Реакция на утаяване в гел, RPG (тест за утаяване на гел). Серологични реакции Компоненти на реакцията

/ 34
Най-лошото Най-доброто

Реакциите на утаяване се основават на образуването и утаяването на комплекси антиген-антитяло. В реакцията участват разтворими антигени: преципитогени (продукти от микроорганизми, тъкани, химикали и лекарства). Антителата (преципитини), комбинирайки се с разтворими антигени, причиняват тяхната агрегация, която се проявява в помътняване на бистри течности или образуване на утайка (утайка). Диагностичните преципитиращи серуми се произвеждат с висок титър на антитела. Получават се чрез имунизиране на лабораторни животни със съответния антиген. Титърът на преципитиращ серум е минималното количество антиген, което даден серум може да утаи.

Реакцията на утаяване може да се проведе в течна и твърда среда (агар или гел).

Реакция на утаяване в течна среда (пръстеново утаяване).Реакцията се провежда в тесни епруветки, в които се добавя утаяващ антисерум и внимателно се наслоява прозрачен антигенен разтвор отгоре. Ако реакцията е положителна, след няколко минути на границата на двете течности ще се появи утаителен пръстен. С малки количества реактиви реакцията може да се проведе в капиляри (микропреципитация).

Реакция на утаяване в агар.Същността на реакцията е, че антигени и антитела, поставени в различни ямки в агар, дифундират един към друг и при взаимодействие образуват комплекс, който се утаява под формата на преципитационна линия.

Двойна радиална имунодифузия на Ouchterlony.Реакцията се провежда върху агар гел плочи. Разтворите на антиген и антисерум се поставят в ямки, изрязани на известно разстояние една от друга. Имунореагентите дифундират в гела и при среща образуват комплекси, които се утаяват под формата на преципитационни линии. Този метод ви позволява да изследвате няколко проби от имунореагенти наведнъж. Например, няколко ямки с разтвори на различни антигени могат да бъдат поставени около ямка с антисерум или обратното.

Метод за определяне на токсигенността на микробите в реакцията на утаяване. Принципът на имунодифузия в гел е в основата на метода, който се използва за изследване на токсигенността (способността да произвеждат токсин) на бактериите. Например, за откриване на дифтериен токсин, лента от филтърна хартия, напоена с антитоксичен серум, се поставя в средата на петриево блюдо с агар. Бактериалните култури, които ще се изследват, се инокулират наблизо. Ако те отделят токсин, тогава, когато взаимодействат с антитоксини, се образуват линии на утаяване между колониите и лентата хартия.

Гел имунодифузията е в основата на реакцията на утаяване на Манчини, която се използва за определяне на класовете имуноглобулини в кръвния серум (виж имуноглобулини).

Реакциите на утаяване се използват за; определяне на антигени на бактерии, човешки и животински тъкани; диагностика на някои инфекциозни заболявания; определяне на протеинови видове в съдебната медицина; идентифициране на примеси в месо, риба и продукти от брашно в санитарната практика.

При реакцията на утаяване се утаява специфичен имунен комплекс, състоящ се от разтворим антиген (лизат, екстракт, хаптен) и специфично антитяло в присъствието на електролити.

Мътният пръстен или утайката, образувана в резултат на тази реакция, се нарича утайка. Тази реакция се различава главно от реакцията на аглутинация по размера на антигенните частици.

Реакцията на утаяване обикновено се използва за определяне на антиген при диагностицирането на редица инфекции (антракс, менингит и др.); в съдебната медицина - за определяне вида на кръвта, спермата и др.; при санитарно-хигиенни изследвания - при установяване на фалшифициране на продукти; с негова помощ се определя филогенетичната връзка на животните и растенията. За реакцията ви трябва:

1. Антитела (преципитини) - имунен серум с висок титър на антитела (не по-нисък от 1:100 000). Титърът на преципитиращия серум се определя от най-високото разреждане на антигена, с който той реагира. Серумът обикновено се използва неразреден или в разреждане 1:5 - 1:10.

2. Антиген - разтворени вещества от протеинова или липоидна полизахаридна природа (пълни антигени и хаптени).

3. Изотоничен разтвор.

Основните методи за провеждане на реакцията на утаяване са: реакция на пръстеновидно утаяване и реакция на утаяване в агар (гел).

внимание! Всички компоненти, участващи в реакцията на утаяване, трябва да бъдат напълно прозрачни.

Реакция на пръстеновидно утаяване. С помощта на пипета на Пастьор добавете 0,2-0,3 ml (5-6 капки) серум в епруветката за утаяване (серумът не трябва да попада върху стените на епруветката). Антигенът в същия обем се наслоява внимателно върху серума, като се излива с тънка пастьорска пипета по стената на епруветката. Епруветката се държи в наклонено положение. При правилно наслояване трябва да има ясна граница между серума и антигена. Внимателно, за да не смесите течността, поставете епруветката в стойка. Ако реакцията е положителна, на границата на антигена и антитялото се образува мътен "пръстен" - утайка (виж фиг. 48).

Реакцията е придружена от редица контроли (Таблица 18). Последователността на добавяне на реакционните съставки в епруветката е много важна. Не можете да наслоите серум върху антигена (в контролата - върху изотоничен разтвор), тъй като относителната плътност на серума е по-голяма, той ще потъне на дъното на епруветката и границата между течностите няма да се разкрие.

Таблица 18. Схема за настройка на реакцията на пръстеновидно утаяване

Забележка. + наличие на "пръстен"; - липса на "пръстен".

Резултатите се записват след 5-30 минути, в някои случаи след час, като винаги се започва с контролите. „Пръстенът“ във втората епруветка показва способността на имунния серум да влезе в специфична реакция със съответния антиген. В 3-5 епруветки не трябва да има „пръстени“ - няма антитела и антигени, съответстващи един на друг. „Пръстен“ в 1-ва епруветка - положителен резултат от реакцията - показва, че тестваният антиген съответства на взетия имунен серум, липсата на „пръстен“ („пръстен“ само във 2-ра епруветка) показва тяхното несъответствие - отрицателен резултат от реакцията.

Реакция на утаяване в агар (гел). Особеността на реакцията е, че взаимодействието на антиген и антитяло се извършва в плътна среда, т.е. в гел. Получената утайка дава мътна ивица в дебелината на средата. Липсата на лента показва несъответствие между компонентите на реакцията. Тази реакция се използва широко в биомедицинските изследвания, по-специално при изследването на образуването на токсини в причинителя на дифтерия.

Контролни въпроси

1. Каква е основната разлика между реакциите на аглутинация и реакциите на утаяване?

2. Защо мътните съставки не могат да се използват в реакцията на утаяване?

Упражнение

1. Настройте реакцията на пръстеновидно утаяване и скицирайте резултата.

2. Проучете естеството на взаимодействието на антигена с антитялото в реакцията на утаяване в агар, скицирайте резултата (вземете чаша от вашия учител).

Реакция на лизис (имунна цитолиза)

Имунният лизис е разпадането на клетките под въздействието на антитела със задължителното участие на комплемента. За реакцията ви трябва:

1. Антиген - микроби, червени кръвни клетки или други клетки.

2. Антитяло (лизин) - имунен серум, по-рядко пациентски серум. Бактериолитичният серум съдържа антитела, участващи в лизиране на бактерии; хемолитични - хемолизини, които насърчават разграждането на червените кръвни клетки; за лизис на спирохети са необходими спирохетолизини, клетки - итолизини и др.

3. Допълване. Серумът на морските свинчета съдържа най-много комплемент. Този серум (смес от няколко животни) обикновено се използва като допълнение. Пресният (местен) комплемент е нестабилен и лесно се разрушава при нагряване, разклащане или съхранение, така че може да се използва не повече от два дни след получаване. За запазване на комплемента към него се добавят 2% борна киселина и 3% натриев сулфат. Тази добавка може да се съхранява при 4°C до две седмици. Най-често се използва суха добавка. Преди употреба се разтваря в изотоничен разтвор до първоначалния обем (посочен на етикета).

4. Изотоничен разтвор.

Реакция на хемолиза(Таблица 19). За реакцията ви трябва:

1. Антиген - 3% суспензия от промити овчи еритроцити в размер на 0,3 ml еритроцитна утайка и 9,7 ml изотоничен разтвор.

2. Антитяло - хемолитичен серум (хемолизин) срещу овчи еритроцити; обикновено се приготвя в производството, лиофилизиран и титърът е посочен на етикета.

Хемолизиновият титър е най-високото разреждане на серума, при което настъпва пълна хемолиза на 3% суспензия от червени кръвни клетки в присъствието на комплемент. За реакцията на хемолиза хемолизинът се взема в троен титър, т.е. разреден 3 пъти по-малко, отколкото преди титъра. Например, при серумен титър 1:1200, серумът се разрежда 1:400 (0,1 ml серум * и 39,9 ml изотоничен разтвор). Излишъкът от хемолизин е необходим, тъй като част от него може да бъде адсорбирана от други компоненти на реакцията.

* (Не трябва да приемате по-малко от 0,1 ml серум - точността на измерването ще пострада.)

3. Комплементът се разрежда 1:10 (0,2 ml комплемент и 1,8 ml изотоничен разтвор).

4. Изотоничен разтвор.

Таблица 19. Схема на реакция на хемолиза

Отчитане на резултатите. Ако реакцията се проведе правилно, в първата епруветка ще настъпи хемолиза - съдържанието й ще стане прозрачно. В контролите течността остава мътна: във 2-ра епруветка няма достатъчно комплемент за настъпване на хемолиза, в 3-та епруветка няма хемолизин, в 4-та епруветка няма нито хемолизин, нито комплемент, в 5-та епруветка антигенът прави не съответства на антитялото,

Ако е необходимо, хемолитичният серум се титрира съгласно следната схема (Таблица 20).

Преди титруване пригответе първоначално серумно разреждане 1:100 (0,1 ml серум и 9,9 ml изотоничен разтвор), от което се правят необходимите разреждания, например:

От тези разреждания добавете 0,5 ml серум в епруветки за титруване, както е показано в таблица. 20.

Таблица 20. Схема на титруване на хемолитичен серум (хемолизин)

В примера, даден в табл. 20, титърът на хемолитичния серум е 1:1200.

Когато се използва пресен хемолитичен серум, той трябва да бъде инактивиран, за да се унищожи присъстващият в него комплемент. За да направите това, той се нагрява в продължение на 30 минути при 56 ° C на водна баня или в инактиватор с термостат. Последният метод е по-добър: той елиминира възможността за прегряване на суроватката, т.е. нейната денатурация. Денатурираните серуми са неподходящи за тестване.

Реакция на бактериолиза. При тази реакция комплементът лизира бактериите в присъствието на подходящ (хомоложен) серум. Схемата на реакцията е фундаментално подобна на схемата на реакцията на хемолиза. Разликата е, че след двучасова инкубация всички епруветки се посяват върху петриеви панички със среда, благоприятна за микроорганизма, включен в експеримента, за да се установи дали е лизиран. Ако експериментът е проведен правилно, културите от 2-5 епруветки (контроли) трябва да покажат обилен растеж. Липса на растеж или слаб растеж в инокулацията от 1-ва епруветка (експеримент) показва смъртта на микробите, т.е. че те са хомоложни на антитялото.

внимание! Реакцията на бактериолиза трябва да се проведе при асептични условия.

Контролни въпроси

1. Какво ще се случи с червените кръвни клетки, ако се използва дестилирана вода вместо изотоничен разтвор на натриев хлорид? Каква е основата на това явление?

2. Каква реакция ще настъпи, когато еритроцитите взаимодействат с хомоложен имунен серум при липса на комплемент?

Упражнение

Настройте реакцията на хемолиза. Запишете и скицирайте резултата.

Реакция на утаяване- RP (отлат. praecipito- преципитат) - това е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, т.нар. утайка.Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунен комплекс. За разлика от реакцията на аглутинация, антигенът за реакцията на утаяване е разтворими съединения, чийто размер на частиците се доближава до размера на молекулите. Това могат да бъдат протеини, комплекси от протеини с въглехидрати и липиди, бактериални екстракти, различни дисати или филтрати на бульонни култури от микроби. Антителата, участващи в реакцията на утаяване, се наричат ​​преципитини. Полученият фино диспергиран комплекс антиген-антитяло се открива с помощта на определени методи за стадиране на реакцията на утаяване.
Реакцията на утаяване на пръстена е предложена за първи път от Асколи. Използва се при диагностицирането на антракс, чума, туларемия и менингит. Методът е прост и достъпен.
Специфичен имунопреципитиращ серум се излива в тесни утаяващи епруветки и антигенът се наслоява много внимателно върху него. Например при диагностициране на антракс за антиген се вземат парчета кожа, вълна, кожа от мъртво животно и др. Те се варят, течността се филтрира и се използва като антиген. Появата на пръстен - преципитат - на границата на две течности показва наличието на съответния антиген.
Реакцията на утаяване с агар гел или методът на дифузионно утаяване позволява подробно изследване на състава на сложни водоразтворими антигенни смеси. За да настроите реакцията, използвайте гел (полутечен или по-плътен агар). Всеки компонент, който изгражда антигена, дифундира към съответното антитяло с различна скорост. Следователно, комплекси от различни антигени и съответните антитела са разположени в различни части на гела, където се образуват преципитационни линии. Всеки ред съответства само на един комплекс антиген-антитяло. Реакцията на утаяване обикновено се провежда при стайна температура.
Методът на имуноелектрофореза е широко разпространен през последните години в изследването на антигенната структура на микробите. Антигенният комплекс се поставя в ямка, която се намира в центъра на агар гел, излят върху плоча. След това през агарния гел преминава електрически ток, което кара различните антигени, включени в комплекса, да се движат през полето на електрически ток в зависимост от тяхната електрофоретична подвижност. След завършване на електрофорезата специфичен имунен серум се добавя към улей, разположен по протежение на ръба на плаката, и се поставя във влажна камера. На местата, където се образува комплексът антиген-антитяло, се появяват преципитационни линии.

Реакции на утаяване слагамв епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване),в гелове, хранителни среди и др. Широк получено разпределениевидове реакции на утаяване в полутечен агар или агарозен гел: двойна имунодифузия по Ouchterlony. радиална имунодифузия, имуноелектрофорезаи т.н

Реакция на радиална имунодифузия. Имунният серум с разтопен агар гел се налива равномерно върху чашата. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът в различни разреждания. Антигенът, дифундиращ в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антитела (фиг. 13.7). Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена. Реакцията се използва за определяне на съдържанието в кръвта на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.

Имуноелектрофореза- комбинация от електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза. След това в жлеба, успоредно на зоните на електрофореза, се въвежда имунен серум, чиито антитела, дифундирайки в гела, образуват линия на утаяване в точката на контакт с антигена.

Имунна електронна микроскопия- електронна микроскопия на микроби, най-често вируси, третирани с подходящи антитела. Вирусите, третирани с имунен серум, образуват имунни агрегати (микропреципитати). Около вирионите се образува "венче" от антитела, контрастиращи с фосфорволфрамова киселина или други електронно-оптически плътни препарати.

123. Реакция на утаяване в гел за определяне на токсигенността на микроорганизми, механизъм, методи на формулиране.

Реакция на утаяване (RP)- това е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, наречена утайка. Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунен комплекс.

През 1946 г. J. Oudin предлага простия дифузионен метод, при който един от компонентите на реакцията на утаяване, обикновено серум, е в гел, а другият - антигенът - е наслоен върху първия под формата на разтвор .

Антигенът, дифундиращ в гела, образува в него бели преципитационни линии с антитела, ясно видими при странично осветление. През 1948 г. J. Ouchterlonyu разработи още по-опростен и по-удобен метод на двумерна насрещна дифузия, който позволява директно сравнение на различни антигени и серуми. Този метод също е много ценен при изследване на кръстосани реакции.

За настройка на реакцията на Ouchterlon се използва 1% агар, приготвен във физиологичен разтвор, който се изсипва в петриеви панички със слой от 0,5 cm, след втвърдяване се изрязват дупки с диаметър 5-6 mm в агаровата плоча - една в центъра на съда, 4-5 - по обиколката на разстояние 1-2 см от централната. Диагностичният преципитиращ серум се излива в централната ямка, а разтвор на хомоложни и сравними антигени се излива в периферните ямки. Резултатите се записват след 24, 48 и 72 часа инкубиране при стайна температура.

Антителата и антигените дифундират един към друг и в областите, където се създават техните еквивалентни концентрации, се образуват дъгообразни преципитационни ивици. Ако преципитационните ивици, идващи от две съседни ямки, се слеят, това показва наличието на няколко антигенни компонента в тестовата течност. Реакцията на контра-дифузия на Ouchterlohn често се използва за определяне на токсигенността на бактерии, като дифтерия.

По-нататъшно развитие на метода за утаяване с гел е имуноелектрофореза. Този термин се отнася до метод, който съчетава електрофоретично разделяне на смес от антигени и противодифузия на Ouchterlohn върху една и съща агар гел плоча. Утаеният серум се излива в жлеб, изрязан в гела, успореден на посоката на електрофоретичното разделяне.

Образуваните в резултат на реакцията линии на утаяване имат формата на дъги, издължени по посока на електрофоретичното движение на антигенните фракции. Имуноелектрофорезата позволява да се определи състава на сложни смеси от разтворими антигени, съдържащи до 30 компонента, и следователно е ценен диагностичен метод.

Реакция на утаяване(RP) се нарича утаяване от разтвор на Ag (преципитоген), когато е изложен на имунен серум (преципитин) и електролит.

С помощта на RP е възможно да се открие антиген в разреждания от 1:100 000 и дори 1:1 000 000, т.е. в толкова малки количества, които не се откриват химически.

Преципитогените са ултрамикроскопични частици с протеиново-PS природа: екстракти от микроорганизми, органи и тъкани, пат материал; продукти от разпада на бактериални клетки, техните лизати, филтрати. Преципитогените са устойчиви на топлина, така че за получаването им материалът се вари.

RP използва течно прозрачно Ag.

Утаяващите серуми обикновено се получават чрез хиперимунизиране на зайци в цикли в продължение на няколко месеца, като им се инжектират бактериални суспензии, филтрати от бульонни култури, автолизати, солни екстракти от микроорганизми и суроватъчни протеини.

Продукция на RP Ascoli.В тясна епруветка с малко количество неразреден утаяващ серум, като я държите в наклонено положение, същият обем Ag бавно се наслоява по стената с пипета.

За да се избегне смесването на двете течности, епруветката се поставя внимателно вертикално. Ако реакцията е положителна в епруветка, след 5-10 минути на границата между серума и изследвания екстракт се появява сиво-бял пръстен. Реакцията задължително се придружава от серумни и антигенни контроли.

Реакцията на Асколи се използва за идентифициране на антракс, туларемия и чума Ag.

Намира приложение и в съдебната медицина за определяне на вида на протеина, по-специално петна от кръв, в санитарната практика при идентифициране на фалшифициране на месо, риба, продукти от брашно и примеси в млякото. Недостатъкът на този RP е нестабилността на утайката (пръстена), която изчезва дори при леко разклащане. Освен това не може да се използва за определяне на количествения състав на Ags, участващи в образуването на утайката.

Реакция на утаяване на Ouchterlony.Реакцията се провежда върху петриеви панички в ямките на агар гел.

Като гел се използва добре измит прозрачен агар. Ag и серум се добавят към агарния гел, така че ямките, които ги съдържат, да са на определено разстояние. Разпространявайки се един към друг и комбинирайки се един с друг, антитялото и антигенът образуват имунен комплекс под формата на бяла ивица след 24-48 часа.

При наличие на комплексен преципитоген се появяват няколко ленти. В този случай лентите на серологично свързани антигени се сливат заедно, а лентите на различни се пресичат, което позволява да се определят подробностите за антигенната структура на изследваните вещества.

Широко използван за диагностициране на заболявания, причинени от вируси и бактерии, които произвеждат екзотоксини.

3.Реакция на индиректна хемаглутинация (IRHA).Използва се за откриване на полизахариди, протеини, екстракти от бактерии, микоплазми, рикетсии и вируси, чиито имунни комплекси с аглутинини не могат да се видят при конвенционалния класически RA, или за откриване на антитела в серуми на пациенти срещу тези силно диспергирани вещества и малки микроорганизми.

RNGA за серодиагностика на инфекциозни заболявания.Използвайки RNGA за откриване на антитела в серума на пациентите, се изготвят ДИАГНОСТИКА НА ЕРИТРОЦИТЕН АНТИГЕН.

Реакция на утаяване.

За целта червените кръвни клетки се третират в продължение на 15 минути с разтвор на танин при разреждане 1:20 000–1:200 000, което им придава стабилност и повишава адсорбционния капацитет. След това те се смесват с известен антиген и се инкубират в продължение на 2 часа при температура от 37°C, чувствителните към антиген червени кръвни клетки се промиват 2-3 пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид и се добавят към серума, разреждат се и се изсипват в ямките. на панелите.

Контролата е суспензия от интактни и заредени с антиген еритроцити, които се добавят към серуми, които очевидно дават положителни и отрицателни реакции.

Резултатите от реакцията се вземат предвид 2 часа след инкубиране в термостат и се оценяват с плюсове: "++++" - червените кръвни клетки покриват ямката под формата на чадър с неравни ръбове; “–” – натрупване на червени кръвни клетки под формата на “копче”

Свързана информация:

Търсене в сайта:

Реакция на пръстеновидно утаяване

Тестът за пръстенови рецептори е един от най-простите серологични методи. Извършва се в тесни утаителни тръби. Първо, бистър разтвор на антиген, взет в няколко разреждания (1:2; 1:4; 1:8; 1:16), се излива по равно във всички епруветки.

Комбинацията от антигени и антитела се случва на границата на контакт на реагентите. В резултат на това взаимодействие, в положителни случаи (когато антигенът съвпада с антитялото), след известно време се образува утайка под формата на опалесциращ пръстен.

Реакцията намира широко приложение в медицинската практика за откриване на антиген на антракс във вълна, кожи и месо от животни (реакция на Асколи); за откриване на други патогени на инфекциозни заболявания в патологичен материал, получен от пациенти или в обекти на околната среда, както и при съдебно-медицински преглед за определяне на вида на протеина, по-специално кръвен протеин или други биологични течности.

Имунодифузия на Ouchterlony

Реакцията на утаяване може да се извърши върху агар гел.

Методът се основава на факта, че частици от антигени и антитела, поради различните си размери, дифундират в гела с различна скорост и в резултат на това се преместват на различни разстояния. Това дава възможност за разделяне на отделни антигенни системи в случаите, когато те са в смес, и следователно прави възможно изследването на антигенната структура на бактерии и сложни протеинови вещества, серуми и животински тъкани.

Ясен и ефективен метод за утаяване на гел е предложен от Ouchterlony.

Правят се малки дупки върху петриеви панички с агар, изрязани на известно разстояние една от друга. В един от тях се налива антиген, в останалите - серум. Реакционните компоненти дифундират в гела един към друг и образуват видима линия на утаяване, където антигените срещат оптимални концентрации на антитела, специфични за тях. Тъй като реагентите дифундират концентрично от ямките, могат да се извършат множество анализи чрез поставяне на множество ямки, съдържащи различни антигени (или различни разреждания на същия антиген) около ямка с антитяло.

Реакцията на Ouchterlony позволява да се направи заключение за естеството на антигена от известен серум и, обратно, от известен антиген се определя природата на антителата.

Предимството на метода е, че позволява да се сравняват антигенните компоненти на сложни смеси и да се прецени техните прилики или разлики. За да сравните сходството на антигените, пригответе агар с ямки: антисерумът се излива в едната, а сравняваните антигени се изсипват в другата. Ако антигените са различни, тогава ивиците на утаяване са разположени по различен начин.

Имуноелектрофореза

През последните години методът на имуноелектрофореза се използва за деликатни имунологични изследвания. Методът е описан за първи път от P.

Grabar и K. A. Williams през 1953 г. Това е комбинация от агар гел електрофореза върху стъклени плаки с имунодифузия. Първо се извършва електрофоретично разделяне на антигена, който често е смес от протеин или други молекули. За да направите това, антигенът се въвежда в ямка, изрязана предварително в агара, и плочата с агар се поставя за известно време в зона на постоянен електрически ток.

Поради различната скорост на движение на молекулите, антигенът се разделя на съставните си части. След това утаеният имунен серум се въвежда в жлеб, изрязан в посока, успоредна на текущия поток.

Антигенът и антисерумът дифундират един към друг в гела.

Валежи

Всеки антиген води до дъгообразна зона на утаяване със съответните антитела. Броят, позицията и формата на тези линии дават представа за състава на оригиналната антигенна смес.

Реакция на флокулация

Методът е предложен от Рамон през 1924 г.

Тя се основава на факта, че смес от токсин с антитоксичен серум при определени условия дава мътност и утаяване. В този случай реакцията настъпва по-рано в тези епруветки, където количеството антитоксин съответства на дозата, която напълно неутрализира това количество токсин.

Следователно, ако силата на токсина е известна, тогава може да се определи количеството антитоксин в неизвестния тестов серум. За да направите това, пригответе няколко разреждания на тестовия серум, добавете равни количества от известен токсин към всяко разреждане и след това наблюдавайте в коя от епруветките първо настъпва флокулация (мътност на разтвора). Определете първоначалната флокулация. След това се прави изчислението.

Например, необходимо е да се определи концентрацията на антидифтерийни антитела в тестовия серум. Реакцията използва дифтериен токсин, съдържащ 50 Lf в 1 ml (Lf е минималното количество токсин, което се неутрализира от 1 антитоксична единица (AU) антисерум.

Да приемем, че е наблюдавана първоначална флокулация в епруветка, съдържаща 0,2 ml от този серум и 2 ml от известен токсин с активност 100 Lf (50 Lf x 2).

Това означава, че 0,2 ml серум неутрализира този токсин. Следователно 0,2 ml серум съдържа 100 AE, а в 1 ml от този серум концентрацията на антитела съответства на 500 AE (100 AE x 5).

По подобен метод реакцията на флокулация може да се използва за обратна цел - за определяне на имунизиращите свойства на токсоидите.

Това изисква стандартен антитоксичен серум.

Реакция на неутрализация

Реакцията се използва при диагностицирането на бактериално хранително отравяне за определяне на бактериалните токсини в тестовия материал. Освен това може да се използва при изследване на определени обекти на околната среда за съдържанието на патогенни бактерии, които произвеждат токсини, например при изследване на почвата за наличие на патогени на тетанус или газова гангрена.

Известно е, че токсинът, смесен с хомоложен антитоксичен серум, не проявява своя токсичен ефект, тъй като токсинът се неутрализира. Реакцията на взаимодействие на токсин с антитоксин по правило е строго специфична, следователно, за да се извърши реакция на неутрализация, за да се определи вида на токсина, е необходимо да има диагностични серуми, специфични за всеки тип и вид токсин. Смес от 2-3 антитоксични серума или повече може да се използва едновременно, ако се очаква наличието на няколко токсина в тестовия материал.

Реакцията на неутрализация ви позволява да определите вида и вида на токсина на патогена.

Материалът, който се тества, може да бъде филтрат от хранителни продукти, за които се предполага, че са причинили отравяне, измиване от съдове, където са били тези продукти и др.

Предполагаемият токсин първо се неутрализира. За да направите това, към епруветката с тестовия материал (експериментална епруветка) се добавя антитоксичен диагностичен серум (съдържа антитела към желания токсин); в друга епруветка (контрола) се добавя равен обем физиологичен разтвор.

След краткотрайна инкубация, съдържанието на епруветките се прилага на две групи бели мишки (опитна и контролна).

Резултатите от реакцията на неутрализация се вземат предвид веднага след смъртта на контролните животни. В този случай фактът на оцеляване на животни, които са получили антитоксичен серум заедно с тестовия материал, показва наличието в него на токсин, съответстващ на въведения серум.

Предимството на реакцията на неутрализация е високата надеждност на получените резултати.

Въпреки това, по отношение на своята чувствителност и скорост на получаване на отговор, той отстъпва на някои други методи на изследване.

Реакции на лизис

Реакциите на лизис обикновено се наричат ​​разтваряне на корпускулярни антигени под въздействието на антитела, специфични за даден антиген в присъствието на комплемент.

От имунните реакции, базирани на феномена на лизиране на бактерии и други корпускулярни антигени, се използват главно реакциите на бактериолиза и хемолиза.

Реакция на бактериолиза

Реакцията протича както in vitro, така и in vivo. Последната е известна като реакция на V.I. Исаев-Пфайфер.

Тези учени са показали, че ако морските свинчета са предварително имунизирани с антигени на холера, тогава последващото инжектиране в коремната кухина на силно вирулентна култура на Vibrio cholerae не причинява инфекция на животните, тъй като патогенът се разтваря в коремната кухина под влияние на специфични антитела.

В последствие аз.

И. Мечников доказа, че подобно разтваряне на Vibrio cholerae под въздействието на имунен серум се случва в епруветка, ако към основните компоненти се добави пресен серум, източник на комплемент. Разтварянето на бактерии под действието на специфични антитела в присъствието на комплемент се нарича реакция на бактериолиза.

При установяване на реакция на бактериолиза първо се приготвят серия от 10-кратни разреждания на тестовия серум. След това във всяка епруветка се добавя същото количество (1-2 капки) микробна суспензия. Към сместа се добавя комплемент. След инкубиране при 37 °C, сместа се инокулира от всяка епруветка върху хранителна среда, за да се определи наличието или отсъствието на жизнеспособни бактерии.

Реакцията може да се използва за определяне на антитела с помощта на известен микроорганизъм или за определяне на вида на микроба с помощта на диагностичен имунен серум.

В практическата работа на бактериолозите тази реакция се използва рядко, главно за диференциация на холера и холероподобни вибриони.

Реакция на хемолиза

Механизмът на хемолизата е подобен на механизма на бактериолизата.

Червените кръвни клетки, използвани в реакцията, са антигенът. Източникът на антитела е антиеритроцитният серум (например, ако в реакцията се използват овчи еритроцити, тогава необходимият серум със специфични антиеритроцитни антитела се получава от зайци, имунизирани с овчи еритроцити).

Кръвният серум на морско свинче най-често се използва като комплемент при реакции на лизис, тъй като съдържа значително повече комплемент от серумите на други животни.

В случаите, когато антителата в присъствието на комплемент разрушават червените кръвни клетки, хемоглобинът излиза от тях и реагиращата смес от мътна суспензия от червени кръвни клетки се превръща в прозрачна червена течност (лакирана кръв).

Тази реакция се нарича хемолиза. В лабораторната практика се използва като индикатор за адсорбцията на комплемента в реакцията на свързване на комплемента.

Свързана информация:

Търсене в сайта:

Конспект на лекцията: Предмет и кратка история на развитието на микробиологията. Общи свойства на микроорганизмите и тяхното разположение в природата.

реакция на утаяване

Ветеринарна микробиология и нейните задачи

mir.zavantag.com > Биология > Лекция

1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15

7 8 9 10 11 12 13 14 15

Подобен:

Добавете бутон към уебсайта си:
Училищни материали
mir.zavantag.com

Реакция на утаяване

Преципитацията и аглутинацията са доста сходни реакции, които се различават главно на базата на физичните свойства на AG.

В първия случай се представя в разтворими, във втория - в корпускулярни форми. Основата на RP е образуването на утайка по време на реакцията AG-AT. RP е много специфичен и чувствителен.

Реакционни съставки:

1. разтворим АГ или хаптен (преципитоген);

2. АТ - преципитини (имунен преципитиращ серум; получен чрез имунизиране на зайци с подходящи разтвори на антигени);

Реакция на утаяване

изотоничен разтвор на натриев хлорид или агар гел.

Методи за настройка на RP:

1) RP в разтвори - p.

пръстеновидни валежи;

2) RP в гел.

Реакцията на пръстеновидно утаяване се провежда в тесни епруветки за утаяване, в които се изсипват утаяващите серуми.

След това се излива разтвор на преципитоген. Ако реакцията е положителна, на границата между съставките се появява мътен пръстен на утаяване. Пример за този метод за определяне на RP е термопреципитационната реакция на Асколи, използвана за откриване на термостабилния хаптен на патогена на антракс, извлечен от животински органи, кожа, и вълна чрез екстракция чрез кипене. Една от разновидностите на RP в гел (реакция на Ouchterlony) ви позволява да определите токсигенността на дифтерийния бацил с помощта на антитоксичен серум.

Ивица филтърна хартия, напоена с антитоксичен антидифтериен серум, се поставя в петриево блюдо с хранителна среда и се инокулира с тестовите култури под формата на ивици, перпендикулярни на лентата хартия. Инкубирайте при 37 PS за 24 часа. При наличие на токсигенна култура се образуват преципитационни линии на мястото на взаимодействие на токсина с антитоксина. Реакцията на утаяване в гела се нарича имунодифузия.

Често фореза в гел - имуноелектрофореза. Принцип на метода: изследваният антиген се фракционира електрофоретично. получените фракции се анализират чрез двойна дифузия с използване на антисерум.

Тестът на Асколи се извършва за диагностициране на антракс с цел откриване на антигена на антраксния бацил. За да извършите реакцията на утаяване, трябва да имате: преципитоген - хаптен B.

Антрахис (тъканен екстракт), преципитин (утаяващ антраксен серум) и физиологичен разтвор.

Получаване на термопреципитоген.

1. Напълнете колба от 8, съдържаща 1 g натрошена кожа или 1 ml B. antilgas култура с 10 ml физиологичен разтвор.

2. Поставете колбата във вряща баня за 30-45 минути.

3. Филтрирайте през азбестов материал. Филтратът трябва да е напълно прозрачен. За реакцията на утаяване филтратът се разрежда 100 пъти или повече.

Настройка на реакцията на пръстеновидно утаяване.

1) 0,3 ml преципитиращ серум, цял или разреден 1:5, 1:10, се излива в преципитационна епруветка.

2) Преципитогенът се наслоява внимателно по стената на епруветката, ако не по-късно от 5-15 минути на границата на двете течности се образува мътен пръстен от утаен протеин.

При настройка на реакцията на утаяване се използват следните контроли:

а) антиген и физиологичен разтвор;

б) специфичен серум и физически.

в) антиген и неспецифичен серум.

Във всички контролни епруветки не трябва да има мътност. За реакцията на утаяване се използват специални епруветки за утаяване с височина 40-60 mm и диаметър 4-5 mm обикновени тръби, те се измиват добре и изсушават, така че стъклото им да е напълно прозрачно и сухо.

Реакция на утаяване(RP) се нарича утаяване от разтвор на Ag (преципитоген), когато е изложен на имунен серум (преципитин) и електролит. С помощта на RP е възможно да се открие антиген в разреждания от 1:100 000 и дори 1:1 000 000, т.е. в толкова малки количества, които не се откриват химически.

Преципитогените са ултрамикроскопични частици с протеиново-PS природа: екстракти от микроорганизми, органи и тъкани, пат материал; продукти от разпада на бактериални клетки, техните лизати, филтрати. Преципитогените са устойчиви на топлина, така че за получаването им материалът се вари. RP използва течно прозрачно Ag.

Утаяващите серуми обикновено се получават чрез хиперимунизиране на зайци в цикли в продължение на няколко месеца, като им се инжектират бактериални суспензии, филтрати от бульонни култури, автолизати, солни екстракти от микроорганизми и суроватъчни протеини.

Продукция на RP Ascoli.В тясна епруветка с малко количество неразреден утаяващ серум, като я държите в наклонено положение, същият обем Ag бавно се наслоява по стената с пипета. За да се избегне смесването на двете течности, епруветката се поставя внимателно вертикално. Ако реакцията е положителна в епруветка, след 5-10 минути на границата между серума и тестовия екстракт се появява сиво-бял пръстен. Реакцията задължително се придружава от серумни и антигенни контроли.

Реакцията на Асколи се използва за идентифициране на антракс, туларемия и чума Ag. Намира приложение и в съдебната медицина за определяне на вида на протеина, по-специално петна от кръв, в санитарната практика при идентифициране на фалшифициране на месо, риба, продукти от брашно и примеси в млякото. Недостатъкът на този RP е нестабилността на утайката (пръстена), която изчезва дори при леко разклащане. Освен това не може да се използва за определяне на количествения състав на Ags, участващи в образуването на утайката.

Реакция на утаяване на Ouchterlony.Реакцията се провежда върху петриеви панички в ямките на агар гел. Като гел се използва добре измит прозрачен агар. Ag и серум се добавят към агарния гел, така че ямките, които ги съдържат, да са на определено разстояние. Разпространявайки се един към друг и комбинирайки се един с друг, антитялото и антигенът образуват имунен комплекс под формата на бяла ивица след 24-48 часа. При наличие на комплексен преципитоген се появяват няколко ленти. В този случай лентите на серологично свързани антигени се сливат заедно, а лентите на различни се пресичат, което позволява да се определят подробностите за антигенната структура на изследваните вещества. Широко използван за диагностициране на заболявания, причинени от вируси и бактерии, които произвеждат екзотоксини.

3.Реакция на индиректна хемаглутинация (IRHA).Използва се за откриване на полизахариди, протеини, екстракти от бактерии, микоплазми, рикетсии и вируси, чиито имунни комплекси с аглутинини не могат да се видят при конвенционален класически RA, или за откриване на антитела в серуми на пациенти срещу тези високо диспергирани вещества и малки микроорганизми.

RNGA за серодиагностика на инфекциозни заболявания.Използвайки RNGA за откриване на антитела в серума на пациентите, се изготвят ДИАГНОСТИКА НА ЕРИТРОЦИТЕН АНТИГЕН. За целта червените кръвни клетки се третират в продължение на 15 минути с разтвор на танин при разреждане 1:20 000–1:200 000, което им придава стабилност и повишава адсорбционния капацитет. След това те се смесват с известен антиген и се инкубират в продължение на 2 часа при температура от 37°C, чувствителните към антиген червени кръвни клетки се промиват 2-3 пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид и се добавят към серума, разреждат се и се изсипват в ямките. на панелите. Контролата е суспензия от интактни и заредени с антиген еритроцити, които се добавят към серуми, които очевидно дават положителни и отрицателни реакции.

Резултатите от реакцията се вземат предвид 2 часа след инкубиране в термостат и се оценяват с плюсове: "++++" - червените кръвни клетки покриват ямката под формата на чадър с неравни ръбове; “–” – натрупване на червени кръвни клетки под формата на “копче”

РЕАКЦИЯ НА УТАЯВАНЕ В ГЕЛ, RPG
(Тест за утаяване на гел)

Метод за откриване на антигени и антитела, базиран на дифузия на компоненти през слой от агар (агарозен) гел и образуване на видима утайка в зони, където се създават техните еквивалентни концентрации.

Най-често използваният метод е двойна (насрещна) дифузия, предложен от O. Uchterloni през 1948 г., при който антигени и серуми се въвеждат в противоположни ямки, изрязани в гел плоча; след определено време в дебелината на гела се образуват преципитационни ленти, съответстващи на броя на антигените и антителата със същата специфичност. В допълнение, методът позволява сравнение на няколко антигена помежду си, като се използва определен стандартен серум: ако те са идентични, ивиците на утаяване, които образуват, се сливат в плътна линия и, обратно, лентите се пресичат, ако антигените, които се сравняват, имат разлики ( така нареченият феномен „шпора“. Друго предимство на RPG е, че смеси от антигени могат да бъдат разделени чрез различни скорости на дифузия и открити индивидуално; По същата причина инхибиторите на утаяване могат също да бъдат отделени, ако се съдържат в изпитвания материал. Недостатъкът на метода е неговата ниска чувствителност или разделителна способност. RPG е широко използван като тест за откриване на антигени на вируса на хепатит В и антитела към тях през 60-те и 70-те години, по-специално с помощта на тази реакция се установява наличието на е-антиген или