Культур клеток

Животных

Индикация вирусов по следующим феноменам

Отставание в развитии,

гибель, изменение

оболочек эмбриона, РГА

ЦПД, образование бляшек, РИФ, РГадс, интерференция

Заболевание, гибель,

гистологические изменения

в тканях, включения

Титрование выделенного вируса; выбор рабочей дозы .

Титр вируса - максимальное разведение вируссодержащего материала, в котором еще наблюдается ожидаемый эффект (ЦПД, РГА, гибель животного).

Идентификация выделенного вируса в реакциях нейтрализации, РТГадс, РСК, подавление бляшкообразования и др. с диагностическими сыворотками. Вид (тип) вируса определяется по нейтрализации специфического эффекта вируса соответствующей иммунной сыворотокой.

Примечание: титрование и идентификация вируса проводится с использованием одного и того же феномена.

Культивирование вирусов

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА

_________________________________________________________________

ОСОБЕННОСТИ РНК-ВИРУСНЫХ И ДНК-ВИРУСНЫХ

ИНФЕКЦИЙ
Методические рекомендации по изучению теоретического материала

по курсу «Частная медицинская вирусология»

для иностранных студентов
Для специальности 060101 – Лечебное дело

Нальчик - 2010

ББК 52.63я73

Рецензент:

кандидат биологических наук старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии Кабардино-Балкарской государственной

сельскохозяйственной академии

М.Х. Пежева

Составитель: Блиева Лариса Заурбековна

Особенности РНК-вирусных и ДНК-вирусных инфекций: Методические рекомендации по изучению теоретического материала по курсу «Частная медицинская вирусология» для иностранных студентов - Нальчик: Каб.-Балк. ун-т,2010.- 48 с.

В методических рекомендациях представлены цели и задачи каждой темы, теоретические сведения по частной вирусологии, требования к уровню подготовленности студентов. К каждой теме даются контрольные вопросы, ситуационные задачи и список рекомендуемой литературы. Работа содержит глоссарий основных понятий и определений по частной вирусологии.

Издание предназначено для иностранных студентов, обучающихся на 3 курсе по специальности «Лечебное дело».

УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

государственный университет, 2010

Курс «Частная медицинская вирусология» преподаётся студентам 3 курса медицинского факультета и является составной частью дисциплины «Микробиология, вирусология, иммунология». Общий объём аудиторных часов по дисциплине составляет 184. На медицинскую вирусологию отводится 11 часов, из которых 2 часа на лекции и по 3 часа на 3 лабораторных занятия. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным работам. Существующий лабораторный практикум не содержит весь необходимый материал для усвоения данных тем.

Иностранным студентам сложно осваивать большой объём информации за 3 лабораторных занятия. Автор счёл целесообразным изложить в данном издании краткое описание возбудителей вирусных инфекций и патогенезы, вызываемых ими заболеваний.

К каждой теме даётся перечень контрольных вопросов; ситуационные задачи, которые позволят студентам оценить свою подготовленность по пройденной теме; список рекомендуемой литературы.

Справочная часть издания содержит характеристику основных понятий и терминов применяемых в современной вирусологии и схемы строения самых распространённых вирусов. Алфавитный порядок изложения терминологического словаря-справочника удобен для пользования.
ТЕМА 1. РНК-содержащие вирусы

Цель – изучение особенностей строения РНК-содержащих вирусов и патогенеза, вызываемых ими заболеваний.

Задачи :

1 – знать систематическое положение каждого возбудителя;

2 – знать морфологию и структуру возбудителей;

3 – изучить патогенез всех заболеваний, вызываемых данными возбудителями по плану: а) источник инфекции; б) способы заражения; в) входные ворота инфекции; г) стадии патогенеза;

4 – знать методы лабораторной диагностики заболевания;

5 – знать специфическую профилактику и специфическую терапию;

6 – уметь проводить дифференциацию между различными вирусами;

7 – владеть решением ситуационных задач по теме;

8 – владеть составлением ситуационных задач по теме.
Характеристика РНК-вирусов

Занятие 1

Семейство Orthomyxoviridae (от греч. orthos – прямой, myxa – слизь)

Род 1 - Influensavirus A, B

Вирус гриппа типа А

Вирус гриппа типа В

Род 2 - Influensavirus C

Вирус гриппа типа С

Особенности патогенеза гриппа

Источник – больной человек, носитель; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 1-3 дня. Продромальный период – общее недомогание, чувство разбитости. Основные симптомы – быстрое повышение температуры до 37,5-38 0 С с сопутствующими миалгиями , насморком, кашлем, головными болями; продолжительность лихорадочного периода 3-5 суток. Вирус гриппа А – нейротропен, поэтому возможно развитие нейротоксикоза. Развивается катар верхних дыхательных путей (сухой кашель, боли за грудиной, ринит). Возможна геморрагическая пневмония и отёк лёгких, в результате чего быстро наступает смерть. Редко и чаще у детей бывает абдоминальный синдром (боли в животе, тошнота, рвота, диарея).

Лабораторная диагностика

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в исследуемом материале (носоглоточное отделяемое) с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) (прямой и непрямой варианты) и иммуноферментного анализа (ИФА). Можо обнаружить в материале геном вирусов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вирусологический метод. Заражают культуры клеток HeLa-2, через сутки при микроскопии обнаруживают мелкоочаговую дегрануляцию в клеточной культуре. Индикацию вирусов проводят и по образованию «бляшек», «цветной пробе», реакции гемагглютинации и реакции гемадсорбции. Идентифицируют вирусы по антигенной структуре. Применяют реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации и реакцию биологической нейтрализации вирусов.

Серологический метод. Диагноз ставят при четырёхкратном увеличении титра антител в парных сыворотках от больного, полученных с интервалом в 10-14 дней. При постановке реакции нейтрализации цитопатического эффекта положительный результат отмечают при внесении сыворотки типа А. применяют реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ. Специфическая профилактика – живая аттенуированная вакцина, убитая вакцина, сплит-вакцины, химическая вакцина. Специфическая терапия – противогриппозный γ-глобулин.

Семейство Paramyxoviridae (от лат. рara – около)

Род 1 – Respirovirus – вирусы парагриппа 1 и 3 типов

Род 2 – Rubulavirus – вирусы эпидемического паротита и парагриппа 2 и 4 типов

Род 3 – Morbilivirus – вирус кори

Род 4 – Pneumovirus – респираторно-синцитиальный вирус (РС-вирус)

Особенности патогенеза парагриппа

Источник – больной человек, носитель; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 3-6 суток; у взрослых – в форме катаров верхних отделов дыхательных путей (ларингит); у детей – протекает тяжелее, часто с симптомами интоксикации, наиболее часто наблюдают ларинготрахеобронхит с развитием ложного крупа; у детей до года – бронхиолиты с пневмониями.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. От больного берут слизь или смыв из дыхательных путей , мокроту и заражают культуру клеток. Индикацию проводят по цитопатическому действию вирусов, реакции гемагглютинации. Идентификацию осуществляют с помощью реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации.

Серологический метод . Для выявления антигенов вируса и для обнаружения антител в парных сыворотках крови больного проводят реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию нейтрализации (ретроспективная диагностика). Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Особенности патогенеза эпидемического паротита, или «свинки»

Источник – больной человек; способ заражения – воздушно-капельный. Инкубационный период – 14-21 день. Типичная форма заболевания проявляется как одно- или двусторонний паротит, сопровождающийся лихорадкой. Инфицировании околоушных слюнных желёз происходит путём гематогенного распространения вируса, возникающего через 3-5 суток появления первых симптомов. Вирусемия приводит к дессиминированию вируса по всему организму; возможны серозные менингиты, эпидидимоорхиты, как следствие – бесплодие. Иммунитет стойкий.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуемым материалом (слюна, цереброспинальная жидкость, моча, сыворотка крови) заражают культуру клеток куриных фибробластов или куриный эмбрион. Вирус идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации, реакции иммунофлюоресценции, реакции нейтрализации, реакции связывания комплемента.

Серологический метод. В парных сыворотках больного определяют антитела с помощью иммуноферментного анализа, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации. Специфическая диагностика – живая вакцина, ассоциированная вакцина (против кори, паротита, краснухи). Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза кори

Источник – больной человек (чаще дети 4-5 лет); способы заражения – воздушно-капельный, реже контактный. Инкубационный период – 8-15 дней. Острые респираторные проявления (ринит, фарингит, конъюнктивит, фотофобия, температура 38,8-39 0 С). На 3-4 день на слизистых оболочках и коже появляются пятнисто-папулёзная сыпь: сначала на лице, затем на туловище и конечностях. За сутки до появления сыпи на слизистой оболочке щёк появляются мелкие пятна, окружённые красным ореолом. Заболевание продолжается 7-9 дней, сыпь исчезает, не оставляя следов. Иммунитет пожизненный.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуют смыв из носоглотки, соскобы с элементов сыпи, кровь, мочу. Вирус обнаруживают в патологическом материале и в заражённых культурах клеток с помощью реакции иммунофлюоресценции , реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации. Характерно наличие многоядерных клеток и антигенов возбудителя в них.

Серологический метод. Для серологической диагностики применяют реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации и реакцию нейтрализации. Специфическая профилактика – живая аттенуированая вакцина. Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых респираторно- синцитиальным вирусом

Источник – больной человек; способы заражения – воздушно-капельный, контактно-бытовой. Возбудитель проникает в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, размножается, вызывая их гибель, патологический процесс распространяется на нижние дыхательные пути, развивается вторичный иммунодефицит, что приводит к развитию вторичных бактериальных инфекций. Инкубационный период – 3-5 дней. Признаки ОРЗ, затем трахеобронхит, пневмония. Иммунитет непродолжительный, возможны рецидивы.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Исследуемым материалом (отделяемое носоглотки, ткань лёгких) заражают культуры клеток. Индикацию вирусов проводят по характеру цитопатического действия – образованию синцития, а идентификацию вирусов – с помощью реакции нейтрализации, реакции связывания комплемента.

Серологический метод. Обнаружение специфического антигена проводят с помощью реакции иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа (экспресс-диагностика).

Вирусоскопический метод. При микроскопическом (гистологическом) исследовании в эпителии слизистой оболочки бронхов обнаруживают многоядерные клетки и синцитий. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Контрольные вопросы:

1. 
   Вирус гриппа: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
2. 
   Вирус парагриппа: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
3. 
   Вирус паротита: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
4. 
   Вирус кори: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
5. 
   Респираторно-синцитиальный вирус: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.

1. 
   Поступил материал (соскобы с элементов сыпи) от ребёнка с острыми респираторными проявлениями, фотофобией, температурой 38,8-39,0 0 С и пятнисто-папулёзной сыпью на слизистых оболочках и коже. При заражении культур клеток были обнаружены многоядерные клетки. Определите возбудителя.
2. 
   Поступил материал (отделяемое носоглотки) от ребёнка с признаками острого респираторного заболевания. С помощью вирусологического метода произвели индикацию возбудителя. В культуре клеток наблюдалось образование синцития. Определите возбудителя заболевания.

Семейство Picornaviridae

Род 1 – Enterovirus – вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО-вирусы

Особенности патогенеза полиомиелита

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный; воздушно-капельный; контактный. Инкубационный период – 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную, абортивную. Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле. Паралитическую форму чаще вызывает вирус полиомиелита серотипа 1. Иммунитет пожизненный.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Материалом для исследования служат кал, отделяемое носоглотки, при летальных исходах – кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы. Культуры клеток заражают исследуемым материалом. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют (типируют) выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток.

Серологический метод. Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Специфическая профилактика – массовая иммунизация детей пероральной живой вакциной из 3-х серотипов. Специфическая терапия – отсутствует.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный, контактный. Инфекции часто наблюдают у детей. Обычно отмечают симптомы простуды или лихорадку неясного генеза. В редких случаях развиваются тяжёлые поражения – пузырчатка полости рта и конечностей, эпидемическая плевродиния, перикардиты и миокардиты. Острые кишечные вирусные заболевания вызывают только вирусы группы А.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Материалом для исследования являются испражнения, отделяемое носоглотки. Заражают культуры клеток HeLa или почек обезьян (Коксаки В, отдельные серотипы Коксаки А) или мышей сосунков. Учитывают характер патологических изменений у заражённых мышей. Вирусы идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Особенности патогенеза заболеваний, вызываемых ЕСНО-вирусами

Источник – больной человек; способ заражения – фекально-оральный, воздушно-капельный. Вирусы вызывают простудные инфекционные заболевания, асептические менингиты, протекающие относительно легко, реже восходящие параличи и энцефалиты, лихорадочное состояние, сопровождающееся кореподобными высыпаниями.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Вирус выделяют из цереброспинальной жидкости, испражнений, отделяемого носоглотки. Заражают культуры клеток почек обезьян и идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе.

Серологический метод. В сыворотке крови выявляют нарастание титра антител, используя реакцию торможения гемагглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.
Семейство Togaviridae

Род 1 – Rubivirus – вирус краснухи

Особенности патогенеза краснухи

Источник – больной человек, носитель; способы заражения – воздушно-капельный, трансплацентарный. Различают 2 формы болезни: 1 – приобретённая. Инкубационный период – 11-24 дня. Заболевание начинается с незначительного повышения температуры и лёгких катаральных симптомов, конъюнктивита, а также увеличения заднешейных и затылочных лимфатических узлов. В последующем появляется пятнисто-папулёзная сыпь по всему телу. Иммунитет стойкий.

2 – врождённая – медленная вирусная инфекция, развивающаяся в результате внутриутробного трансплацентарного заражения плода. Заболевание характеризуется развитием катаракты, глухоты и пороков сердца, а также других аномалий развития. Слепота в сочетании с глухотой и поражением ЦНС приводит к умственной отсталости. Иммунитет нескойкий.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод. Выделяют вирус из смывов со слизистой оболочки носа и зева, крови, мочи, реже – испражнений, а также внутренних органов погибших детей. Заражают исследуемым материалом чувствительные клетки, индикацию вирусов осуществляют на основании интерференции с цитопатогенными вирусами или по обнаружению цитопатического действия.

Серологический метод. Для обнаружения антител применяют реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию торможения гемагглютинации, иммуноферментный анализ. Диагностическое значение имеет четырёхкратное и более увеличение титров антител в динамике заболевания, а также определение специфических IgM, свидетельствующих о недавно перенесённом заболевании или болезни в момент обследования. Специфическая профилактика – живая вакцина, ассоциированная вакцина. Специфическая терапия – отсутствует.

Семейство Rhabdoviridae

Род 1 – Lessavirus – вирус бешенства

Особенности патогенеза бешенства

Источники – дикое бешенство – лисы, волки, грызуны, летучие мыши, городское бешенство – собаки, кошки; способы заражения – контактный при укусах, реже – при обильном ослюнении повреждённых покровов, возможен аэрогенный в пещерах населённых летучими мышами, иногда алиментарный. Вирус, попав со слюной больного животного в повреждённые наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. В цитоплазме нейронов мозга обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Клетки претерпевают дегенеративные изменения. Размножившись вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период от 10 дней до 3 месяцев, иногда до года. В начале заболевания – недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани. Судороги усиливаются при попытке пить, при виде льющейся воды, от яркого света, шума. Развиваются галлюцинации, а в конце болезни – параличи мышц конечностей и дыхания. Реже болезнь развивается без возбуждения и водобоязни; развивается паралич и слюнотечение. Летальность – 95%. Постинфекционный иммунитет не изучен.

Лабораторная диагностика

Вирусоскопический метод. Постмортальная диагностика включает обнаружение телец Бабеша-Негри в мазках отпечатках или срезах из ткани мозга. Тельца Бабеша-Негри выявляют методами окраски по Романовскому-Гимзе, Манну, Туревичу, Муромцеву и др.

Вирусологический метод. Патологический материал интрацеребрально вводят белым мышам. Идентификацию вирусов проводят с помощью иммуноферментного анализа, а также реакции нейтрализации на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.

Серологический метод. Определяют антитела у больных с помощью реакции связывания комплемента, иммуноферментного анализа. Специфическая профилактика и терапия – инактивированная вакцина Ферми, генно-инженерная вакцина. Иммунизируют людей укушенных подозрительными на бешенство животными. При этом активный иммунитет формируется во время инкубационного периода. При множественных укусах создают пассивный иммунитет введением антирабического иммуноглобулина.

Семейство Retroviridae

Род 1 – Lentivirus - ВИЧ

Особенности патогенеза ВИЧ-инфекции

Источник – больной человек, носитель; способы заражения – половой, парентеральный, трансплацентарный. Стадии ВИЧ-инфекции:

1 – инкубационный период – 2-4 недели;

2 – стадия первичных проявлений: острая лихорадка, лимфоденопатия, диарея, завершается стадия бессимптомной фазой, восстановлением самочувствия, может продолжаться годами;

3 – стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной систем, желудочно-кишечного тракта, возникновением злокачественных опухолей в различных сочетаниях;

4 – стадия – собственно СПИД, характеризуется кахексией, упорной диареей, адинамией, анемией, деменцией, снижением всех иммунных показателей с летальным исходом.

Лабораторная диагностика

Серологический метод. Для подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gp120, gp160, р24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gp105, gp140 у ВИЧ-2. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ-инфекции и при СПИДе. При любой положительной пробе для подтверждения результатов ставится реакция иммуноблоттинга. Применяют также ПЦР. Специфическая профилактика и специфическая терапия – отсутствуют.

Контрольные вопросы:

1. 
   Вирус полиомиелита: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
2. 
   Вирус Коксаки: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
3. 
   ЕСНО-вирус: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
4. 
   Вирус краснухи: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
5. 
   Вирус бешенства: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.
6. 
   Вирус иммунодефицита человека: систематика, строение, патогенез заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и терапия.

1. 
   Поступил материал для исследования (смыв со слизистой оболочки носа и зева) от ребёнка с лёгкими катаральными симптомами и увеличенными заднешейными и затылочными лимфатическими узлами. Произвели заражение культуры клеток, в которых после инкубации обнаружили ЦПД. Определите возбудителя.
2. 
   Поступил материал для исследования (испражнения) от ребёнка с признаками общего недомогания , головной болью, повышенной температурой. Произвели посев в культуру клеток, в которых после инкубации были обнаружены вирусные частицы устойчивые к эфиру. Определите возбудителя.

Литература

1. 
   Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007.
2. 
   Воробьёв А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник. – М.: МИА, 2004.
3. 
   Воробьёв А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: МИА, 2003.
4. 
   Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.
5. 
   Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
6. 
   Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник./ - 2-е изд., доп. и перераб. – Мн.: «Асар», 1999.
7. 
   Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для мед. вузов. – 3-е изд., испр. и доп. – СПб.: СпецЛит, 2002.
8. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / Под ред. А.А. Воробьёва – М.: Медицинское информационное агентство, 2004.
9. 
   Общая медицинская вирусология / Н.С. Горячкина и др.; под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д: Феникс, 2007.
10. 
    www. infections.ru/rus/all/mvb journals .shtml

Основными методами, используемыми в диагностике вирусных болезней, являются культивирование и идентификация вирусов.

Для доказательства вирусной этиологии болезни необходимо: выделение вируса из организма больной рыбы, пассирование его на культуре клеток или чувствительных рыбах, воспроизведение болезни у здоровых рыб того же или родственного вида, повторное выделение того же вируса от экспериментальных животных.

Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронная микроскопия вируса, изучение его физико-химических свойств, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках и симптомов у зараженных животных, различные иммунологические методы.

Вирусы выделяют в основном на однослойных первичных или перевиваемых клеточных культурах, подбирая в каждом случае культуры, чувствительные к данному вирусу. Для получения первичных культур клеток рыб наиболее часто используют гонады самок карпа или карася. Гонады должны быть II или II-III стадии зрелости по шкале Киселевича. Такие гонады не содержат икринок, различимых невооруженным глазом. В противном случае содержимое икринок будет отрицательно влиять на рост клеток. Культуры клеток из гонад карпа и карася готовят по утвержденной методике.

В качестве перевиваемых культур наиболее широко используют следующие клеточные линии: FHM - из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна; RTG- из гонад радужной форели; ЕРС - из оспенных разростов на коже карпа. Названные линии поддерживаются в специализированных лабораториях по изучению болезней рыб ветеринарных и рыбохозяйственных научно-исследовательских институтов, где их можно заказать и получить.

При диагностике хорошо изученных вирусных болезней исследуют органы и ткани, где концентрируется возбудитель.

При болезнях рыб, сведения о которых недостаточны, вирусологическому исследованию подвергают наиболее пораженные органы. Соскобы с кожи и жабр, кусочки этих органов вместе со слизью помещают в стерильные флаконы с 2-3 мл стерильного физиологического или буферного раствора. Пробы из внутренних органов берут в строго асептических условиях.

В тех случаях, когда быстро исследовать материал невозможно, его сохраняют не более суток в холодильнике при температуре не выше 5°С. Материал в замороженном состоянии можно сохранять более длительное время.

Предназначенный для исследования патологический материал измельчают в гомогенизаторе или растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Из измельченных тканей готовят 10 %-ную суспензию на растворах Хенкса, Эрла, буферном или физиологическом растворе и центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и помещают в стерильные флаконы. Если суспензия не стерильна, подготовленные материалы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2-0,45 мкм или обрабатывают антибиотиками (пенициллин 1000 ЕД/мл и стрептомицин 1000 мкг/мл).

Из кишечного содержимого готовят 20 %-ную взвесь в стерильной дистиллированной воде и центрифугируют 10-15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 4000-5000 об/мин в течение 30 мин. Затем надосадочную жидкость отсасывают в стерильный флакон и обрабатывают антибиотиками. На 1 мл добавляют 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 ЕД/мл пенициллина. Смесь выдерживают 2-3 ч при: комнатной температуре. Все материалы проверяют на бактериальную стерильность путем посева на МПБ и МПА. Приготовленные материалы сразу используют для работы или, в крайнем случае, сохраняют в замороженном состоянии (при температуре минус 20°С).

Заражение культуры клеток . Для заражения используют пробирки с хорошим клеточным монослоем или зоной роста вокруг эксплантата. Питательную среду отсасывают и в каждую пробирку вносят по 0,2-0,3 мл исследуемой суспензии. Одновременно в пробирки добавляют по 0,8-0,9 мл питательной среды с 2-3 % сыворотки.

Материалом, приготовленным из каждой пробы, заражают культуру тканей в 4-6 пробирках. Из каждой серии исследований столько же пробирок оставляют в качестве контроля, добавляя в них по 1 мл питательной среды. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч для адсорбции вируса на клетках, затем отсасывают пипеткой надосадочную жидкость и вносят поддерживающую питательную среду до первоначального объема.

Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 22-26°С и ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения появившихся морфологических изменений в клетках. При выраженной дегенерации клеток культуральную жидкость отсасывают и делают пассажи, а при отсутствии цитопатогенного действия (ЦПД) проводят два последовательных пассажа. Для этого используют культуральную жидкость вместе с клеточной фракцией, разрушенной путем повторного замораживания и оттаивания. Для заражения свежих культур используют надосадочную жидкость центрифугированной клеточной массы. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое действие вирусного агента.

Степень поражения клеточного монослоя оценивается по 4-крестовой системе; " + - поражение до 25%, "+ + " - до 50%, "+ + +" - до 75% и "+ + + + " - до 100 % монослоя.

При некоторых вирусных заболеваниях рыб в клетках (цитоплазме ядре) различных органов и тканей появляются тельца-включения. Материалом для исследования вирусных включений служат инфицированные культуры тканей, соскобы и мазки-отпечатки из органов и тканей, казанные материалы перед окраской фиксируют по общепринятым методам, спользуя жидкости Дюбоск - Бразил - Буэна, Буэна, Карнуа или 10 %-ный раствор нейтрального формалина.

Вирусные включения окрашивают различными методами: по Муромцеву, рубиной, Манну, Селлексу, Клисенко, Романовскому-Гимзе, Май-Грюн-альду - Гимзе и др.

Титрование вируса - количественное определение вирусной активности. Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся единице объема суспензии вируса. За инфекционную единицу вируса принимается такая его доза, которая вызывает инфекцию у 50 % зараженных ею чувствительных объектов. Такая доза вируса называется инфекционной и обозначается ИД 50 .

В качестве чувствительных объектов при титровании вирусов рыб используют главным образом культуры клеток. Титрование на культуре клеток осуществляют по цитопатогенному действию вирусов. В этом случае ИД 50 называют тканевой цитопатогенной дозой (ТЦД 50), а титр вируса выражают количеством ТЦД 50 в 1 мл вирусной суспензии. Титр вируса при этом определяют методом конечных разведений. Согласно этому методу чувствительные культуры клеток вводят определенный объем суспензии вируса в последовательно возрастающих разведениях и, учитывая результат к аждого введения как положительный (если есть ЦПД) или отрицательный если ЦПД отсутствует), рассчитывают конечную точку титрования - 1 ТЦД 50 .

Для титрования вирусов, дающих ярко выраженное ЦПД, используют также метод бляшек. При этом зараженный вирусом монослой клеток заливают смесью питательной среды с агаром, чтобы предотвратить перенос вируса на другие клетки, значительно удаленные от первично инфицированных, и иметь возможность инфицировать первоначальные очаги заражения бляшки).

Каждая бляшка возникает из одной инфекционной единицы, которую обозначают БОЕ (бляшкообразующая единица), а титр вируса выражают количеством БОЕ в единице объема суспензии.

Реакция нейтрализации (РН) на культуре клеток .

В основе реакции лежит связывание антигена антителами гомологичной антисыворотки. Реакцию используют для идентификации возбудителей при диаг-остике заболеваний вирусной этиологии. Она позволяет определять по из-естным антителам неизвестный вирусный антиген или по заведомо известному (стандартному) антигену - неизвестные антитела в сыворотках больных ли переболевших рыб.

Определение выделенного вируса в реакции нейтрализации проводят, применяя набор диагностических гипериммунных антисывороток (антител) гомологичных к ним антигенов (вирусов).

Гипериммунные антисыворотки получают при заражении лабораторных животных (например, кроликов) известными штаммами вирусов - возбудителей болезней рыб. У полученных антисывороток определяют титры специфических антител. Для работы берут антисыворотки, содержащие антитела в высоких титрах.

Порядок проведения реакции.

1. Инактивирование нормальной и гипериммунной сыворотки прогреванием при 56 о С в течение 30 мин.

2. Приготовление разведений ингредиентов реакции. Питательной средой без сыворотки и антибиотиков разводят антиген и сыворотки, начиная с 1: 5, 1: 50, 1: 500 и до получения разведения содержанием менее 1 ТЦД 50 /0,2 мл. Гипериммунную сыворотку разводят 1: 2 или 1: 5. При малом титре сыворотку используют неразведенной. Нормальную сыворотку разводят так же, как и гипериммунную.

3. Постановка реакции. В штативе размещают три ряда стерильных пробирок. В первый ряд разливают разведенную гипериммунную сыворотку, во второй - разведенную нормальную сыворотку, в третий - питательную среду. Каждый ингредиент вносят в объеме 0,5 мл.

Приготовленные разведения вируса переносят по 0,5 мл в соответствующие пробирки каждого из трех рядов, причем вирус каждого разведения I переносят отдельной пипеткой, начиная с наибольшего разведения. Таким образом, в каждом ряду пробирок получают последовательные 10-кратные разведения вируса: 10-1, 10-2 и т. д.

Для контроля токсичности сывороток в отдельную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного разведения гипериммунной сыворотки, а затем прибавляют равное количество питательной среды. То же проделывают с нормальной сывороткой.

Пробирки со смесями тщательно встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем заражают культуру клеток каждым разведением вируса (0,2 мл на каждую пробирку) с гипериммунной нормальной сыворотками и питательной средой по 4 пробирки культуры клеток. Параллельно ставят контроли на токсичность используемых клеток и контрольные пробы культуры клеток.

Пробирки с культурой клеток инкубируют в термостате при оптимальной для размножения данного вируса температуре, ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения ЦПД вируса. Результаты заносят в таблицу (табл. 11).

Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся в единице объема суспензии вируса. Находят индекс нейтрализации (IN). Он соответствует максимальному количеству ИД 50 , которое может быть нейтрализовано гипериммунной сывороткой. Расчет IN ведут по формуле: lgIN = lgT 1 -lgT 2 , где Т 1 - титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т 2 - титр вируса в присутствии гипериммунной сыворотки. Значение IN находят по таблице антилогарифмов. Принято считать значение IN до 10 отрицательным, от 10 до 49 - сомнительным, 50 и более - положительным результатом.

Результаты реакции можно считать достоверными только в том случае если гипериммунная сыворотка проверена на специфическую нейтрализующую активность. Для этого предварительно определяют титр нейтрализующих антител в этой сыворотке или ее индекс нейтрализации в реакции с гомологичным вирусом.

Выделение рабдовирусов методом бляшек . Данный метод специфический, применяют его для выделения, предварительного типирования и селекции рабдовирусов карпа, форели при наличии специфических иммунных сывороток для идентификации вируса.

Округлые колонии (бляшки) образуются в клеточных культурах под агаровым покрытием при наличии вируса в исследуемом материале.

В асептических условиях пастеровской пипеткой набирают ткань почек, печени, селезенки и жидкость из брюшной полости, переносят во флакон со средой, содержащей по 500 ME (мкг)/мл антибиотиков в соотношении 1: 10. выдерживают 60-90 мин при температуре 18-22°С, затем центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разводят питательной средой 1: 10 (разведение 1: 100). Для заражения клеточных культур используют надосадочные жидкости обоих разведений.

Для исследования отбирают 3-суточную перевиваемую культуру клеток, выращенную в матрацах с хорошо выраженным монослоем, из расчета 2 матраца на каждое разведение патологического материала и по 2 матраца для контроля. Из флаконов удаляют питательную среду и вносят по 2 мл среды без эмбриональной сыворотки. Затем вносят по 0,2 мл исследуемого патматериала и оставляют для адсорбции вируса на 60 мин при температуре оптимальной для вирусов, поражающих рыб (для вирусов карпа - 24-26°С и для вирусов форели-16-18°С).

Контроль ставят в 2 матрацах с клеточными культурами по 0,2 мл, содержащих по 100 ТЦД 50 /мл известного вируса, а в 2 - по 0,2 мл питательной среды без вируса.

Через 60 мин жидкость из флаконов удаляют. По стенке, противоположной монослою, вносят во флакон емкостью 50 мл 5 мл агарового покрытия, нагретого до 40-42°С (при выделении вируса ВГС - не более 38°С). Матрацы поворачивают монослоем вниз, покрывают черной бумагой. Через 15-20 мин матрацы переносят для инкубации при оптимальной для изучаемых вирусов температуре. Матрацы кладут агаровым покрытием вверх. При неизвестном вирусе культуры содержат при двух температурных режимах - 14-18 и 22-24°С.

Зараженные клеточные культуры просматривают на белом фоне. При наличии в изучаемом материале вируса в клеточной культуре вначале появляются прозрачные точки на розово-матовом фоне культуры. В дальнейшем они увеличиваются в размере, образуя круглые прозрачные колонии - бляшки, наличие которых свидетельствует о наличии в патматериале рабдовирусов.

Пастеровской пипеткой набирают кусочек бляшки на границе пораженной и непораженной части с таким расчетом, чтобы попал не только агаровый, но и клеточный слой. Отобранный кусочек помещают в пробирку с 1 мл ростовой среды, замораживают при минус 20°С и выдерживают 60 мин. В случае большого количества бляшек (весь клеточный слой прозрачный) исследования повторяют в разведениях 10 -3 и 10 -4 .

Бляшки диаметром 3-8 мм рабдовируса карпа на перевиваемой культуре ЕРС и FHM, инкубируемой при температуре 24-26°С, проявляются на 4-7-й день.

При отсутствии бляшек и наличии ЦПД в клеточных культурах проводят дополнительные исследования вируссодержащей культуральной жидкости в разведениях 10 -2 -10 -3 (2-3 пассажа). В качестве дополнительных методов идентификации вирусов используют: метод флуоресцирующих антител; определение чувствительности вируса к хлороформу, эфиру, величине рН, нагреванию; электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусов.

15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;

Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа - условно-патогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе - особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика - раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

1. Аллергический.

2. Микроскопический.

3. Культуральный.

4. Биологический.

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.

Курсовая работа

"Методы клинической вирусологии"

Введение

Лабораторную диагностику вирусных инфекций проводят в основном с помощью электронной микроскопии, чувствительных культур клеток и иммунологическими методами. Как правило, для постановки диагноза выбирают какой-либо один метод в зависимости от стадии вирусной инфекции. Так, например, все три подхода могут оказаться полезными при диагностике ветряной оспы, однако успешное применение микроскопии и метода культуры клеток зависит от возможности сбора удовлетворительных образцов на относительно раннем этапе заболевания.

В большой степени успех вирусной диагностики зависит и от качества полученных образцов. По этой причине сами сотрудники лаборатории должны принимать непосредственное участие в сборе необходимых образцов. Характеристики образцов, а также способы их доставки в лабораторию описаны Леннетом, Шмидтом, Кристом и др.

Большинство реактивов и инструментов, используемых в лабораторной диагностике, можно приобрести у различных фирм. В большинстве случаев один и тот же реактив выпускается одновременно несколькими фирмами. По этой причине мы не указывали отдельные фирмы, кроме тех случаев, когда реактив поставляется только одной фирмой. Во всех остальных случаях следует обратиться к общему перечню поставщиков, указанных в табл. 1.

Мы не ставили своей целью всестороннее описание всех имеющихся в настоящее время методов диагностики вирусных инфекций человека. Прежде всего мы охарактеризовали основные методы. По мере накопления опыта самостоятельной работы эти основные методы можно будет использовать для решения более сложных задач.

1. Электронная микроскопия

Для электронно-микроскопической диагностики вирусных инфекций можно использовать тонкие срезы пораженной ткани. Чаще всего материалом для электронной микроскопии служат фекалии или жидкость

Таблица 1. Список фирм, поставляющих реактивы и оборудование

везикул, характеризующих некоторые болезни, например ветряную оспу. При анализе такого материала вирусы можно обнаружить с помощью негативного окрашивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона электронно-плотным материалом. Метод эффективен при высокой концентрации вируса в исследуемых образцах, как, например, в фекалиях или везикулярной жидкости. В тех случаях, когда содержание вирусных частиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса можно увеличить, концентрируя вирус ультрацентрифугированием или агрегируя его специфическими антителами. Последний метод удобен и для идентификации вирусов. Здесь мы опишем электронно-микроскопический метод диагностики ротавирусной инфекции и метод иммуноэлектронной микроскопии на примере обнаружения специфических антител к парвовирусам. Более подробно методы электронной микроскопии изложены Филдом.

2.1 Прямое электронно-микроскопическое исследование фекалий

1. Конец пастеровской пипетки погружают в фекалии и набирают достаточное количество материала для получения мазка размером 1 см.

2. Ресуспендируют фекальный мазок в электронно-микроскопической краске для негативного контрастирования до получения полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контрастирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде.

3. Для получения электронно-микроскопического препарата капельку суспензии помещают на сетку для электронного микроскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой. Во время этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.

4. Препарат оставляют на воздухе на 30 с.

5. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю стекла фильтровальной бумагой.

6. Препарат высушивают на воздухе.

7. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсивностью 440 000 мкВт-с/см 2 . При этом используют коротковолновую ультрафиолетовую лампу с фильтром. Лампа должна находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения каждой стороны - 5 мин.

8. Вирионы ротавирусов можно охарактеризовать под трансмиссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000 до 50 000.

2.2 Иммуноэлектронная микроскопия

Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии представляет собой только один из множества подобных иммунологических методов. Для исследования вирусоспецифических антител, кроме того, используют метод, предполагающий связывание с микроскопической сеткой белка А. Рабочую концентрацию антивирусных антител определяют методом проб и ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами концентрация, как правило, используется в рутинной работе. Для получения оптимальных результатов взаимодействия антител с вирусом таким же образом титруют сыворотку, содержащую парвовирус.

1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.

2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.

3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.

4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.

6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус.

7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.

8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.

9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.

10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.

Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.

3. Идентификация вирусных антигенов

Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях, можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам с помощью реакции антиген - антитело. Продукт реакции антиген - антитело тестируют по метке, которую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела, либо в антитела, направленные против вирусоспецифических антител. Антитела можно пометить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того, для идентификации вируса используют реакцию гемагглютинации. В повседневной практике описанные методы применяют главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих различные респираторные заболевания.

В настоящее время многими фирмами выпускаются эритроцитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы, в том числе для обнаружения вируса гепатита В. Мы не считаем целесообразным излагать методы работы с указанными диагностикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструкциям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе идентификации респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях.

3.1 Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции

Метод получения препаратов носоглоточных выделений описан Гарднером и Мак-Квилином. В лабораторных условиях эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные мазки можно хранить в фиксированном состоянии при -20 °С в течение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуоресценции.

3.1.1 Приготовление препаратов носоглоточных выделений

1. Слизь со специальных щипцов смывают 1-2 мл PBS и переносят в центрифужную пробирку.

2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

3. Надосадочную жидкость сливают.

4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2-3 мл PBS до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-рокогорлую пастеровскую пипетку.

5. Полученную суспензию переносят в пробирку.

6. К суспензии добавляют еще 2-4 мл PBS и перемешивают пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.

7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от стенок пробирки.

9. Полученную суспензию наносят на размеченное предметное стекло.

10. Стекло подсушивают на воздухе.

Фиксируют в ацетоне 10 мин при 4°С.

12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.

13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо хранят при -20 °С.

3.1.2. Методика окрашивания

1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисыворотку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.

2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат.

3. Препарат помещают во влажную камеру.

4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.

5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител в специальном резервуаре.

6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин в каждой.

7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.