ситухибридизация) е един от най-модерните методи за диагностициране на хромозомни аномалии. Основава се на използването на флуоресцентно белязани ДНК сонди. ДНК сондите са специално синтезирани ДНК фрагменти, чиято последователност е комплементарна на ДНК последователността на изследваните аберантни хромозоми. Следователно ДНК тестовете се различават по състав: различни, специфични ДНК тестове се използват за откриване на различни хромозомни аномалии. ДНК сондите също се различават по размер: някои могат да бъдат насочени към цяла хромозома, други към конкретен локус.

По време на процеса на хибридизация, ако в изследваната проба присъстват аберантни хромозоми, те се свързват с ДНК сондата, която при изследване с помощта на флуоресцентен микроскоп се определя като флуоресцентен сигнал (положителен резултат от FISH теста). При отсъствието на аберантни хромозоми несвързаните ДНК проби се „отмиват“ по време на реакцията, което, когато се изследва с помощта на флуоресцентен микроскоп, се определя като липса на флуоресцентен сигнал (отрицателен резултат от FISH теста). Методът ви позволява да оцените не само наличието на флуоресцентен сигнал, но и неговата интензивност и локализация. По този начин тестът FISH е не само качествен, но и количествен метод.

FISH тестът има редица предимства пред другите цитогенетични методи. На първо място, изследването на FISH може да се приложи както към метафазни, така и към интерфазни ядра, тоест към неделящи се клетки. Това е основното предимство на FISH в сравнение с класическите методи за кариотипиране (напр. оцветяване на хромозома по Romanowsky-Giemsa), които се прилагат само към метафазни ядра. Това прави FISH по-точен метод за идентифициране на хромозомни аномалии в тъкани с ниска пролиферативна активност, включително солидни тумори.

Тъй като тестът FISH използва стабилна ДНК на интерфазни ядра, за изследването могат да се използват различни биоматериали - аспирати от финоъгълна аспирационна биопсия, цитонамазки, аспирати от костен мозък, биопсични проби и, което е важно, запазени тъканни фрагменти, например хистологични блокове. Например, FISH тест може да се извърши успешно върху повторни проби, получени от хистологичен блок на биопсия на гърдата, когато се потвърждава диагнозата аденокарцином на гърдата и необходимостта от определяне на HER2/neu статуса на тумора. Специално трябва да се подчертае, че в момента изследването FISH се препоръчва като потвърдителен тест при получаване на неопределен резултат от имунохистохимично изследване на тумор за туморен маркер HER2/neu (IHC 2+).

Друго предимство на FISH е способността му да открива микроделеции, които не се откриват чрез класическо кариотипиране или PCR. Това е от особено значение, ако се подозира синдром на DiGeorge и велокардиофациален синдром.

FISH тестът намира широко приложение в диференциалната диагноза на злокачествените заболявания, предимно в онкохематологията. Хромозомните аномалии в комбинация с клиничната картина и данните от имунохистохимичните изследвания са основата за класификация, определяне на тактиката на лечение и прогнозата на лимфо- и миелопролиферативните заболявания. Класически примери са хронична миелоидна левкемия - t (9;22), остра промиелоцитна левкемия - t (15;17), хронична лимфоцитна левкемия - тризомия 12 и др. Що се отнася до солидните тумори, FISH тестът се използва най-често при диагностиката на рак на гърдата, рак на пикочния мехур, рак на дебелото черво, невробластом, ретинобластом и др.

FISH тестът може да се използва и при пренатална и предимплантационна диагностика.

FISH тестът често се провежда в комбинация с други молекулярни и цитогенетични диагностични методи. Резултатът от това изследване се оценява във връзка с резултатите от допълнителни лабораторни и инструментални данни.

За какво се използва изследването?

• За диференциална диагностика на злокачествени заболявания (кръв и солидни органи).

Кога е насрочено изследването?

• Ако се подозира наличието на злокачествено заболяване на кръвта или солидни тумори, тактиката на лечение и прогнозата зависят от хромозомния състав на туморния клон.

Какво означават резултатите?

Положителен резултат:

• Наличието на аберантни хромозоми в тестовата проба.

Отрицателен резултат:

• Липса на аберантни хромозоми в изследваната проба.

Какво може да повлияе на резултата?

• Брой аберантни хромозоми.

• Имунохистохимично изследване на клиничен материал (с 1 антитяло)
• Имунохистохимично изследване на клиничен материал (с използване на 4 или повече антитела)
• Определяне на туморен HER2 статус чрез FISH
• Определяне на HER2 туморния статус чрез CISH метод

Кой поръчва изследването?

Онколог, педиатър, акушер-гинеколог, генетик.

Литература

• Wan TS, Ma ES. Молекулярна цитогенетика: незаменим инструмент за диагностика на рак. Anticancer Res. 2005 юли-август;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Въздействие на цитогенетичните и молекулярно-цитогенетичните изследвания върху хематологичните злокачествени заболявания. Chang Gung Med J. 2012 март-април;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Молекулярна цитогенетика в метафазни и интерфазни клетки за рак и генетични изследвания, диагностика и прогноза. Приложение в тъканни срезове и клетъчни суспензии. Genet Mol Res. 2002, 30 юни; 1 (2): 117-27.

Техниката FISH - флуоресцентна in situ хибридизация е разработена в средата на 80-те години на миналия век и се използва за откриване на наличието или отсъствието на специфични ДНК последователности върху хромозомите, както и алфа сателитната ДНК, разположена върху центромера на хромозома 6, CEP6(6p11. 1-q11. 1).

Това даде значителна промяна в диагностиката на онкологичните заболявания с меланоцитен произход поради откриването на туморни антигени. На злокачествен фон се определя мутация в три антигена: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) и CMM1(1p). В тази връзка възможността за обективна диференциална диагноза, основана на определяне на генетичните характеристики на меланоцитните кожни тумори, е от голямо значение за ранната диагностика на меланома и неговите предшественици.В ядрото с нормален набор от изследваните гени и хромозома 6 се наблюдават два RREB1 гена, оцветени в червено, два MYB гена, оцветени в жълто, двата CCND1 гена в зелено и двата центромера на хромозома 6 в синьо. За диагностични цели се използват флуоресцентни тестове.

Оценка на резултатите от реакцията: броят на червените, жълтите, зелените и сините сигнали в 30 ядра на всяка проба се преброява, идентифицират се четири параметъра на различни варианти на генетични нарушения, при които пробата генетично съответства на меланома. Например, една проба е в съответствие с меланома, ако средният брой CCND1 ген на ядро ​​е ≥2,5. Броят на копията на други гени се оценява по същия принцип. Едно лекарство се счита за FISH положително, ако е изпълнено поне едно от четирите условия. Проби, в които и четирите параметъра са под граничните стойности, се считат за FISH отрицателни.

Определянето на специфични ДНК последователности на хромозомите се извършва върху срезове от биопсии или хирургичен материал. На практика реакцията FISH изглежда така: изследваният материал, съдържащ ДНК в ядрата на меланоцитите, се обработва, за да се разруши частично неговата молекула, за да се разруши двойноверижната структура и по този начин да се улесни достъпът до желаната област на ген. Пробите се класифицират според това къде са прикрепени към ДНК молекулата. Материалът за FISH реакцията в клиничната практика са парафинови тъканни срезове, петна и отпечатъци.

Реакцията FISH ви позволява да откриете промени, които са настъпили в молекулата на ДНК в резултат на увеличаване на броя на генните копия, загуба на ген, промени в броя на хромозомите и качествени промени - движението на генните локуси и в едно и също хромозома и между две хромозоми.

За обработка на данните, получени при използване на реакцията FISH и изследване на връзката между броя на копията на гените на трите изследвани групи, се използва корелационният коефициент на Spearman.

Меланомът се характеризира с увеличаване на броя на копията в сравнение с невуса и диспластичния невус.

Простият невус, в сравнение с диспластичния невус, има по-малко аномалии в броя на копията (т.е. по-нормален брой копия).

За да се конструират правила за вземане на решения, които позволяват да се предскаже дали пробата принадлежи към един или друг клас (диференциална диагноза на прости и диспластични невуси), се използва математическият апарат на „дърветата на решенията“. Този подход се е доказал добре на практика и резултатите от използването на този метод (за разлика от много други методи, като например невронни мрежи) могат да бъдат ясно интерпретирани за конструиране на правила за вземане на решения за диференциране на прости, диспластични невуси и меланом. Първоначалните данни във всички случаи бяха номерата на копията на четири гена.

Задачата за конструиране на решаващо правило за диференциална диагноза е разделена на няколко етапа. На първия етап се диференцират меланом и невус, без да се взема предвид вида на невуса. На следващия етап се изгражда решаващо правило за разделяне на прости и диспластични невуси. И накрая, на последния етап е възможно да се изгради „дърво на решенията“, за да се определи степента на дисплазия на диспластичния невус.

Това разделение на задачата за класифициране на невусите на подзадачи прави възможно постигането на висока точност на прогнозите на всеки етап. Входните данни за изграждане на „дърво на решенията” са данни за броя на копията на четири гена за пациенти с диагноза меланом и пациенти с немеланомна диагноза (пациенти с различни видове невуси – прост и диспластичен). За всеки пациент има данни за броя на генните копия за 30 клетки.

По този начин разделянето на проблема за прогнозиране на диагнозата на няколко етапа позволява да се конструират много точни правила за вземане на решения не само за разграничаване между меланома и невуси, но също така и за определяне на вида на невусите и прогнозиране на степента на дисплазия за диспластичен невус. Конструираните „дървета на решенията“ са визуален начин за предсказване на диагноза въз основа на информация за броя на генните копия и могат лесно да се използват в клиничната практика за разграничаване на доброкачествени, предзлокачествени и злокачествени меланоцитни неоплазми на кожата. Предложеният допълнителен метод за диференциална диагноза е особено важен при изрязване на гигантски вродени пигментни невуси и диспластични невуси при педиатрични пациенти, тъй като се наблюдава висок процент диагностични грешки, когато такива пациенти посещават лечебни заведения. Резултатите от използването на описания метод са много ефективни, препоръчително е да се използва при диагностицирането на пигментни кожни тумори, особено при пациенти със синдром на FAMM.

Метод на хибридизация на място* (in situ, лат.) се основава на способността на ДНК или РНК да образуват стабилни хибридни молекули с ДНК/РНК проби директно върху препарати от фиксирани хромозоми и интерфазни ядра. Използвайки този метод, е възможно да се определи точното местоположение на почти всяка ДНК или РНК последователност директно в клетката, клетъчното ядро ​​или върху хромозомите.

Да се ​​извърши хибридизация на мястоПодходящи са цитологични или хистологични препарати от клетки от всяка тъкан или орган, приготвени по стандартни методи. В клинична цитогенетична лаборатория се използват препарати от култивирани лимфоцити от периферна кръв, хорионепителни цитотрофобластни клетки, култивирани и некултивирани клетки от амниотична течност, различни тъкани от абортен материал, както и натривки от букални епителни клетки и кръв.

Метод на хибридизация на място е от особено значение за практическата цитогенетика, благодарение на разработването на неизотопен вариант, базиран на използването на проби, маркирани с нерадиоактивни модифицирани нуклеотиди. Неизотопните варианти за хибридизация върху препарати (особено флуоресцентни) имат редица предимства в сравнение с изотопните: по-голяма разделителна способност, която е равна на разделителната способност на микроскоп (0,1 - 0,2 микрона), няма нужда от статистическа обработка на резултатите, скорост и безопасност за здравните изследователи

В допълнение, комбинацията от различно модифицирани проби, открити с помощта на различни системи за откриване, прави възможно едновременното определяне на местоположението на две или повече ДНК последователности в една клетка или на една метафазна плоча. А използването на повтарящи се последователности, маркирани с флуорохроми като ДНК проби, намалява времето на процедурата до 7 - 9 часа (класическата неизотопна версия на хибридизацията отнема два дни, изотопните варианти от седмица до месец), което е особено важно за пренаталното диагноза. Използване FISH методв цитогенетичната диагностика позволява да се идентифицират структурни хромозомни пренареждания, да се установи естеството на маркерните хромозоми и да се анализират числените нарушения на хромозомния набор, както върху метафазните хромозоми, така и в интерфазните ядра.

Принцип на метода FISH

В основата FISH методлежи реакцията на хибридизация между изкуствено създадена ДНК сонда и комплементарна нуклеотидна последователност на ядрена ДНК. Молекулата на ДНК се състои от две спирално свързани нуклеотидни вериги и хибридизацията е възможна само ако веригите се раздалечат. За да се разделят нуклеотидните вериги на ДНК, те прибягват до денатурация (за последваща хибридизация, както ДНК в ядрата на тестовата проба, така и самата ДНК сонда трябва да бъдат денатурирани). След денатуриране, ДНК сондата се хибридизира към своята комплементарна нуклеотидна последователност и може да бъде открита с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Така общият изглед на протокола за настройка РИБАможе да се представи в следната форма:

1. Приготвяне на хистологичен или цитологичен препарат.
Подготовката на хистологичния препарат се извършва по стандартната процедура: изрязване, маркиране, окабеляване, запълване, микротомия, поставяне на среза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаителни разтвори и центрофугиране, което позволява да се получи концентрирана клетъчна суспензия.

2. Предварителна обработка (при необходимост).
Лекарството се третира с протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които възпрепятстват хибридизацията.

3. Прилагане на ДНК сонда към препарата и последваща денатурация.
За да се денатурират сондата и пробата ДНК, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-90°C.

4. Хибридизация.
След денатуриране лекарството се охлажда до определена температура (37°C в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем се използват автоматични хибридизатори за денатурация и хибридизация.

5. Измиване.
След завършване на хибридизацията е необходимо да се отмият несвързаните проби, които иначе биха създали фон, който би затруднил оценката на резултатите от FISH анализа. Обикновено за изплакване се използва разтвор, съдържащ натриев цитрат и хлорид (SSC).

6. Контраоцветяване.
Използвайки флуоресцентни багрила (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; пропидиев йодид), цялата ядрена ДНК се оцветява.

7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафинизиране, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

* - Материалът е изготвен въз основа на информация от открити източници.