В какви случаи имуноблотът се счита за съмнителен? Какво е имуноблот? Добавете вашата цена към базата данни за коментари. III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

Имуноблотинг (имуноблотинг, уестърн блот, уестърн блот)- комбинира ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с предварителен електрофоретичен трансфер на вирусни антигени върху нитроцелулозна лента (лента).

В това красиво научно наименование „петно“ най-вероятно се превежда като „петно“, а „западен“ - като „западен“ отразява посоката на разпространение на това „петно“ върху хартията отляво надясно, т.е. географска карта това съответства на посоката от запад на изток ". Същността на метода "имунно петно" е, че имуноензимната реакция се извършва не със смес от антигени, а с HIV антигени, предварително разпределени чрез имунофореза във фракции, разположени според молекулното тегло на повърхността на нитроцелулозната мембрана. В резултат на това основните HIV протеини, носители на антигенни детерминанти, се разпределят по повърхността под формата на отделни ивици, които се появяват по време на ензимно-свързана имуносорбентна реакция.

Имуноблотът включва няколко етапа:

Подготовка на лентата.Вирусът на имунната недостатъчност (HIV), предварително пречистен и унищожен на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза и антигените, които съставляват HIV, се разделят по молекулно тегло. След това, използвайки метода на попиване (аналогично на изстискване на излишното мастило върху попивателна подложка), антигените се прехвърлят върху лента от нитроцелулоза, която сега съдържа спектър от антигенни ленти, характерни за ХИВ, който все още е невидим за окото.

Изследване на проби.Тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху нитроцелулозната лента и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват със строго съответстващи (комплементарни) антигенни ивици. В резултат на последващи манипулации резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим.

Тълкуване на резултата.Наличието на ленти в определени области на нитроцелулозната плоча потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

Ивица A - Положителна контрола

Ивица B - Слаба положителна контрола

Ивица C - Отрицателна контрола

Ивица D - Положителна проба (открити антитела срещу HIV-1)

Понастоящем имуноблотингът (имуноблотинг) е основният метод за потвърждаване на наличието на вирус-специфични антитела в тестовия серум. В някои случаи на HIV инфекция, преди да настъпи сероконверсия, специфичните антитела се откриват по-ефективно чрез имуноблотинг, отколкото чрез ELISA. При изследване с помощта на метода на имуноблотинг беше установено, че най-често антитела срещу gp 41 се откриват в серума на пациенти със СПИН, а откриването на p24 при хора, изследвани за превантивни цели, изисква допълнителни изследвания, за да се определи дали имат HIV инфекция. Тестовите системи за имуноблотинг, базирани на генетично модифицирани рекомбинантни протеини, се оказаха по-специфични от конвенционалните системи, базирани на пречистен вирусен лизат. При използване на рекомбинантен антиген се образува не дифузна, а ясно очертана тясна антигенна лента, която е лесно достъпна за запис и оценка.

Серумите на индивиди, заразени с HIV-1, разкриват антитела към следните основни протеини и гликопротеини - протеини на структурната обвивка (env) - gp160, gp120, gp41; ядро (gag) - p17, p24, p55, както и вирусни ензими (pol) - p31, p51, p66. Антителата към env са характерни за HIV-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - стр.68.

Сред лабораторните методи, необходими за установяване на специфичността на реакцията, най-широко признато е откриването на антитела към протеините на обвивката на HIV-1 - gp41, gp120, gp160 и HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

СЗО счита за положителни серуми, в които чрез имуноблотинг се откриват антитела срещу всеки два HIV гликопротеина. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp 160, gp 120, gp 41) в комбинация или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен и се препоръчва повторно тестване с помощта на комплект от друга серия или от друга фирма. Ако и след това резултатът остане съмнителен, се препоръчва наблюдение в продължение на 6 месеца (изследване след 3 месеца).

Наличието на положителна реакция с антигена p24 може да означава период на сероконверсия, тъй като антителата към този протеин понякога се появяват първи. В този случай се препоръчва, в зависимост от клиничните и епидемиологичните данни, да се повтори изследването със серумна проба, взета най-малко 2 седмици по-късно, и това е точно случаят, когато е необходимо изследване на сдвоени серуми при HIV инфекция.

Положителните реакции с gag и pol протеини без реакция с env протеини могат да отразяват ранна сероконверсия и могат също да показват HIV-2 инфекция или неспецифична реакция. Индивиди с тези резултати след тестване за HIV-2 се тестват повторно след 3 месеца (в рамките на 6 месеца).

Имуноблотингът (imunoblotting) е високоспецифичен и високочувствителен референтен метод, който потвърждава диагнозата при пациенти с получени положителни или неопределени резултати от изследването, вкл. използвайки RPGA или ELISA .

Този метод за откриване на антитела към отделни антигени на патогена се основава на извършване на ELISA върху нитроцелулозни мембрани, върху които се нанасят специфични протеини под формата на отделни ивици, разделени чрез гел електрофореза. Ако има антитела срещу определени антигени, в съответното място на лентата се появява тъмна линия. Уникалността на имуноблота се състои във високата му информативност и надеждността на получените резултати.

Материал за изследванее човешки серум или плазма. За изследване на една лента са необходими 1,5-2 ml кръв или 15-25 µl серум.

Според препоръките на СЗО имуноблотингът (Western blot) се използва при диагностицирането на HIV инфекцията като допълнителен експертен метод, който трябва да потвърди резултатите от ELISA. Обикновено този метод проверява двойно положителен резултат от ELISA, тъй като се счита за по-чувствителен и специфичен, въпреки че е по-сложен и скъп.

Имуноблотингът комбинира ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им върху нитроцелулозна мембрана. Процедурата за имуноблот се състои от няколко етапа. Първо, HIV, предварително пречистен и унищожен на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза и всички антигени, включени във вируса, се разделят по молекулно тегло. След това, използвайки метода на блотиране, антигените се прехвърлят от гела върху лента от нитроцелулозен или найлонов филтър, който вече съдържа спектър от протеини, характерни за HIV, невидими за окото. След това тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху лентата и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват с антигенните протеинови ленти, които стриктно съответстват на тях. В резултат на последващи манипулации (подобно на ELISA), резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. Наличието на ленти в определени области на лентата потвърждава наличието в тествания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

Имуноблотингът най-често се използва за потвърждаване на диагнозата HIV инфекция. СЗО счита за положителни серуми, в които чрез имуноблотинг се откриват антитела срещу всеки два протеина от обвивката на ХИВ. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41) в комбинация или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен и се препоръчва повторно тестване, като се използва комплект от различна серия или от друга компания. Ако и след това резултатът остане съмнителен, изследванията продължават на всеки 3 месеца.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първия и втория тип. Ако човек е заразен, в рамките на две седмици се появяват антитела, които могат да бъдат открити много по-късно. Особеността на ХИВ е, че количеството антитела бързо се увеличава и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, заболяването може да не се прояви две или повече години. Методът ELISA не винаги точно определя наличието на заболяването, така че е необходимо потвърждаване на резултатите с помощта на имуноблотинг и PCR, ако ензимният имуноанализ показва положителен резултат.

Показания за употреба

Какво е „имуноблотинг“ вече е установено, но за кого е предписано това изследване? Причината да се изследвате за вируса на човешката имунна недостатъчност (ХИВ) чрез имуноблотинг метода е положителен резултат от ELISA. Необходимо е да се подложи на ензимен имуноанализ за пациенти, които ще бъдат подложени на операция. Освен това жените, които планират бременност, както и всички, които имат безразборни връзки, трябва да бъдат тествани. Имуноблотингът се предписва на пациенти с ХИВ, ако резултатите от ELISA са съмнителни.

Следните тревожни симптоми могат да бъдат причина да се консултирате с лекар:

• внезапна загуба на тегло;
• слабост, загуба на ефективност;
• чревно разстройство (диария), което продължава три седмици;
• дехидратация на тялото;
• треска;
• увеличени лимфни възли по тялото;
• развитие на кандидоза, туберкулоза, пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Не е необходимо пациентът да се подготвя преди даряването на венозна кръв. Не трябва да ядете храна 8-10 часа преди изследването. В деня преди кръводаряването не се препоръчва да се пият алкохолни напитки или кафе, да се занимавате с тежки физически упражнения или да изпитвате тревожност.

Как се провежда изследването?

От гледна точка на пациента имуноблотът не се различава от всеки друг анализ: взема се венозна кръв, изследва се и се получава резултатът. Но ако навлезем в малко повече подробности за методологията, тя не е много проста, но нека се опитаме да я разберем.

Първо, в завода за производство на реагенти се взема „референтен“ вирус на човешка имунна недостатъчност. След това чрез специална процедура (електрофореза) в гелова среда вирусът се унищожава до най-малките си компоненти: протеини (вирусни антигени). След това чрез самото блотиране (от англ. blotting) частиците се поставят върху специален материал – нитроцелулозен или найлонов филтър, за да се получи готов за употреба индикатор, така наречената лента. Лентата е лента, в която антигените са разпределени в зависимост от тяхното молекулно тегло, в ясна последователност, тоест всеки милиметър хартия съответства на определен протеин.

Както може би знаете, ако вирусите присъстват в кръвта на човек, тялото започва да произвежда антитела срещу техните черупки (определени протеини) и всеки вирус има свой собствен индивидуален набор от антигенни протеини. Откриването на антитела срещу антигенни протеини в кръвта е в основата на метода имуноблот. В крайна сметка, ако едно антитяло срещне антиген, тогава те със сигурност ще взаимодействат помежду си - „залепват“.

И така, антигените са на лентова лента и ако има подходящи антигени в кръвта на изследваното лице, те определено ще взаимодействат помежду си и на това място, на лентовата лента, ще се появи индикатор - плосък панел (като тест за бременност). Освен това, на определено място на лентата, по този начин лекарят ще разбере дали в кръвта има набор от протеини, които са характерни за определен вирус.

Така например, ако има потъмняване на лентата на места, където са локализирани протеини gp160, gp120, gp41 HIV е диагностициран, за други вируси това ще бъде напълно различен набор от протеини.

Трябва да се отбележи, че имуноблотът позволява точно да се определи наличието на вируса само ако наборът от антитела в кръвта е пълен, т.е. ако протеините gp160, gp120, gp41 присъстват едновременно, тогава това е 100% HIV инфекция . Но ако поне един липсва, например: gp41 липсва, но има само gp160, gp120, тогава тестът се счита за съмнителен и изисква повторение.

ЧЗВ

Какви етапи включва имуноблотингът?

1. Подготовка на лентата.Вирусът на имунната недостатъчност (HIV), предварително пречистен и унищожен на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза и антигените, които съставляват HIV, се разделят по молекулно тегло. След това, използвайки метода на попиване (аналогично на изстискване на излишното мастило върху попивателна подложка), антигените се прехвърлят върху лента от нитроцелулоза, която сега съдържа спектър от антигенни ленти, характерни за HIV, който все още е невидим за окото.
2. Изследване на проби.Тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху нитроцелулозната лента и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват със строго съответстващи (комплементарни) антигенни ивици. В резултат на последващи манипулации резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим.
3. Тълкуване на резултата.Наличието на ленти в определени области на нитроцелулозната плоча потвърждава наличието в изследвания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

• Ивица A – Положителна контрола
• Ивица B – Слаба положителна контрола
• Ивица C - Отрицателна контрола
• Ивица D – Положителна проба (открити антитела срещу HIV-1)

Как да дешифрирате анализа?

Ако ELISA показа наличието на всички или почти всички антитела към антигените според тази тестова система, това означава положителен тест за HIV. Ако отговорът след втория серологичен ензимен имуноанализ е положителен, трябва да се извърши имуноблотинг. Дешифрирането на неговите резултати ще бъде по-точно. Ако ензимният имуноанализ даде положителен резултат, следващият имуноблот анализ също показа наличието на HIV, тогава се дава окончателният резултат.

Когато тестовете се дешифрират, трябва да знаете, че положителният тест за ХИВ се определя от:

• 60% до 65% 28 дни след заразяването;
• в 80% – след 42 дни;
• в 90% – след 56 дни;
• в 95% – след 84 дни.

Ако отговорът на HIV е положителен, това ще означава, че са открити антитела срещу вируса. За да избегнете фалшив положителен отговор, трябва да вземете тестовете отново, за предпочитане два пъти. Ако се открият антитела срещу имунна недостатъчност при преминаване на два теста от два или при преминаване на 3 теста в 2 от тях, тогава резултатът се счита за положителен.

Антигенът p 24 може да бъде открит в кръвта в рамките на 14 дни от датата на инфекцията. Използвайки метода на ензимен имуноанализ, този антиген се открива от 14 до 56 дни. След 60 дни вече не е в кръвта. Само когато СПИН се образува в тялото, този протеин p24 нараства отново в кръвта. Ето защо, ензимните имуноанализни тестови системи се използват за откриване на ХИВ в първите дни на инфекцията или за определяне на прогресията на заболяването и проследяване на процеса на лечение. Високата аналитична чувствителност на ензимния имуноанализ открива р24 антиген в биологичен материал за HIV от първия подтип в концентрация от 5 до 10 pkg/ml, за HIV от втория подтип от 0,5 ng/ml или по-малко.

Под съмнителноРезултатът от ензимно-свързан имуносорбентен анализ предполага, че е имало грешка някъде в диагнозата, като правило нещо е объркано от медицински работници или лицето има признаци на инфекция, но резултатът е отрицателен, което поражда подозрение, и лицето се изпраща за повторен тест.

Под фалшиво положителнорезултат означава резултатът, когато са направени кръвни изследвания при следните състояния на пациента:

• бременност;
• ако човек има хормонален дисбаланс;
• с продължителна имуносупресия.

Как да дешифрирате анализа в този случай? Фалшиво положителен резултат се дава, ако се открие поне един протеин. Поради факта, че антигенът p24 е много зависим от индивидуалните вариации, с помощта на този метод в първия период на инфекция се откриват от 20% до 30% от пациентите.

Колко надежден е положителният резултат от теста?

Понякога ELISA дава фалшиво положителни резултати (в около 1% от случаите), причината за такъв резултат може да е бременност, различни вирусни инфекции или обикновен инцидент. След получаване на положителен резултат е необходим по-точен тест - имуноблот, въз основа на резултатите от който се поставя диагноза. Положителният резултат от имуноблот след положителен ELISA е 99,9% надежден - това е максималната точност за всеки медицински тест. Ако имуноблотът е отрицателен, това означава, че първият тест е бил фалшиво положителен и всъщност лицето няма ХИВ.

Какво е несигурен (съмнителен) резултат?

Ако ELISA е положителен или отрицателен, тогава имуноблотът може да бъде положителен, отрицателен или неопределен. Неопределен резултат от имуноблот, т.е. наличието на поне един протеин към вируса в имуноблота може да се наблюдава, ако инфекцията е настъпила наскоро и все още има малко антитела срещу HIV в кръвта, в който случай имуноблотът ще стане положителен след известно време. Също така може да се появи несигурен резултат при липса на HIV инфекция с хепатит, някои хронични метаболитни заболявания или по време на бременност. В този случай или имуноблотът ще стане отрицателен, или ще бъде открита причината за неопределения резултат.

Колко струва анализът?

Имуноблотът за ХИВ не е евтин тест. Средно скрининговото изследване с помощта на методи за имуноензимен анализ струва от 500 до 900 рубли. Имуноблотингът е изследване за проверка, чиято цена е от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR) ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Къде да направите анализа?

Къде мога да се изследвам за ХИВ? Изследванията ELISA и имуноблот се извършват в градски частни клиники, резултатите се дават в рамките на 24 часа. Възможна е и спешна диагностика. В обществените лечебни заведения ELISA тестове и имуноблотинг се извършват безплатно в съответствие със законодателството на Руската федерация. Бременните жени, както и пациентите, подложени на хоспитализация или операция, трябва да се подложат на тестове за инфекциозни заболявания.

Имуноблотинг –(от английски „blot“ - петно) - метод за идентифициране на антигени (или антитела) с помощта на известни серуми (или антигени). Това е комбинация от гел електрофореза и ELISA. Първоначално бактериалните клетки или вириони се унищожават с помощта на ултразвук, а след това всички антигени на вируса или бактериалните клетки се разделят чрез електрофореза и се получава търговски реагент върху специален нитроцелулозен филм. При извършване на имуноблотинг серумът на пациента, който се изследва, се нанася върху филм с известни антигени. След инкубиране и промиване на несвързани антитела, преминете към ELISA - антисерум към човешки имуноглобулини, маркирани с ензим и хромогенен субстрат, който променя цвета си при взаимодействие с ензима, се нанася върху филма. При наличие на антиген-антитяло-антисерум към имуноглобулин-ензимни комплекси върху носителя се появяват цветни петна. Методът на имуноблотинг ви позволява отделно да откривате антитела срещу различни патогенни антигени (например при HIV инфекция имуноблотингът открива антитела срещу gp120, gp24 и други вирусни антигени).

Радиоимуноанализ (RIA)

Методът се основава на реакция антиген-антитяло, като се използва радионуклидно маркиран антиген или антитяло. 125I, 14C, 3H, 51Cr и други радионуклиди се използват като етикети. Получените имунни комплекси се изолират от системата и тяхната радиоактивност се определя на броячи (β-лъчение). Интензитетът на радиацията е правопропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърдофазовият вариант на RIA, използващ белязани антитела или антигени, сорбирани в ямките на полистиролови панели, е широко разпространен.

RIA се използва за откриване на антигени на микроби, вируси, различни хормони, ензими, лекарства, имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в малки концентрации от 10-12-10-15 g / l.

Контролни въпроси

Реакция на имунна бактериолиза: какъв вид е реакцията; какво е антиген, какво е антитяло, механизъм на реакцията, методи на производство, практическо приложение. Реакция на имунна хемолиза: необходими съставки, процедура; управление, практическо приложение. Реакция на локална хемолиза в гел (реакция на Jerne): принцип на реакцията, начин на формулиране, практическо приложение. Реакция на свързване на комплемента: принцип на реакцията; какво се образува, когато имунният серум взаимодейства със специфичен антиген; какво се случва с комплемента, ако той присъства по време на това взаимодействие? Каква е съдбата на комплемента, ако няма специфичен афинитет между антигена и антителата? Каква реакция може да се използва, за да се определи какво се е случило с комплемента; защо се използва тази конкретна реакция; Какъв е видимият положителен резултат от RSC? Защо? Какво свойство на комплемента се използва в първата фаза на RSC? Във втората фаза? Ако крайният резултат от RSC е хемолиза, това означава ли положителен или отрицателен резултат? Обяснете резултатите: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Назовете съставките на първата система RSK и съставките на втората система RSK. Защо тест серумът трябва да бъде инактивиран? Как се титрува комплементът? Хемолитичен серум: какво съдържа, как се получава, какъв е титърът и как се определя? Какви животни се използват за получаване на RSC компоненти? Методология за настройка на RSC на студено. При стадиране коя от следните реакции изисква участието на комплемента: преципитация, флокулация, аглутинация, откриване на непълни антитела, имунна бактериолиза, имунна хемолиза, Jerne, RSC? Имунофлуоресцентна реакция (RIF) - посочва последователността на събитията в директната реакция на Кунс; необходими съставки. Какво е антиген, какво е антитяло, с какво се маркират антителата, как се отчита резултатът от реакцията, как изглежда положителният резултат? Практическо приложение - какво може да се определи с помощта на тази реакция? Реакция на индиректна имунофлуоресценция - посочете последователността на събитията по време на тази реакция, необходимите съставки, какъв е антигенът, какви имунни серуми се използват; практическа употреба; предимство на индиректния RIF в сравнение с директната реакция. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) – принцип на реакцията; необходими съставки; посочва последователността от събития при извършване на реакция за откриване на антиген в материала, който се тества; необходими съставки; Какво се случва, когато резултатът е положителен, как изглежда? Посочете последователността от действия при извършване на ELISA за откриване на антитела в тестовия серум; необходими съставки; какво се случва, ако резултатът е положителен? Имуноблотинг – принцип на реакцията; основни етапи; необходими съставки; как се отчита резултатът; ползи от реакцията. Радиоимуноанализ (РИА) - какви са основните етапи на реакцията; С какво се маркират антитела или антигени, как се отчита резултатът? Имуноелектронна микроскопия - принцип на метода; основни етапи; необходими съставки; с какво са белязани антителата? как се отчита резултатът от реакцията. Реакции на имобилизация – принцип на метода, техника на поставяне, компоненти, протоколиране на резултатите.

Задачи за изпълнение по време на процеса на самоподготовка.

Попълнете таблицата „Имунни реакции“ във връзка с реакциите, обсъждани в тази тема.

Имунни реакции

Работа на студентите по време на практическо занятие

Започнете работата веднага с настройка на фаза 1 на RSK, но го запишете в бележника си по-късно (вижте по-долу).

1. Реакция на имунна хемолиза. Вижте демонстрационна реакция на имунна хемолиза, скицирайте я под формата на диаграма, обяснете резултата в експерименталните и контролните епруветки.

2. Реакция на фиксиране на комплемента

а) анализирайте RSK според таблицата;

б) начертайте в тетрадка схема на настройката на RSC под формата на таблица;

в) поставете втората фаза на RSK (първата фаза се поставя в началото на урока);

г) анализира диагностичните препарати, необходими за RSC;

г) вземете предвид резултата. Формулирайте заключение за наличието на специфични антитела в тестовия серум.

3. Реакция на имунофлуоресценция. Разгледайте таблицата, направете схема на реакцията в тетрадката си; погледнете диагностичните серуми; определя какво съдържа серумът, как се приготвя, за каква реакция (директна или индиректна RIF) се използва. Вижте демонстрационния резултат от RIF във флуоресцентен микроскоп.

4. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). В тетрадката си съставете схема за настройка на реакция в две версии: за откриване на антиген в изследвания материал и за откриване на антитела в серума. Прегледайте комплекта съставки за ХИВ и хепатит B. Определете какво съдържа всяка съставка и за какво се използва.

5. Имуноблотинг. Направете схема на реакцията в тетрадката си; гледайте демонстрацията - резултатът от реакцията.

6. Радиоимуноанализ (RIA). Направете схема на реакцията в тетрадката си.

7. Имунна електронна микроскопия (IEM). Вижте демонстрацията - резултата от реакцията, начертайте схема на реакцията в тетрадката си, посочете със стрелки антигена (вируса) и белязаните антитела.

Имуноблотингът е високочувствителен метод за откриване на протеини, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

В общ смисъл имуноблотингът се отнася до анализ на смес от протеини, прехвърлени върху твърда мембранна опора, към която те са свързани чрез ковалентни връзки, последвано от имунооткриване.

Можете да анализирате смес от протеини, директно нанесени върху субстрата - dot blot анализ - или след предварителното й фракциониране чрез електрофокусиране, дискова електрофореза или двуизмерна електрофореза - Western blot анализ.

Патогенните антигени се разделят с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел, след което се прехвърлят от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и се проявяват с помощта на ELISA.

Компаниите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. . След това, след инкубация, пациентът се промива от несвързани антитела и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензим . Комплексът, образуван върху лентата (антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig) се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензим.

Тази методология се използва и за избор на клонове на бактерии, фаги или вируси, които експресират целевите клонирани генни продукти.

Прехвърлянето на протеини към мембраната се извършва или пасивно, или с помощта на електротрансферно оборудване. Ефективността на преноса на протеини към мембраната се влияе от много фактори, като например молекулното тегло на протеините, порьозността на гела, времето за пренос и състава на използвания буферен разтвор (транс-буфер).

В зависимост от целите и условията на експеримента се избират условия на трансфер, които дават най-добри резултати. Като субстрати обикновено се използват нитроцелулоза, поливинилиден дифлуорид (PVDF) или положително заредени найлонови мембрани. Нитроцелулозата може да свърже до 80 - 100 μg протеин на 1 cm2.

Протеините с ниско молекулно тегло (с молекулно тегло по-малко от 20 kDa) могат да бъдат загубени в резултат на измивания. Това дава възможност за предварително изследване на полиморфизма на определени генетични локуси въз основа на дължините на съответните ДНК рестрикционни фрагменти.

Освен това, използвайки Southern хибридизация, можете лесно да разберете дали целевият ген има място на хидролиза от определен рестрикционен ензим във вътрешната си част, което ви позволява да изберете оптималната стратегия за клониране на изследвания регион на генома.

Използвайки подобна схема, молекулите на РНК могат да бъдат прехвърлени от агарозен гел към нитроцелулозен филтър. Този метод беше наречен Northern blotting, за разлика от Southern blotting, тъй като името Southern означава „южен“ на английски.

Прехвърлянето на протеини върху филтри от гела съответно се нарича Western blotting. Големите протеини (>100 kDa), денатурирани в разтвор на натриев додецилсулфат (SDS), могат да бъдат лошо прехвърлени към мембраната, ако етанолът присъства в транс буфера. Алкохолът значително подобрява преноса на протеини от SDS-полиакриламидния гел, но стеснява порите в гела, което води до задържане на големи протеини.

PVDF мембраната е оптимизирана за имунооткриване и е способна да задържа до 160 μg/cm2 специфично свързани протеини с много ниски нива на неспецифично свързване.

Имуноблотинг

Важно свойство на тази мембрана е възможността за многократна употреба. Найлоновите мембрани Zeta-Probe ефективно свързват SDS протеини в отсъствието на алкохол и това свързване е устойчиво на последващо третиране. Протеините с ниско молекулно тегло също се задържат ефективно. С висок капацитет на свързване от приблизително 480 μg протеин на cm2, мембраните Zeta-Probe позволяват откриването на следи от протеин в тестовите смеси.

След като антигенът е имобилизиран върху мембраната, останалите места на свързване се блокират с разтвори на желатин, говежди серумен албумин или обезмаслено мляко.

След това мембраната се инкубира в разтвор на поликлонални или моноклонални антитела към изследвания антиген. След измиване на несвързаните антитела, мембраната се инкубира в разтвор на вторични антитела, които са конюгат на ензимите алкална фосфатаза (АР) или пероксидаза от хрян (HRP) с антивидови антитела (кози антитела срещу заешки, миши или човешки имуноглобулини ) или протеини A (протеин на Staphylococcus aureus) или G (протеин на Streptococcus sp.), имащи висок афинитет към Fc областта на имуноглобулините.

Откриването на образуваните имунни комплекси се извършва химически или хемилуминесцентно. Субстрати за химическата реакция при използване на конюгати на алкална фосфатаза са 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP) или син тетразол (NBT), а при използване на конюгати на пероксидаза от хрян - 4-хлоро-1-нафтол и водороден пероксид .

В резултат на ензимни реакции върху мембраната се образува цветна лента или петно ​​на мястото на локализиране на комплекса антиген-антитяло.

Чувствителността на този метод е 100 pg протеин при използване на AP конюгати и 100-500 pg при използване на HRP конюгати. Хемилуминесцентното откриване на имунни комплекси позволява откриването на по-малко от 5 pg антиген. Принципът на този метод е, че когато HRP реагира с водороден пероксид и цикличен диацилхидразин луминол, се излъчва светлина с дължина на вълната 428 nm, която може да бъде записана върху фоточувствителен филм.

Реакцията на имуноблотинг (IB) е разработена на базата на ELISA. Това е най-специфичният и чувствителен метод за имунохимичен анализ. Имуноблотингът (от англ. blot - петно, петно) съчетава ELISA с електрофореза. Използва се за откриване не на сложни антитела срещу HIV, а на антитела към отделните му структурни протеини (протеини p24, гликопротеини gp120, gp 41 и др.). Отнася се за експертни (потвърждаващи) реакции за диагностициране на HIV инфекция.

Реакцията протича на няколко етапа:

Вирусът се разрушава на компоненти - антигени (p24, gp120, gp 41 и др.), Които се подлагат на електрофореза в полиакриламиден гел, т.е. разделяне на антигени на фракции по молекулно тегло.

2. Гелът е покрит с нитроцелулозна мембрана и антигенните фракции се прехвърлят към него чрез електрофореза. Нитроцелулозата се държи като попивателна хартия. Мембраната се нарязва на ленти. Компаниите произвеждат такива ленти с "петна" от антигени.

Имуноблотинг - допълнителен индиректен метод

Ленти, покрити с HIV антигени, се потапят в серума на субекта и след това се измиват, за да се отстрани несвързаният материал.

4. Лентите се инкубират с антиглобулинов серум, маркиран с пероксидаза и се промиват.

Добавя се субстратът и се отбелязва броят на цветните фракции (петна), които съответстват на зоната на локализация на комплекса AG-AT.

Наличието на ленти в определени области на лентата потвърждава наличието в тествания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени. Резултатът от имуноблотинга се счита за положителен, ако върху мембраната се виждат ивици, съответстващи на всеки два от трите HIV антигена - p24, gp41 и gp 120 (фиг. 37).

ЧЕРТЕЖИ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

Основна литература

Медицинска микробиология, вирусология и имунология: учебник за студенти по медицина. университети 2-ро изд., рев. и допълнителни — 702 стр. Ед. А.А. Воробьов. М.: MIA, 2012.

2. Микробиология, вирусология и имунология: ръководство за лабораторни упражнения: учебник/(В. Б. Сбойчаков и др.); редактиран от В. Б. Сбойчакова, М. М. Карапац. – М.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 с.: ил.

3. Медицинска микробиология, имунология и вирусология [Електронен ресурс]: учебник за мед.

университети - 760 стр. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. Санкт Петербург: Спецслит, 2010.

4. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 тома / Т. 1. - 448 с. — Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М.: Geotar Media, 2010.

5. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 тома Т. 2. - 480 с. Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М.: Geotar Media, 2010.

допълнителна литература

1. Имунодиагностични реакции: учебник / комп.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Хуснаризанова, Ю. З. Габидулин, М. М. Алсинбаев - Издателство на Държавната бюджетна образователна институция за висше професионално образование на Министерството на здравеопазването на Русия, 2016 г. - 86 с.

2. Характеристики на някои свойства, които определят патогенния потенциал на съвместно култивирани вариации на бактерии Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научна публикация / Ю. З. Габидулин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин - Уфа, 2015 г. - 250 с.

Начало » Имуноблот – какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Имуноблот - какво е това? Имуноблот в диагностиката на инфекциозни заболявания

Какво е имуноблот? Това е често срещан метод за лабораторна диагностика на човешки вирусни инфекции. Това е един от най-точните и надеждни начини за откриване на наличието на ХИВ.

За надеждност той е дори по-голям от ензимно-свързания имуносорбентен анализ (elisa). Резултатите от имуноблот се считат за окончателна и убедителна обща информация

Имуноблот - какво е това? За да разпознаете дадено лице като ХИВ, трябва да се подложите на лабораторен тест за изследване на кръвния серум за наличие на антитела.

Секциите Western blot се наричат ​​още Western blots. Използва се за откриване на човешки вирусни инфекции като допълнителен експертен метод. Това е необходимо за потвърждаване на ELISA - лабораторен тест, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV в кръвта. Повторна проверка на имуноблот положителен ELISA.

Счита се за най-чувствителния, сложен и скъп.

Мишена

Какво е имуноблот? Този метод за лабораторно изследване на кръвен серум за наличие на антитела срещу вируса.

По време на специални изследвания общите вирусни протеини са открити в гела и върху нитроцелулозни мембрани.

Имуноблотинг (откриване на антитела в серуми на пациенти срещу определени патогенни антигени)

Процедурата Western blot секция е предназначена за определяне на HIV инфекцията на различни етапи. На първия етап пречистеният вирус от съставните му части се подлага на електрофореза и включените в него антигени се разделят по молекулно тегло.

Вирусът на човешката имунна недостатъчност се възпроизвежда в живи клетки, заложени в неговата генетична информация. На този етап човек става носител на ХИВ вируса, ако сте били заразени.

Спецификата на това заболяване е, че не се проявява дълго време. Вирусът разрушава лимфоцитите, поради което имунитетът на човека намалява и тялото става неспособно да се бори с инфекциите.

Ако ХИВ се лекува правилно и своевременно, пациентът ще доживее до дълбока старост. Липсата на лечение неизбежно води до смърт. От момента на заразяване, но без лечение, максималният срок е не повече от десет години.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първия и втория тип.

Ако човек е заразен, след две седмици антителата могат да бъдат открити много по-късно. Особеност на ХИВ е, че количеството антитела нараства бързо и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, заболяването може да не се прояви две или повече години. Методът ELISA не винаги точно показва наличието на заболяването, изисквайки потвърждение на резултатите от PCR и Western blot срезове, ако ензимният имуноанализ показа положителен резултат.

Показания за

Какъв вид „имуноблотинг“ вече е открит, но кой се въвежда в изследването?

Причината за изследване за вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) ще бъде положителен резултат от ELISA. Необходимо е да се премине през ензимно-свързан имуносорбентен анализ при пациенти, на които предстои операция. Освен това трябва да направите анализ на жените, които планират бременност, както и тези, които са безразборни. Western blot срезове се предписват на пациенти с HIV инфекция, ако резултатите от Elisa са двусмислени.

Следните тревожни симптоми могат да бъдат: бърза загуба на тегло, загуба на чревна функция, която продължава три седмици, увеличаване на лимфните възли в тялото , пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Не е необходимо пациентът да се подготвя преди даряването на венозна кръв.

Не яжте 8-10 часа преди теста. В деня преди кръводаряването не се препоръчва да пиете алкохол и кафе, да правите тежки физически упражнения или да изпитвате тревожност.

Къде да направите анализа?

Къде мога да се изследвам за ХИВ?

ELISA, имуноблот анализ, извършен в градски частни клиники, дава резултати в рамките на един ден. Възможна е и спешна диагностика. В обществените институции медицинските тестове Elisa и Western blot секциите са безплатни в съответствие със законодателството на Руската федерация.

Задължителен скрининг за инфекциозни заболявания при бременни жени и пациенти, които се нуждаят от хоспитализация или операция. Как се провежда това изследване?

Как се извършва ELISA? Имуноблот положителен/отрицателен потвърждава или опровергава резултатите от Елайза. Процедурата е доста проста. Специалистът взема венозна кръв, което отнема по-малко от пет минути.

След вземане на пробата мястото на инжектиране трябва да се дезинфекцира и да се покрие с превръзка. Вземането на проби се извършва на празен стомах, така че след процедурата няма да навреди да ядете блок черен шоколад или сладка топла напитка.

За да получите направление за безплатен тест в обществена медицинска институция, трябва да посетите терапевт.

Като цяло, имуноблотът не се различава от другите кръвни тестове чрез събиране. Методологията на изследването е проста. Ако вирусът присъства в кръвта на човек, тялото започва да произвежда антитела, за да го унищожи. За всеки вирус има много протеинови антигени. Откриването на тези антитела е в основата на метода на Western blot раздела. Цена

Колко време е анализът? ХИВ имуноблотът е един от най-евтините тестове.

Средно методите за имуноанализ варират от 500 до 900 рубли. Секциите Western blot са изследване на тестове, чиято цена варира от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR) ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Тълкуване на резултатите

Най-често срещаните методи за диагностициране на HIV инфекцията са ензимно-свързан имуносорбентен анализ и имуноблот.

Те се използват за определяне на антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус в серума. Инфекцията обикновено се потвърждава с два теста: скрининг и потвърждаващ. Резултатите трябва да бъдат интерпретирани от лекар, който поставя диагнозата и назначава лечение. Ако имуноблотът е положителен, това означава, че в човешкото тяло има вирус.

Положителният резултат не трябва да бъде причина за независимо лечение, тъй като всеки пациент може да има своя собствена картина на заболяването.

Качественият анализ включва скрининг и сертифициране. Ако вирусът не бъде открит при пациента, резултатът е „отрицателен“. Когато този сертификат бъде открит, се извършват допълнителни скринингови изследвания. Имуноблот анализ, който потвърждава или опровергава скрининга. Ако тест лентите се появят в определени тъмни области (локализация на протеини), се поставя диагноза ХИВ.

Ако резултатите са съмнителни, тогава тестовете се извършват в рамките на три месеца.

За да предотвратите инфекция с вируса на човешката имунна недостатъчност, е възможно, ако спазвате определени правила: избягвайте случаен сексуален контакт, използвайте презервативи по време на контакт, не използвайте наркотици.

Ако заболяването се открие при бременна жена, важно е да следвате препоръките на лекуващия лекар и не забравяйте да тествате за наличие на вируса.

Какво е Western blotting?

Идентифицирането на протеини в сложни смеси или екстракти от различни тъкани е един от често срещаните проблеми. С помощта на инструмент като специфични антитела е възможно да се определи изследваният протеин с минимални времеви и финансови разходи.

При Western blotting метода, на първия етап, смес от протеини се разделя чрез електрофореза в присъствието на натриев додецилсулфат (SDS), след което се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електроблотинг.

Същността на този метод е, че след електрофореза гелът се поставя върху нитроцелулозна мембрана между слоевете филтърна хартия. Сглобеният по този начин „сандвич“ се поставя в електрическо поле, така че комплексите протеин-SDS да се движат през плочата на гела и да се обездвижват (в резултат на неспецифична сорбция) върху повърхността на нитроцелулозната мембрана.

Свързването на комплекса протеин-SDS с нитроцелулозната мембрана включва предимно сили от електрическо естество, като това взаимодействие е многоточково и води до „разпръскване“ на протеините по повърхността на мембраната. Така след електротрансфер се получава реплика на гел върху нитроцелулоза с протеини, разположени по същия начин, както в полиакриламиден гел.

След SDS електрофореза, електротрансфер и сорбция на протеини от гела върху нитроцелулозна мембрана, третичната конформация на протеина е силно променена, ако като цяло е правилно да се говори за съществуването на третична структура за протеина след такова сурово третиране. Следователно, за имунохимично откриване на изследвания протеин обикновено се използват само моно- или поликлонални антитела, специфични за линейни области на протеиновата молекула.

51. Имуноензимен анализ, имуноблотинг. Механизъм, компоненти, приложение.

Антителата, специфични за конформационни епитопи (или региони, включващи контакти между субединици), обикновено не са подходящи за използване при Western blotting.

След трансфер на протеин, мембраната се инкубира последователно с антитела, специфични за изследвания протеин, и след това с вторични антитела, специфични за Fc фрагментите на първичните антитела, конюгирани с ензимен (или някакъв друг) етикет (фиг.

1 А). В случай, че първичните антитела, специфични за изследвания антиген, са директно конюгирани с етикета, не са необходими вторични антитела (фиг. 1 B). Имунните комплекси, образувани на мястото на локализиране на изследвания протеин, се „проявяват“ с помощта на хромогенен субстрат (в зависимост от вида на етикета).

Чувствителността и специфичността на метода зависи до голяма степен от това какви антитела се използват в изследването.

Използваните антитела трябва да са специфични за уникална аминокиселинна последователност, характерна само за изследвания протеин. В противен случай е възможно взаимодействие (особено в случая на сурови протеинови екстракти) на антитела с няколко протеинови молекули, което от своя страна ще доведе до появата на няколко цветни ивици върху мембраната.

Идентифицирането на изследвания протеин в този случай често е трудно или дори невъзможно.

Вторият важен фактор, който трябва да имате предвид при избора на антитела, е афинитетът. Колкото по-висок е афинитетът на използваните антитела, толкова по-ярки и ясни са оцветените протеинови ленти, толкова по-висока е чувствителността на метода. Когато се използват антитела с висок афинитет, може да се постигне чувствителност от 1 ng или дори по-висока.

За визуализиране на резултата от взаимодействието между мембранно свързан антиген и антитела се използват вторични антитела, конюгирани с агенти, способни да произведат определен сигнал при определени условия.

Обикновено като такъв агент се използва ензим (пероксидаза или фосфатаза), чийто реакционен продукт е оцветен и се утаява върху мембраната под формата на неразтворима утайка.

Също така е възможно да се използват флуоресцентни етикети в този метод.

Ориз. 1. Схема на имунохимично оцветяване на изследвания протеин: А - използване на вторични антитела, конюгирани с ензимен маркер; B - първичното антитяло е директно конюгирано към ензимен маркер.

Протокол:

I. Приготвяне на гел и мембрана и протеинов електротрансфер

След електрофореза, полиакриламидният гел се поставя във вана с попиващ ​​буфер (25 mM Tris, рН 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол).

Два листа филтърна хартия, изрязани по формата на попивателната касета и навлажнени с попивателен буфер, се поставят върху частта от касетата, която ще гледа към анода. След това върху филтърната хартия се поставя нитроцелулозна мембрана, предварително навлажнена със същия буфер, като се уверява, че между мембраната и хартията няма въздушни мехурчета.

След това гелът трябва внимателно да се постави върху мембраната, като отново се обръща особено внимание на това да се гарантира, че няма въздушни мехурчета между гела и мембраната. Оформянето на сандвича се завършва с два слоя навлажнена филтърна хартия, които се поставят върху повърхността на гела (фиг. 2). Полученият сандвич се захваща в касета и се поставя между електродите, така че мембраната да гледа към анода.

Ориз. 2. Схема на електротрансфер на протеини към мембраната.

II. Електрически трансфер

Електротрансферът на протеини към нитроцелулозна мембрана се извършва в буфер, съдържащ 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30-50 минути при постоянно напрежение от 100 V.

Времето на електротрансфер зависи от размера на протеините, които се прехвърлят; колкото по-голям е протеинът, толкова по-дълго отнема електротрансферът. Качеството на електротрансфера и местоположението на протеиновите ленти се оценяват чрез оцветяване на нитроцелулозната мембрана с 0,3% разтвор на Ponceau S в 1% оцетна киселина. Преди имунохимично оцветяване, мембраната трябва да се измие няколко пъти със слабо алкален воден разтвор на Tris, за да се отстрани багрилото, свързано с протеините.

III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

За да се блокират местата на неспецифично свързване на антитела, мембраната се инкубира при постоянно разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути в PBST (за по-добро блокиране може да се използва разтвор на PBST, съдържащ 10% обезмаслено мляко на прах).

След блокиране, мембраната се инкубира за един час при стайна температура при постоянно разбъркване в PBST, съдържащ 1-10 μg/ml специфични антитела.

Оптималната концентрация на антитела се избира емпирично и зависи от афинитета на взаимодействието на антителата с антигена.

В края на инкубацията, измийте мембраната 5 пъти с PBST и я прехвърлете в разтвор на вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. Разреждането на конюгата обикновено се посочва от производителя върху опаковката или се избира емпирично от изследователя. Инкубирайте мембраната в разтвора на вторичното антитяло за 1 час при постоянно разбъркване.

След цялостно промиване (смяна на буфера поне 5-6 пъти), PBST мембраната се прехвърля в хромогенен субстратен разтвор, съдържащ 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 μl 30% водороден пероксид в 10 ml 0,1 M Tris-HCl , рН 7,6.

Инкубацията се извършва при разбъркване в продължение на 5 - 10 минути. След приключване на инкубацията със субстрата, мембраната трябва да се измие с PBST, да се изсуши чрез попиване с филтърна хартия и незабавно да се направи електронно копие чрез сканиране в цвят. Ако мембраната изсъхне напълно, боядисаните протеинови ивици избледняват и изображението се оказва по-малко ярко и контрастно.

Забележка: DAB е токсичен и потенциален канцероген. Работете само с гумени ръкавици!

Описание

Метод на определянеИмуноблот.

Проучван материалКръвен серум

Възможност за домашно посещение

Антинуклеарните антитела са семейство автоантитела, които се свързват с рибонуклеиновите киселини и свързаните с тях протеини. Срещат се при повече от 90% от пациентите с дифузни заболявания на съединителната тъкан, а също така често се наблюдават при автоимунни чернодробни заболявания и редица други състояния. Към днешна дата са характеризирани около 200 разновидности на това семейство автоантитела, но не всички от тях могат да се използват в клиничната практика.

Имуноблот на антинуклеарни антитела позволява едновременно изследване на 15 основни типа антинуклеарни антитела в един тест, което осигурява диференциална диагноза на основните системни ревматични заболявания. Всеки тип автоантитела, открити с помощта на имуноблот, обикновено се наблюдават при пациенти с характерна клинична картина, така че спектърът на автоантителата позволява не само да се диагностицира заболяването, но и да се определи рискът от развитие на определени клинични прояви.

Препоръчително е да се използва имуноблот на антинуклеарни антитела на втория етап от серологичното изследване, ако резултатът от други тестове е положителен, което показва наличието на антинуклеарни антитела в серума на пациента. Такива тестове включват определяне на антинуклеарни антитела (ELISA скрининг), откриване на антинуклеарен фактор (ANF) върху Hep2 клетки (), антинуклеарни антитела и антитела към екстрахируем ядрен антиген (ENA).

Методът на имуноблотинг на антинуклеарни антитела в диагностиката на системни ревматични заболявания се характеризира с висока клинична специфичност. Но специфичността на антинуклеарните антитела, дори при високи титри на ANF (), не винаги може да бъде установена, тъй като редица антигени на антинуклеарни антитела все още остават нехарактеризирани. Отрицателният резултат от имуноблот в този случай не изключва диагнозата системни ревматични заболявания. Редица антинуклеарни антитела могат да бъдат открити с помощта на имуноблот - панел от специфични за миозит автоантитела () и имуноблот - панел от автоантитела за склеродермия ().

Литература

1. Лапин С.В. Тотолян А.А. Имунологична лабораторна диагностика на автоимунни заболявания / Издателство "Човек", Санкт Петербург - 2010 г. 272 ​​с.
2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Съвременни стандарти за лабораторна диагностика на ревматични заболявания. Клинични препоръки / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Автоантитела при органоспецифични автоимунни заболявания: Диагностичен справочник/ PABST, Дрезден – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Автоантитела при системни автоимунни заболявания: Диагностичен справочник/ PABST, Дрезден – 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Автоантитела 2-ро изд./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Диагностични критерии при автоимунни заболявания / Humana Press – 2008. 598 p.
7. Инструкции за комплекта реактиви.

Подготовка

За предпочитане е да изчакате 4 часа след последното хранене, няма задължителни изисквания.

Показания за употреба

Изследването е показано за диагностика и диференциална диагноза на следните състояния:

• системен лупус еритематозус;
• подостър кожен лупус и други видове кожен лупус;
• смесено заболяване на съединителната тъкан;
• Синдром на Sjögren и свързани заболявания;
• дифузна и локализирана склеродермия, CREST синдром;
• възпалителни миопатии (полимиозит и дерматомиозит);
• ювенилен хроничен артрит;
• автоимунен хепатит;
• първична билиарна цироза и склерозиращ холангит;
• използването на този тест е показано, когато се открият високи титри на антинуклеарен фактор, антинуклеарни антитела, антитела срещу екстрахируем ядрен антиген, антитела срещу ДНК, антитела срещу нуклеозоми и антифосфолипидни антитела.

Тълкуване на резултатите

Тълкуването на резултатите от изследването съдържа информация за лекуващия лекар и не е диагноза. Информацията в този раздел не може да се използва за самодиагностика и самолечение. Лекарят поставя точна диагноза, като използва както резултатите от това изследване, така и необходимата информация от други източници: медицинска история, резултати от други изследвания и др.

Мерни единици: качествен тест, резултатът се представя под формата на „открит“ или „не е открит“.

Когато се открие лента, характеризираща наличието на какъвто и да е тип антитяло, интензитетът на цвета на лентата се описва допълнително чрез броя плюсове („кръстове“) за всеки от идентифицираните типове антитела. Увеличаването на степента на положителност индиректно отразява съдържанието и афинитета на автоантителата.

Референтни стойности: антитела срещу Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, Histone, Nucleosome , Rib P, AMA-M2, Jo-1 не бяха открити.

Резултатът от определянето на автоантитела се представя в "кръстове" за всеки съответен антиген. Увеличаването на степента на серопозитивност индиректно отразява съдържанието и афинитета на автоантитела. Опциите за резултата от оценката на серопозитивността са дадени по-долу:

1. Не са открити антитела.
2. +/- - граничен резултат;
3. + – ниско съдържание на автоантитела към специфичен антиген;
4. ++ – средно съдържание на автоантитела към специфичен антиген;
5. +++ – високо съдържание на автоантитела към специфичен антиген.

Основните заболявания, свързани с откриването на антинуклеарни антитела:

Според препоръките на СЗО имуноблотингът (Western blot) се използва при диагностицирането на HIV инфекцията като допълнителен експертен метод, който трябва да потвърди резултатите от ELISA. Обикновено този метод проверява двойно положителен резултат от ELISA, тъй като се счита за по-чувствителен и специфичен, въпреки че е по-сложен и скъп.

Имуноблотингът комбинира ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им върху нитроцелулозна мембрана. Процедурата за имуноблот се състои от няколко етапа (фиг. 27). Първо, HIV, предварително пречистен и унищожен на съставните си компоненти, се подлага на електрофореза и всички антигени, включени във вируса, се разделят по молекулно тегло. След това, използвайки метода на блотиране, антигените се прехвърлят от гела върху лента от нитроцелулозен или найлонов филтър, който вече съдържа спектър от протеини, характерни за HIV, невидими за окото. След това тестовият материал (серум, кръвна плазма на пациента и др.) се нанася върху лентата и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват с антигенните протеинови ленти, които стриктно съответстват на тях. В резултат на последващи манипулации (подобно на ELISA), резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. Наличието на ленти в определени области на лентата потвърждава наличието в тествания серум на антитела срещу строго определени HIV антигени.

Имуноблотингът най-често се използва за потвърждаване на диагнозата HIV инфекция. СЗО счита за положителни серуми, в които чрез имуноблотинг се откриват антитела срещу всеки два протеина от обвивката на ХИВ. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (