Риф отрицательный. Анализ на сифилис риф. ИФА - Иммуноферментный анализ

Анализ на сифилис делают, применяя множество методик обнаружения возбудителя. При развитии патологии проявляется большое количество специфических признаков, поэтому с целью установления точного диагноза больного человека обследуют комплексно. Общий анализ крови при этом малоинформативен, его не используют при диагностировании данной венерической инфекции.

Виды исследований и биоматериалов для анализа

Для выявления болезни используют различные методики и биоматериалы. На ранних этапах сифилис определяют с помощью бактериоскопического теста. Образцы исследуют под микроскопом. Прибор позволяет обнаружить штаммы возбудителя. Позднее проводят серологические анализы крови. Благодаря им, в пробах выявляют антигены и антитела сифилиса.

Способы определения половой инфекции поделены на 2 категории:

Прямые, выявляющие патогенный микроорганизм. К ним относят: темнопольная микроскопия, RIT-анализ (инфицирование кроликов биоматериалом для исследования), метод ПЦР – полимеразной цепной реакции (с его помощью находят генетические элементы возбудителя).
Непрямые (серологические) позволяют обнаружить антитела к патогену. Они продуцируются иммунной системой, как ответная реакция на заражение.

Серологические методики поделены на 2 категории: трепонемные и нетрепонемные.

Нетрепонемные, включающие: тест с толуидиновым красным, анализ РСК, RPR- тест, исследование крови экспресс-методом РМП.
Трепонемные, включающие: иммуноблоттинг, РСК-тест, РИТ-анализ, исследование РИФ, РПГА-тест, ИФА-анализ.

Информативность тестов на инфекцию различна. Чаще делают основные виды анализов на сифилис, к которым отнесены серологические методики.

Биоматериал для исследования

Чтобы выявить бледную трепонему – патогена, который выглядит, как спираль и вызывает сифилис, берут пробы:

венозной крови;
ликвора (секрета из спинномозгового канала);
содержимое лимфатических узлов;
ткани изъязвлений.

Если необходимо провести тесты на обнаружение сифилиса, кровь сдают не только из локтевой вены, но и из пальца. На выбор биоматериала и способ исследования влияет тяжесть течения инфекции и оснащенность диагностического центра.

Прямые исследования

Убедительным доказательством сифилиса является выявление возбудителей инфекции под микроскопом. Таким способом находят патоген у 8 обследуемых из 10. Отрицательный результат у 2 оставшихся пациентов не говорит о том, что они не инфицированы.

Исследование делают на первичном и вторичном этапе (стадии) заболевания, для которых характерно появление высыпаний на коже и сифилом (изъязвлений) на эпителиальных тканях или слизистых оболочках. В отделяемом из очагов поражения находят патогены, вызывающие венерическое заболевание.

Точнее с определением трепонем справляется сложный тест, обозначающийся как РИФ – реакция иммунофлуоресценции. Образец для исследования предварительно обрабатывают флуоресцентными антителами. Соединения, способные светиться, склеиваются с бактериями. Рассматривая под микроскопом образцы, в случае заражения лаборант видит сверкающих возбудителей.

Тест используют для раннего диагностирования болезни. Чем дольше длится заболевание, тем ниже чувствительность исследовательских способов. Кроме того, она падает после обрабатывания высыпаний и язв антисептическими средствами и у пациентов, прошедших лечение. Изредка исследование дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты.

RIT-анализ – высокоточный способ обнаружения сифилиса. При проведении теста результаты приходится ждать долго. До тех пор, пока у инфицированного кролика не проявятся признаки инфекции. Тест применяют очень редко, несмотря на то, что он сверхточен.

С помощью полимеразной цепной реакции на сифилис определяют генетические элементы патогенов. Единственный недостаток ПЦР – дороговизна.

Нетрепонемные тесты

Такие анализы крови помогают выявить антитела, появляющиеся в ответ на кардиолипин – соединение, относящееся к общему строению мембран патогенов.

Реакция Вассермана (РВ или RW)

Самым известным исследованием на сифилис считается реакция Вассермана. РВ входит в категорию реакций связывания комплемента (РСК). Новые методы РСК обладают существенными отличиями от традиционной RW. Но обозначаются они, как и раньше понятием «реакция Вассермана».

Иммунная система, синтезирует антитела (маркеры) в ответ на вторжение трепонем. Их выявляют при анализе крови на сифилис методом реакции Вассермана. Положительный результат RW подтверждает инфицирование обследуемого.

Реакция гемолиза – индекс РВ анализа. При ней взаимодействуют 2 субстанции: гемолитическая сыворотка и эритроциты барана. Сыворотку делают, иммунизируя кролика эритроцитами барана. Активность биологической жидкости снижают путем прогревания.

Показатели РВ зависят от того, прошел гемолиз или нет. В пробе чистой от маркеров происходит гемолиз. При этом реакция на антигены невозможна. Комплемент тратится на взаимодействие с бараньими эритроцитами. Когда в образце есть маркеры, комплимент вступает в реакцию с антигенами. В этом случает гемолиз не протекает.

Лабораторная диагностика использует сразу несколько тестов на сифилис для получения максимально точного результата. Это занимает больше времени, но зато даёт наиболее точный ответ.

Чаще всего результат анализа РИФ представляют цифрами. Расшифровка имеет следующие обозначения:

резко положительный результат обозначается 4 плюсами (++++);
положительный результат обозначается 3 плюсами (+++);
слабоположительный результат 2 плюсами (++);
сомнительный результат 1 плюс (+);
отрицательный результат обозначается 1 минусом (-).

Результат РИФ на сифилис также представляется в процентном варианте, который зависит от количественного показателя связанных бактерий:

при отрицательном результате иммобилизация до 20%;
при слабоположительном результате иммобилизация варьирует от 20 до 50%;
при положительном результате иммобилизация выше 50%.

Если результат выдал положительный ответ, то это констатирует наличие заболевания.

Если результат слабоположительный , то это указывает на единичное количество остаточных антител в крови.

Отрицательный результат говорит об отсутствии бледной трепонемы, а это означает, что пациент здоров.

Опытные врачи нашей клиники проведут диагностику сифилиса быстро и с высокой точностью показаний. Мы социально ориентированы на все слои населения, поэтому стоимость анализа РИФ недорогая . Цена представлена в таблице на нашем сайте.

Определяет антилипидные антитела (реагины). К сыворотке крови пациента добавляют сифилитические антигены, образующие с реагинами иммунный комплекс , способный адсорбировать и связывать комплемент. Если такой комплекс образуется, то разрушение эритроцитов (гемолиз) не происходит, и они выпадают в осадок (положительная реакция). Если в сыворотке пациента нет реагинов, то происходит гемолиз, и эритроциты в осадок не выпадают (отрицательная реакция).

RPR (Rapid Plasma Reagin)

Или реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном – это скрининговый метод диагностики сифилиса. Данная реакция в определенной степени может рассматриваться как более современная модификация реакции Вассермана. Основным показанием к проведению этого теста является первичное обследование на сифилис, медицинские осмотры , контроль эффективности лечения. Положительный результат требует проведения других, более точных тестов для подтверждения диагноза.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Один из самых перспективных методов лабораторной диагностики сифилиса. Его принцип - выявление специфического комплекса антиген-антитело, который образуется при соединении сифилитических антигенов, абсорбированных на твердом носителе, с антителами исследуемой сыворотки крови. В настоящее время наиболее распространенным является непрямой вариант ИФА, на заключительном этапе которого используются антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с пероксидазой хрена или другими ферментными маркерами. Измеряется окрашивание конечных продуктов этой реакции, которая зависит от количества связанных антител сыворотки.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В ходе реакции иммунофлюоресценции (РИФ) определяется интенсивность свечения бледных трепонем в препарате, которая возникает только в присутствии антитрепонемных антител в сыворотке крови. Реакция проводится с сывороткой в разном разведении (в 10 и 200 раз).

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Наиболее специфичный диагностический тест на сифилис. В сыворотке крови больных производится определение видеоспецифичных антител (иммобилизинов), которые обездвиживают бледные трепонемы в присутствии комплемента. С помощью микроскопа проводится подсчет доли утративших подвижность (иммобилизованных) бледных трепонем. Кровь методом РИБТ исследуют не ранее чем через 2 недели после окончания приема антибиотиков и других лекарственных средств.

Исследование крови методами РИБТ и РИФ выполняют для диагностики скрытого сифилиса. РИФ (10-ти кратное разведение сыворотки) позволяет поставить диагноз даже у тех пациентов, в исследованиях которых бледная трепонема не обнаруживается.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Соединение бледных трепонем сыворотки крови с обработанными специальными методами бараньими эритроцитами. При наличии в сыворотке крови возбудителя сифилиса происходит агглютинация (склеивание и последующее осаждение) эритроцитов. Реагенты вносят в лунки специальных пластин, о результате реакции судят по окрашиванию. Агглютинат эритроцитов имеет темно-красный цвет и форму пятна или кольца.

В сети клиник «МедЦентрСервис» Вы можете сдать кровь на сифилис любым из вышеописанных методов. Кровь на анализ нужно сдавать из вены, натощак (не менее 4 часов с последнего приема пищи). Не рекомендуется сдавать кровь после приема алкоголя, лекарственных препаратов , а также во время менструального цикла.
Если у Вас есть подозрение, что Вы могли заразиться сифилисом или Вы планируете беременность, то не откладывайте сдачу анализов, приходите в клиники «МедЦентрСервис» .

РИФ, РИБТ, РПГА

РИФ - реакция иммунофлюоресценции - трепонемный тест. Является одним из самых чувствительных анализов на сифилис. РИФ становится положительной через 10-20 дней после инфицирования, что относит ее к методам раннего выявления сифилиса.

Показания проведения РИФ:

Постановка РИФ проводится у лиц с симптомами сифилиса, при этом отрицательными реакциями - РМП, РВ;
в качестве дифференциальной реакции у лиц с положительными реакциями RW, микрореакции и отсутствием симптомов;
у беременных при отсутствии клинических проявлений и сифилиса в анамнезе.

Методика проведения РИФ:

При проведении реакции в сыворотку пациента добавляется кровь кролика, зараженная бледной трепонемой(возбудитель сифилиса) и флюоресцирующая(светящаяся) сыворотка. Исследование заключается в наблюдении свечения комплексов под люминесцентным микроскопом. Результаты реакции интерпретируются в зависимости от интенсивности свечения от 1+ до 4+, что указывает на наличие сифилиса. Отсутствие свечения - отрицательный результат РИФ обозначает, что обследуемый здоров. Ложные результаты анализа встречаются крайне редко при системных процессах , беременности и т.д.
Реакция ставится в модификации РИФ-200 и РИФ-авс(абсорбция).
Чувствительность реакции при первичном сифилисе составляет порядка 85%
при третичном сифилисе - 98-100% .

Негативация РИФ происходит в течение нескольких лет после лечения сифилиса. После проведенной противосифилитической терапии необходимо наблюдение за показателями в динамике.

РИБТ - реакция иммобилизации бледных трепонем - является самым специфичным анализом крови на сифилис. РИБТ высококачественный, дорогостоящий анализ крови, выполнение которого могут позволить себе хорошо оснащенные лабораторные комплексы. РИБТ является основополагающей реакцией при скрытых формах сифилиса, нейросифилисе, висцеросифилисе. Позволяет отдифференцировать ложноположительные реакции от истинного заболевания сифилисом.

Постановка реакции основана на обездвиживании (иммобилизации) возбудителя сифилиса видоспецифичными антителами. Путем микроскопического исследования читается результат реакции: 0-20% - отрицательная, 21-30%- сомнительная, 31-50% - слабоположительная, 51-100% - положительная реакция. То есть к положительным результатам на сифилис относятся те, где РИБТ более 50%. При сифилисе РИБТ становится положительной достаточно медленно: в первичный периоде сифилиса она еще отрицательна, во вторичном свежем периоде - положительна в 50% случаев, во вторичном рецидивном периоде - положительна в 90-100%, в третичном периоде - положительна в 99-100%.

Негативация РИБТ осуществляется десятилетиями, поэтому как критерий достоверности излеченности ее использовать неправомочно, тем не менее динамическое наблюдение после проведенного противосифилитического лечения необходимо.

Проведение реакции РИБТ целесообразно не ранее чем через 30 дней после окончания лечения. РПГА - реакция пассивной гемагглютинации - относится к трепонемным тестам, проводится в комплексе с нетрепонемными. Используется для подтверждения диагноза сифилиса на любой его стадии.

Реакцию целесообразно проводить через 4 недели после предполагаемого заражения. При проведении реакции к сыворотке крови пациента добавляют препарат, приготовленный из эритроцитов животного происхождения, сенсибилизированных антигеном бледной трепонемы - возбудителя сифилиса.

Суть реакции РПГА заключается в склеивании (агглютинации) в присутствии антител к трепонеме и образовании агглютината - фигуры, которую наблюдает врач - лаборант. Реакция оценивается по количеству +: 4+- резкоположительный результат, 3+-положительный, 2+-слабоположительный, 1+-сомнительный, - - отрицательный результат. При положительном результате реакции проводится количественная оценка с определением концентрации (титра) антител. При прогрессировании сифилиса - титр антител постоянно растет.

РПГА остается положительной в течение десятилетий после лечения сифилиса, поэтому не может использоваться в качестве критерия достоверности излеченности. Однако необходимо наблюдать титр антител РПГА в динамике.

Метод обладает высокой чувствительностью . Результаты РПГА могут быть ложноположительны. К таким результатам анализа могут приводить болезни соединительной ткани , некоторые инфекции, и т.д.

Лабораторные исследования плазмы крови были и остаются главным способом диагностики и мониторинга сифилиса.

Этой болезни непостоянны, а скрытые формы вообще внешне не видны. Среди всего многообразия серологических методик, самые достоверные результаты предоставляет анализ на сифилис РИФ.

РИФ – это реакция иммунофлюоресценции. По диагностическим возможностям эта методика относится к непрямым специфическим тестам. То есть сам возбудитель обнаружить с ее помощью не выйдет. Но по косвенным признакам можно сделать обоснованное заключение о наличии или отсутствии бледной трепонемы в организме.

Для исследования требуются:

Образец крови пациента. Как правило, используется венозная, однако имеются варианты проведения РИФ с капиллярной кровью из пальца.
Типовой, промышленного изготовления, трепонемный антиген. Это особые белки спирохеты, которые служат «якорями» для антител к бледной трепонеме из сыворотки больного.
Стандартная с белками-иммуноглобулинами, которые связываются с антителами крови пациента.
Люминесцентный микроскоп.

Эта реакция обладает очень высокой специфичностью и чувствительностью. Но обходится недешево и ставится не так уж и легко. Поэтому в основном используется для верификации диагноза в сомнительных и ложноположительных случаях.

Как проводится РИФ-диагностика сифилиса?

Алгоритм постановки реакции иммунофлюоресценции состоит из нескольких шагов. В немалой степени из-за сложности проведения этой методики, она не подходит для массовых скрининговых исследований.

Сами шаги такие:

Полученным от пациента образцом крови/плазмы, обрабатывают предметное стекло, на котором находится высушенный трепонемный антиген. Его получают из тканей яичка кролика, зараженного спирохетой штамма Никольса.
Выдержав несколько минут, стекло промывают дистиллированной водой.
Промытый образец обрабатывают специальной сывороткой промышленного изготовления, которая содержит в себе собственные антитела к человеческим противотрепонемным антителам. Иммуноглобулины этой сыворотки заранее помечены специальным веществом, которое под ультрафиолетом светится желто-зеленым цветом.
Затем снова следует промывка.
Предметное стекло помещается в люминесцентный микроскоп и изучается.

Если лаборант наблюдает в окуляре микроскопа характерное свечение, значит, антитела к бледной трепонеме в крови пациента были. Они связались с типовым антигеном. А на них, в свою очередь, прореагировали меченные люминофором иммуноглобулины из стандартизированной промышленной сыворотки.

Анализ на сифилис РИФ: достоверность результатов

В серологической диагностике сифилиса, очень важно получить достоверный и точный результат.

Чтобы повысить качество данных, предпринимаются определенные действия:

Исследуемая сыворотка разводится в 200 раз (1:200), чтоб избежать ложноположительных реакций. Тогда говорят, что проводится анализ на сифилис РИФ 200 .
В другом варианте, при разведении сыворотки 1:5, дополнительно используется специальный абсорбент, который собирает на себе «лишние» антитела, чтоб они не искажали результаты.

На руку исследователям играют и размеры трепонем. Крупные микробные тела спирохет хорошо заметны при люминесцентной микроскопии. Если на них «прицепляются» меченные люминофором белки из сыворотки. Использование стандартизированного антигена и сывороток, позволяет до максимума повысить чувствительность и специфичность РИФ в диагностике сифилиса.

Частные варианты анализов РИФ: РИФ абсорбция

Один из альтернативных способов называется РИФ-Абс. От обычной методики он отличается низким разведением исследуемой сыворотки – 1:5 против 1:200, как обычно.

В концентрированном образце содержится очень много активных белковых молекул.

Чтоб избежать и повысить чувствительность, сыворотку обрабатывают специальным абсорбентом из фрагментов сифилитических спирохет. Сорбент собирает на себе излишне активные антитела и потом уже образец обрабатывают промышленной, меченной люминофором сывороткой. Благодаря такой предварительной подготовке , отсеиваются все лишние молекулы, которые могли бы повлиять на результаты теста.

Ставят ее по таким показаниям:

Положительная на фоне клинического благополучия и отсутствии рисков заражения в анамнезе.
Позитивная РВ у больных, страдающих хроническими заболеваниями.
Отрицательная РВ при появлении подозрительных в отношении сифилиса симптомов.

Первые позитивные результаты появляются уже на 15-16 день с момента инфицирования. Если реакция из положительной становится отрицательной, это сигнализирует о полном излечении от сифилиса. Вероятность ложноположительного результата составляет меньше 0,4%.

Такая ситуация может произойти при обследовании онкобольных, алкоголиков, беременных женщин и страдающих расстройствами иммунитета людей.

Определенная доля приходится и на технические ошибки, так как постановка достаточно сложная. Бывают случаи, когда необходимо отличить врожденную патологию от приобретенной. Сделать это можно, если поискать разные виды антител в крови пациента.

Антитела к сифилису класса M (IgM), появляются вскоре после заражения и по времени намного опережают IgG. Выявить их позволяет анализ на сифилис РИФ абсорбции IgM. Если результаты постановки этой реакции будут положительными, то можно говорить о недавнем заражении. Так случаи реинфекции можно отличить от рецидива или выявить заражение ребенка после родов.

По итогам такой методики анализов РИФ, также делают вывод об эффективности лечения раннего сифилиса.

При подозрении на сифилис обращайтесь к опытному венерологу.

Главная » Анализы » Что такое титры при сифилисе. Анализ на сифилис риф

Сифилис – заболевание инфекционной природы, обусловленное спирохетой Treponema pallidum, склонное к прогредиентному хроническому течению, с чёткой периодизацией клинической симптоматики.

Преобладание полового пути передачи над контактным и трансплацентарным ставит это заболевание в ряд венерических (ЗППП, ИППП). Помимо указанных способов передачи инфекции особую роль играет артифициальный путь (от лат. «artificio» - искусственно созданный).

Он характерен для медицинских учреждений, в основном, реализуется в условиях стационара. Инфицирование происходит при гемотрансфузиях, различных хирургических операциях, инвазивных диагностических методах.

Несмотря на карантинизацию донорской крови, проблема выявления сифилиса у доноров на разных стадиях заболевания все ещё актуальна.

Поэтому диагностические мероприятия при сифилисе требуют стандартизации, внедрения новых чувствительных и информативных методов идентификации, а также сведения к минимуму ошибок и неправильной трактовки результатов анализов.

Показать всё

1. Классификация методов лабораторной диагностики

Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.

Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:

1 Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
2 Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
3 Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.

Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.

1.1. Прямые методы

1 Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
2 Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
3 ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
4 ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.

1.2. Непрямые методы

Серологические реакции - это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.

1 Нетрепонемные тесты:
- Реакция Вассермана (РСК);
- Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
- Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
- Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
- Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней - VDRL.
2 Трепонемные тесты:
- Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
- Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
- Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
- Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
- Иммуноблоттинг.

Рисунок 1 - Алгоритм серодиагностики сифилиса

1.3. Гистоморфологические методы

Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра. Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.

2. Микроскопия Treponema pallidum в тёмном поле

Этот метод основывается на непосредственном обнаружении бледной трепонемы в исследуемом материале с помощью микроскопа и специальных приспособлений (чаще всего отделяемое эрозий и язв, реже спинномозговая жидкость и другие субстраты).

С помощью скарификации, соскоба, сдавливания с эрозий и язвенных дефектов получают экссудат, затем исследуют в микроскоп подготовленный препарат.

Обычно бледные трепонемы выявляют в препарате, полученном из шанкра, из очагов вторичного свежего, вторичного рецидивного сифилиса, а также пунктата лимфоузлов, плаценты.

Основанный на феномене свечения мелких частиц в тёмном поле при попадании луча света (феномен Тиндаля), метод прекрасно позволяет дифференцировать возбудителя сифилиса от других трепонем на основании морфологических отличий и отличий в способах передвижения бактерии.

Для микроскопии используют специальный темнопольный конденсор соответствующего оптического разрешения. Препарат получают способом раздавленной капли (каплю материала наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и закрывают очень тонким покровным).

На покровное стекло капают иммерсионное масло. С помощью поворота тубуса и поворота увеличивающей линзы регулируют нужное освещение.

В тёмном поле микроскопа обнаруживаются клетки крови, эпителиальные клетки и сам возбудитель сифилиса. Бледная трепонема выглядит как спираль, очень тонкая, излучающая серебристый цвет, с плавными движениями.

Рисунок 2 - Темнопольная микроскопия как способ визуализации бледной трепонемы в исследуемом материале. Источник иллюстрации - CDC

Treponema pallidum необходимо отличать от других трепонем, в том числе и Tr. refringens, которая может содержаться в ротоглотке и на слизистой половых органов. Эта бактерия совершает хаотичные движения, имеет широкие и несимметричные, довольно грубые завитки. Кроме того, Treponema pallidum отличают от Tr. Microdentium, Tr. Buccalis и Tr. vincenti.

Визуализация бактерий в тёмном поле иногда дополняется реакцией флюоресценции. Для этого меченые флюоресцирующим красителем противотрепонемные АТ добавляют в нативный материал. При этом образуется комплекс, называемый антиген-антитело (сокращенно АГ-АТ), который и является объектом для исследования с помощью люминесцентного микроскопа.

3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР, разработанная в 1991 году для обнаружения молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) бледной трепонемы, является высокочувствительным и специфичным, позволяет выявить фрагменты ДНК возбудителя.

Базируется данный анализ на копировании коротких участков ДНК бледной спирохеты, который удовлетворяет заданным параметрам и присутствует в образце. Всё это выполняется в искусственных условиях (in vitro). Реакция проводится в приборе - амплификаторе, который обеспечивает периодизацию температурных циклов. Происходит охлаждение с последующим нагреванием пробирок с погрешностью в 0,1˚С.

ДНК-матрицу прогревают в течение 2 минут при температуре 92-98˚С (максимальная температура используется, если полимераза термостабильна). При нагревании цепи ДНК расходятся из-за распада водородных связей между ними. В стадии отжига температуру реакции снижают для связывания праймера с одноцепочечной матрицей.

Отжиг занимает около 30 секунд, в течение этого времени синтезируются сотни нуклеотидов. Вновь синтезируемые молекулы копируются полимеразой, в результате многократно увеличиваются специфические фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. Последующая детекция фрагментов проводится с помощью электрофореза в геле агар.

ПЦР-диагностика сифилиса пока носит экспериментальный характер, но оправдана при выявлении врождённой инфекции, в сложных диагностических случаях или при минимальном содержании бледных трепонем в исследуемом материале.

4. ДНК-гибридизация

ДНК-гибридизация выполняется in vitro и основана на полном или частичном соединении двух одноцепочечных молекул ДНК в одну молекулу. В случае полного соответствия комплементарных фрагментов объединение происходит легко. Если комплементарное соответствие частичное, то объединение цепочек ДНК происходит медленно. На основании времени слияния цепей можно оценить степень комплементарности.

При нагреве ДНК в буферном растворе разрываются водородные связи азотистыми основаниями, являющимися комплементарными, в результате цепочки ДНК расходятся. Далее получают препарат из двух денатурированных дезоксирибонуклеиновых кислот. При охлаждении одноцепочечные участки ренатурируют. Образуется так называемый гибрид ДНК.

Метод позволяет оценить и анализировать скорость отжига, учитывая особенности (сходства и различия) ДНК между видами или внутри вида.

Применение ДНК-зонда заключается в гибридизации меченого фрагмента ДНК со специфичным участком ДНК для идентификации комплементарных последовательностей нуклеотидов. Для метки зонда используется группа ненасыщенных атомов (хромофоры) или радиоактивные изотопы.

ДНК–зонд применяют для гетерогенного и гомогенного детектирования нуклеиновых кислот. Роль зонда заключается в определении участков, на которых произошло слияние мишень-зонд. Детектирование в гомогенной системе имеет преимущество - позволяет отследить гибридизацию молекул ДНК в реальном времени.

Суть метода сводится в денатурации ДНК и ренатурации (воссоединения цепочек ДНК). Процесс ренатурации нуклеиновой кислоты и ДНК-зонда заканчивается образованием «гибрида».

Специфические последовательности нуклеиновых кислот гибридизуются с ДНК–зондом и, таким образом, выявляются и позволяют оценить количество ДНК в исследуемом материале.

5. Заражение лабораторных животных

Высокая чувствительность кроликов к Treponema pallidum (порядка 99,9%) позволяет применять их в диагностике сифилитической инфекции.

Заражение кроликов проводится в научно-исследовательских центрах и является «золотым стандартом» оценки чувствительности других методов.

Вернёмся к трепонемным и нетрепонемным тестам, так как они используются чаще всего. Рассмотрим их преимущества и недостатки, а также ошибки в интерпретации результатов.

6. Нетрепонемные тесты

Это тесты определения антител IgG и IgM к стандартизированному кардиолипиновому антигену. Их существенным недостатком является сравнительно небольшая специфичность.

Низкая стоимость и простота выполнения позволяют отнести эти тесты к отборочным диагностическим, необходимым для установки предварительного диагноза и скрининга среди населения.

Именно нетрепонемные тесты сдаются при оформлении медицинской книжки, устройстве на работу, постановке на учет в женской консультации.

Недостатки:

1 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса первичного – 70%;
2 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса позднего – 30%;
3 Возможность появления ложноотрицательных и ложноположительных результатов;
4 Трудоёмкость выполнения РСК.

Преимущества:

1 Относительно маленькая стоимость производства тестов;
2 Получение быстрого ответа;
3 Возможность их применения для скрининга.

Получение ложноположительных или слабоположительных проб возможно в следующих случаях:

1 Нарушение технологии выполнения, при блокировании комплекса АГ-АТ.
2 Наличие у больного аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артирит, ревматизм, склеродермия, системная красная волчанка, саркоидоз и др.).
3 Злокачественные новообразования.
4 Вирусные и бактериальные инфекции.
5 Эндокринные заболевания (аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет).
6 Беременность.
7 Употребление алкоголя.
8 Приём жирной пищи.
9 Старческий возраст.

Как видно из списка, существует достаточно причин для неверного результата. Поэтому к нему следует весьма настороженно относиться. Рассмотрим наряду с РСК ещё две пробы. Это реакция микропреципитации и VDLR (ее модификация).

7. Реакция связывания комплемента (РСК, Вассермана, RW)

Это проба, основанная на способности комплемента связываться с комплексами АГ-АТ. Идентифицируют образовавшийся комплекс с помощью гемолитической системы. Кардиолипиновый антиген заметно повышает чувствительность пробы.

Чувствительной является и реакция Колмера, которая заключается в выполнении при различных температурных режимах. Так, первая фаза реакции Колмера протекает при температуре 20˚С в течение получаса, вторая фаза при тепературе 4-8˚С на протяжении 20-ти часов. За это время происходит связывание комплемента.

При выполнении РСК возможно получение резко положительных результатов. Причиной, вероятно, является большой титр антител в неразведенной сыворотке. В этом случае пробы ставят с уменьшающими дозами.

Для дифференцировки стадий сифилиса и оценки эффективности противосифилитического лечения определяют количество АТ в сыворотке.

Позитивность пробы оценивают с помощью крестов, также в реакциях Вассермана, Колмера и Канна указывается разведение сыворотки.

8. Реакция микропреципитации

Так как трудоёмкость выполнения вышеуказанных проб велика, то для широты обхвата диспансеризацией разных групп населения разработан ускоренный способ серодиагностики сифилиса, так называемый экспресс-метод – реакция микропреципитации (сокращенно МР, РМП).

Она выполняется с кардиолипиновым антигеном и вспомогательными веществами. Его преимуществом является забор периферической крови для исследования. Это значительно ускоряет и саму методику, и работу лаборантов.

Рисунок 2 - Реакция микропреципитации (схема)

Для проведения МР необходимы плазма или инактивированная сыворотка крови пациента (именно они содержат антитела). Далее плазму помещают в маркированные лунки. Затем, к исследуемому материалу добавляют каплю кардиолипинового антигена, смешивают и встряхивают. В итоге в сыворотке инфицированного появляются характерные хлопья, разные по степени интенсивности.

Это качественная проба. При количественной оценке используются 10 разведений сыворотки, помещаемой в 10 лунок с соответствующей маркировкой. При качественной МР ответ указывается в виде крестов (плюсов) или минуса, при количественной указывается титр антител (1:2, 1:4 и так далее).

Наличие хлопьев расценивается как положительный или слабоположительный ответ. Возможно появление флокулята и при отсутствии заболевания, поэтому окончательную оценку полученного результата проводят после контрольного исследования или проведения других реакций (РИБТ, РИФ, ИФА, РПГА).

9. VDRL

Рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения метод постановки реакции с антигеном липоидной природы (АГ) по праву считается лучшим среди других стандартных нетрепонемных тестов. Разработан в США, штате Джорджиа в лаборатории венерических болезней (Veneral Diseases Research Laboratories).

Аббревиатура учреждения послужила названием для пробы – VDRL. VDRL - это модификация МР. Сыворотку от больного сифилисом инактивируют и помещают на предметное стекло. Используемый антиген состоит из кардиолипина, холестерина и лецитина в разном процентном соотношении. Ответ регистрируется практически сразу.

Отчётливая флокуляция возникает в присутствии в сыворотке антител. Сыворотка становится реактивна по прошествии 4-х недель после заражения. Для оценки количества антител, сыворотку предварительно разводят в геометрической прогрессии.

Преимущества VDRL:

1 сравнительно высокая чувствительность;
2 сравнительно высокая специфичность;
3 легкость выполнения;
4 малая стоимость реактивов;
5 получение быстрого ответа.

Недостатком VDRL является относительно высокая частота ложноположительных результатов.

Их причинами являются всё те же перечисленные выше заболевания.

Трепонемные тесты исполняются со специфическими АГ Treponema pallidum. Они необходимы и обязательны для установления окончательного диагноза. Это реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакции непрямой гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА) и др.

После положительного результата нетрепонемного теста (RPR, MP, VDRL) всегда должны выполняться трепонемные (чаще комбинация - РПГА, ИФА, РИФ).

Трепонемные тесты более сложны в исполнении, чем экспресс-тесты, и требуют больших затрат денежных средств.

10. РИФ

Данная реакция (сокращенно РИФ) используется для диагностики сифилиса, в том числе и скрытых форм, и перепроверки положительных и ложноположительных проб.

РИФ основана на свечении меченых антител при соединении с комплексом антиген-антитело под кварцевой лампой. Метод начал применяться в 60-х годах и отличался простотой выполнения и высокой специфичностью (которая немного уступает РИБТ).

Он имеет несколько модификаций: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-abs.

Наиболее чувствительна РИФ в разведении 10 раз, а остальные - более специфичны. РИФ проводится в двух фазах. К АГ добавляют сыворотку крови пациента. Образуется комплекс АГ-АТ, который исследуется в следующей фазе. Далее меченный с помощью флюоохрома комплекс идентифицируют при микроскопии. Если не наблюдается свечение, это указывает на отсутствие специфических АТ в сыворотке крови.

РИФ-200 является наиболее ценным из всех разведений. Метод предназначен для диагностики различных форм сифилиса, особенно скрытого сифилиса и перепроверки положительных проб.

11. РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (сокращено РИБТ, РИТ) одна из сложных серологических проб, требующих значительных усилий и финансовых затрат. РИБТ применяют все реже, но актуальность ее сохраняется в диагностике скрытого сифилиса.

Большое значение она несёт в распознавании ложноположительных результатов у беременных женщин и основывается на иммобилизации бактерий в присутствии иммобилизинов – поздних антител.

Результат оценивается на процентном количестве (%) иммобилизированных трепонем с помощью специальной таблицы:

1 От 0 до 20 - отрицательная проба.
2 От 21 до 50 - слабоположительная проба.
3 От 50 до 100 - положительная реакция.

Ложноположительные результаты также возможны при применении РИБТ. Так, неверный ответ возможен при инфицировании тропическими трепанематозами, а также, при туберкулёзе, циррозе печени, саркоидозе и пациентов старческого возраста.

12. РПГА

Этот анализ крови на сифилис называется реакцией пассивной гемагглютинации (сокращенно, кровь на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА приготавливают из эритроцитов барана, покрытых фрагментами бледных трепонем (полученных от инфицированных кроликов (см. рисунок 4)). Для анализа используется венозная кровь (плазма или инактивированная сыворотка) пациента.

При добавлении антигена в сыворотку пациента с сифилисом происходит образование комплекса АГ-АТ, который приводит к агглютинации эритроцитов. агглютинация определяется субъективно врачом-лаборантом.

Рисунок 3 - Схема РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)

Проба оценивается как положительная при появлении агглютинатов равномерной розовой окраски. Окрашивание преципитата в красный свидетельствует об осаждении эритроцитов. РПГА является высокочувствительной и высокоспецифичной.

12.1. Реакция микрогемагглютинации

Она является упрощённым вариантом РПГА. Отличается от пробы, описанной выше, меньшим количеством антигена, разбавителя и сыворотки крови для выполнения реакции. Через 4 часа после инкубации сыворотки можно оценить пробу. Используется при скрининговых и массовых обследованиях на сифилис.

13. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА) базируется на специфической реакции антиген-антитело. Биологический материал (сыворотка крови пациента, ликвор) вносят в лунки, на твердой поверхности которых фиксированы антигены бледной трепонемы. Исследуемый материал инкубируют, затем отмывают антитела, не связавшиеся с антигенами (см. рисунок 5).

Идентификация полученного комплекса осуществляется на этапе ферментации с помощью иммунной сыворотки, меченной ферментом. При химической реакции фермент окрашивает полученные комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от количества специфических антител в крови пациента и фиксируется спектрофотометром.

Рисунок 4 - Схема ИФА (иммуноферментного анализа)

Чувствительность ИФА составляет более 95% . Метод используется в автоматизированном режиме для исследования декретируемых групп населения: доноров, беременных и других, для уточнения диагноза при положительных и ложноположительных нетрепонемных тестах.

14. Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, модификация простого ИФА. Реакция основана на электрофорезе с разделением антигенов бледных трепонем.

Разделенные иммунодетерминанты переносят на нитроцеллюлозную бумагу и проявляют в ИФА. Далее инкубируют сыворотку и смывают не связавшиеся антитела. Полученный материал обрабатывают иммуноглобулинами (IgМ или IgG), меченными ферментом.

15. Клиническая оценка результатов лабораторной диагностики сифилиса

В таблице 1 ниже мы привели возможные результаты анализов и их расшифровку. Как можно видеть в таблице, основное значение при расшифровке имеет комплексная оценка тестов.

Таблица 1 - Расшифровка результатов серологических реакций (анализов крови на сифилис). Для просмотра кликните по таблице

Оценка реактивности тестов выполняется также «крестами»:

1 Максимальный ответ (резко положительная проба) обозначается с помощью 4-х крестов.
2 Положительная проба обозначается с помощью 3-х крестов.
3 Слабоположительную реакцию обозначают двумя крестами.
4 Один крест свидетельствует о сомнительном и отрицательном результате.
5 Отрицательный ответ маркируют знаком «минус».

Проблема оптимизации лабораторной диагностики сифилиса не потеряла свою актуальность до настоящего времени. Современные методы диагностики, несмотря на стремление учёных привести диагностику к максимально высоким показателям чувствительности и специфичности, требуют контрольной проверки и индивидуального подхода.

Особенностью сифилитической инфекции является феномен серорезистентности, который так и не получил научного объяснения. Диагноз выставляется после полноценного обследования больного эпидемиологическими, клиническими, лабораторными методами.

На фоне экономико-технического развития медицины наблюдается и прогресс в разработке новых критериев диагностики сифилиса. Всё это позволит быстро, успешно и безошибочно лечить пациентов.