Клеточная биотехнология в растениеводстве. Технологии с применением гмо и биотехнологии

Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий - тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток насекомых и млекопитающих).

Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е. в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной биологической продуктивностью.

Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве.

Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др.

Второе направление - это использование культуры изолированных тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного материала.

Третье направление - это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам - засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр.

Культуры растительных клеток используют для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях. Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол, акуаммалин и др.

Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ - ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов - ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток.

Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений.

Культура растительных тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать здоровые растительные клоны и на этой основе - перспективный посадочный материал практически в неограниченных масштабах.

Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических методов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомого-хозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты до недавнего времени не находили массового применения.

Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Техника клеточных культур насекомых для размножения вирусов весьма перспективна. Для этого необходимо получение высокопродуктивных линий клеток, оптимизация питательных сред, выбор эффективных систем «вирус - клетка». По этой технологии в США производят препарат «Элькар». Весьма успешны разработки по рекомбинантным бакуловирусам с генами, кодирующими водный обмен насекомых. После применения такого препарата насекомые погибают в течение 5 дней от обезвоживания либо перенасыщения водой.

Новые методы биотехнологии могут повлиять на цену вирусных препаратов. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Начата реализация использования потенциала клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP - virus-like particle - вирусоподобные частицы), предназначенных для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.

Культуры клеток животных широко используют в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин.

Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности стволовых клеток, и технологий - терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей.

Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется. Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения болезни Паркинсона и болезни Хагинтона.

Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожоговых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии.

Поиск новых технологий для восстановления утраченной функции органа или системы привели к появлению на стыке биотехнологии и медицины тканевой инженерии (регенеративной медицины и органогенеза). Будущее медицины напрямую связывают с развитием клеточных технологий, которые позволяют, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав. Такое «обновление» структурно-функциональных элементов органа дает возможность решать те же задачи, что и органная трансплантация. Вместе с тем, эта технология намного расширяет возможности трансплантационного лечения, делая его доступным для широкого круга разных категорий пациентов.

Основой для развития новейших реконструктивных технологий являются функционирующие клетки, способные в зависимости от микроокружения формировать ткани разных типов.

Список болезней, при лечении которых клеточные технологии уже используются или их применение планируется в ближайшем будущем, быстро растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезни, медикаментозное лечение которых малоэффективно. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом.

Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами.

Революционные преобразования традиционных биотехнологических процессов связаны с применением методов генетической инженерии. Метод рекомбинантных ДНК является краеугольным камнем новейшей биотехнологии. Создание рекомбинантных ДНК означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов.

С помощью генетической инженерии разработаны и используются различные социально значимые технологии и процессы:
- производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин;
- лечение некоторых генетических заболеваний;
- создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства;
- повышение урожайности и снижение стоимости продукции;
- снижение аллергенности некоторых продуктов;
- улучшение питательных свойств продуктов;
- разработка биодеградирующих пластмасс;
- снижение уровня загрязненности воды и воздуха;
- замедление скорости порчи пищевых продуктов;
- контроль над вирусными заболеваниями.

Молекулярное, или генетическое, клонирование - процесс создания генетически идентичных молекул ДНК - является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур, основывается на методах генетического клонирования.

С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область применения клонирования чрезвычайно широка.

К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых).

Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами: баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала - части Ti-плазмиды (Т-ДНК) - Agrobacterium tumefaciens -возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы - Lux-гены или ген бактериальной Р-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды. Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения. Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями.

Цилиндрические эксплантанты заражали вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности зараженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского университета (США) предложили новый метод - стрелять по клеткам растений вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел» клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом металлических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался универсальным.

С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии - активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы.

Удаление средней части привело к потери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать воду при -1-5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INA-бактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.

Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение генетически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено, что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубеньков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нитрогеназы, т.е. азотфиксацию.

В настоящее время большие средства в США и других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие. Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы.

Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.

Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, - придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt.

Известно, что гены, контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака.

В выросшем целом растении табака каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница погибает, не причинив существенного вреда растению.

Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получение рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, токсичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает усвоение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции.

Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения сопряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков, обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные механизмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате трансплантации одного или немногих генов.

В то же время устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом в полевые условия.

Новый путь модификации генома - применение антисмысловых РНК, т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.

Генетическая инженерия животных направлена на выведение животных с высокими эксплуатационными свойствами.

Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения видов, находящихся под угрозой вымирания.

К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ранняя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр.

Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом клонирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец.

Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок -ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.

Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры.

Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока.

Новый метод - перенос ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической клетки - любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой, кроме половых клеток - сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом (в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая - от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только из одного хромосомного набора.

Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку.

В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть использован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время.

Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений -все это способствует повышению качества жизни человека.

Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что создало глобальную экологическую проблему.

Радикальным решением этой проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров - высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды).

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

Микроорганизмы существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т. д.
Из более 100000 известных видов микроорганизмов в промышленности используют относительно мало – около 100 видов. Они должны соответствовать следующим требованиям:
1. Расти на дешёвых и доступных субстратах;
2. Обладать высокой скоростью роста биомассыи давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата;
3. Проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов (рис. 2.1);

Рис. 2.1.Микроорганизмы, используемые в промышленном синтезе различных соединений
А – Аcetobacter aceti ; Б – Aspergillus niger ; В – Penicillium chrysogenum ; Г – Lactobacillus delbruecki ; Д – Производство левана при ферментации среды, содержащей Zymomonas mobilis

4. Быть генетически однородными, стабильными в отношении продуктивности и требований к питательному субстрату, а такжеусловиям культивирования;
5. Быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;
6. Быть безвредными (не обладать патогенными свойствами) для людей и окружающей среды;
7. Желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными, так как в этом случае легче предохранить ферментируемый субстрат от инвазии посторонней микрофлоры;
8. Целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата.
Возрастающий интерес представляют анаэробные микроорганизмы, поскольку при культивировании не требуют энергоёмких аэрирующих устройств.
Сверхсинтез, т. е. способность микроорганизма синтезировать определённый продукт в количествах, превосходящих его физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были привлечены к хозяйственной деятельности человека в тысячелетней давности и был проведён стихийный отбор наиболее продуктивных форм. Сейчас такие природные штаммы микроорганизмов, иногда после сознательного отбора, применяют для производства микробной биомассы (микробного белка) в качестве бактериальных азотных удобрений, биопестицидов, в производстве пищевых продуктов и в других отраслях народного хозяйства. Однако основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селекционными штаммами.
В настоящее время впромышленности применяют три вида штаммов:
1. Природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором;
2. Штаммы, изменённые в результате индуцированных мутаций;
3. Штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.
Принципы селекции организмов. Начиная сознательную селекцию микроорганизмов, человек ставил целью создать промышленные организмы с необычными для диких микробов свойствами. Методологически эту цель человек решает двумя путями:
1. Коррекцией генетической информации микробной клетки, исключая не желаемые для промышленного синтеза свойства и усиливая нужные признаки.
2. Индукцией совершенно новой информации в генетической программе клетки.
Для этого необходимо также решить следующие задачи:
1. Существенно увеличить продуктивность, свойственную данному виду микробов и его продукту обмена веществ;
2. Генетически запрограммировать биосинтез таких веществ, которые несвойственны данному виду или даже несвойственны микробному миру.
В отличие от селекции культурных растений и домашних животных, имеющей тысячелетнюю историю и богатый опыт, целенаправленный отбор и селекция микроорганизмов начались только после узнавания микромира и развивались параллельно с достижениями генетики как научной дисциплины.
Селекционируя любой живой организм, человек опирается на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы, как объект селекции, имеют ряд особенностей:
1. Выращивание микробной культуры из одной клетки – обычный для микробной селекции приём – приводит к тому, что в руках селекционера в качестве исходного материала селекции всегда оказывается особь клона (имеющего генетическую однообразность). С другой стороны, клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счёт естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами;
2. Большинство микроорганизмов гаплоидные, с одним экземпляром хромосом, поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;
3. У большинства микроорганизмов, имеющих промышленное значение, до сих пор не известна способность к гибридизации (половому размножению). Это означает, что селекцию клеток можно вести только вегетативным путём;
4. Микроорганизмы характеризуются исключительно быстрой сменой поколений, поэтому возможностей для отбора положительных экземпляров у селекционера микробиолога значительно больше. Оценку выбранного микроорганизма можно провести за считанные дни выращивания в отличие от макроорганизмов, где результаты работы видны через несколько лет;
5. Селекционер микроорганизмов имеет огромное число индивидуумов для отбора, что принципиально расширяет его возможности, но для оценки продуктивности каждого клона требуется трудоёмкая работа.
Культуру, подлежащую селекции, можно выбрать из собранных в коллекции культур (музейные культуры); можно использовать известные промышленные продуценты; можно изолировать микробы из природных субстратов.

Представления о биохимии и физиологии микроорганизмов ориентируют селекционера на определённые группы микроорганизмов с наиболее вероятным потенциалом сверхсинтеза интересующего вещества. Продуценты антибиотиков, главным образом, встречаются среди грибов аскомицетов и актиномицетов, сверхсинтез аминокислот легче получить у коринебактерий, внеклеточные ферменты часто синтезируют дрожжи. Главные этапы селекции микроорганизмов отражены на рисунке 2.2.

Рис. 2.2. Схема селекции микроорганизмов

Таблица 2.1. Группы методов клеточной технологии

Методы создания дальнородственных гибридов

Клеточные технологии в селекции растений . Обогащение генофонда зерновых культур может быть достигнута при использовании огромных генетических ресурсов их дикорастущих сородичей. Найдены виды злаков с высокой устойчивостью к:

• болезням и вредителям,
• температурным и водным стрессам,
• засолению и высокой кислотности почв.

В селекционной работе для преодоления межвидовой (или даже межродовой) несовместимости применяют методы:

• оплодотворения in vitro,
• культуру зародышей,
• возвратные скрещивания и другие современные приемы (Feldman, Sears, 1984).

Генная инженерия растений создает совершенно новый механизм генетической изменчивости - трансгеноз , который в отличие от ранее существовавших (рекомбиогенез, мутагенез) характеризуется возможностью переноса отдельных генов. Правда, эта особенность затрудняет применение методов генной инженерии для улучшения ряда хозяйственно ценных признаков, наследуемых полигенно. Но уже получены химерные растения, несущие гены устойчивости к болезням, насекомым, гербицидам и др. (Кильчевский, Хотылева, 1997).

Отдаленная гибридизация культурных злаков с дикорастущими сородичами имеет целью перенос единичных генов или небольших фрагментов хромосом от дикорастущих в геном культурных видов. Но для этого необходимо преодолеть барьер несовместимости - отсутствие конъюгации хромосом в мейозе. У пшеницы в хромосоме 5В были обнаружены гены, влияющие на конъюгацию хромосом, и, таким образом, выявлена возможность в определенной степени управлять этим процессом.

В Мадридском университете (Испания) и Институте селекции общества Макса Планка (Кельн, ФРГ) для озимой ржи разработан метод прямого переноса генов , позволяющий получать трансгенные растения относительно простым способом in vivo, исключающим необходимость регенерации растений из клеточных. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ризосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982.

Более широкое практическое применение в настоящее время получило другое важнейшее направление современной биотехнологии - клеточная селекция как метод создания новых форм растений путем выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций в селективных условиях. Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro, что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны - создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных растений.

Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в:

• отсутствии сезонности в работе,
• возможности использования миллионов клеток при отборе,
• направленности селекции путем применения селективных сред,
• выполнении работ в лабораторных условиях

С развитием культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера , который является разновидностью гиногенеза

План лекции

Тема 5,6. Препарат для сельского хозяйства. Белок одноклеточных микроорганизмов

ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ

МОДУЛЬ 2.

Форма проведения лекции: мозговая атака

1 Биотехнология и растениеводство.

2 Биотехнология и животноводство.

3 Технологическая биоэнергетика.

4 Производство кормового белка.

5 Использование дрожжей и бактерий.

6 Использование водорослей и микроскопических грибов.

Проблема для решения: области применения биотехнологии в сельском хозяйстве.

Студенты высказывают идеи для решения этой задачи. Затем идеи анализируются группой экспериментов при помощи и консультировании преподавателя. Правило мозговой атаки – высказываются любые идеи вплоть до самых абсурдных, запрещается критика идей в момент атаки. Все идеи записываются ведущим, и обеспечивается их обозрение участниками. Такая лекция активизирует мыслительную деятельность студентов, развивает эвристические способности.

Культурные растения страдают от сорняков, грызунов, насекомых-вредителей, нематод, фитопатогенных грибов, бактерий, вирусов, неблагоприятных погодных и климатических условий. Перечисленные факторы наряду с почвенной эрозией и градом значительно снижают урожайность сельскохозяйственных растений. Огромный ущерб в картофелеводству наносят колорадский жук, а также гриб Phytophtora -возбудитель ранней гнили (фитофтороза) картофеля.

Кукуруза подвержена опустошительным «набегам» южной листовой гнили, ущерб от которой в США в 1970 г. был оценён в 1 млрд. долларов.

В последние годы большое внимание уделяют вирусным заболеванием растений. Наряду с болезнями, оставляющими видимые следы на культурных растениях (мозаичная болезнь табака и хлопчатника, зимняя болезнь томатов), вирусы вызывают скрытые инфекционные процессы, значительно снижающие урожайность сельскохозяйственных культур и ведущие к их вырождению.

Биотехнологические пути защиты растений от рассмотренных вредоносных агентов включают:

Выведение сортов растений, устойчивых к неблагоприятным факторам;

Химические средства борьбы (пестициды), с сорняками (гербициды), грызунами (ратициды), насекомыми (инсектициды), нематодами (нематоциды), фитопатогенными грибами (фунгициды), бактериями, вирусами.;

Наряду с защитой растений ставится задача повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, их пищевой (кормовой) ценности, создание сортов растений, растущих на засоленных почвах, в засушливых и заболоченных районах. Разработки нацелены на повышение энергетической эффективности различных процессов в растительных тканях, начиная от поглощения кванта света и кончая ассимиляцией СО 2 и водно-солевым обменом.

Большая часть медико-биологических исследований проводится на клетках in vitro (то есть, не на живом организме, а на клетках «в пробирке»). Клетки используют в качестве модельного биологического объекта в научных исследованиях, при тестировании и производстве лекарств. Кроме этого, ученые научились исправлять генетические ошибки в клетках и наделять их способностью противостоять некоторым заболеваниям, что служит основой для медицинских технологий будущего - генной и клеточной терапий. Эта статья расскажет о методах работы с клетками, а также о возможностях и ограничениях, связанных с их использованием.

Генеральный партнер цикла - компания : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи -

Живой объект состоит из более мелких составных частей: органов, тканей, клеток, органелл, биомолекул и одновременно является частью более масштабных систем - таких как пищевые цепочки, экосистемы, сообщества. Еще Гиппократ и Аристотель задавались вопросом соотношения целого и его частей и сошлись в понимании, что целое есть больше, чем сумма частей. Однако современная наука почти полностью полагается на альтернативный принцип - редукционизм, - в соответствии с которым познание целого осуществляется через познание его составных частей. При таком подходе теряются связи между частями, в нашем случае - между клетками. Хотя каждая клетка есть тоже, по сути, целое, но вне организма это уже не совсем та клетка, что была в его составе. Что меняется при таком переходе?

Наглядной иллюстрацией служат слизевики . Эти одноклеточные обладают способностью объединяться из десятков тысяч клеток в плазмодий , который в поисках еды может быстро передвигаться и выбрасывать споры на большое расстояние, а потом вновь распадаться на отдельные клетки (видео 1). Многие бактерии тоже обладают способностью формировать плотные конгломераты - биофильмы, или биопленки, в которых внутренние клетки защищены внешними от окружающей среды. То есть объединение в многоклеточные структуры приводит к возникновению новых функций, отсутствующих у отдельных клеток. Конкурентные преимущества за счет приобретения новых способностей послужили причиной объединения одноклеточных организмов в многоклеточные около 1 млрд лет назад .

Видео 1. Dictyostelium discoideum - одноклеточный слизевик. Когда слизевики ищут еду, отдельные клетки объединяются и формируют плазмодий до 2 мм длиной.

В многоклеточных организмах клетки существуют в неразрывной связи друг с другом на протяжении сотен миллионов лет эволюции и за это время полностью перестроились на выполнение конкретных функций. Спектр экспрессируемых клеткой генов, ее функции и активность, форма и размер, скорость деления и гибель регулируются связями с другими клетками организма. У млекопитающих эта связь основана на всевозможных сигналах: химических (гормоны, цитокины, ростовые факторы, питательные вещества, производные кислорода, ионы металлов и др.), механических и электрических (передаваемых нейронами) (рис. 4).

Рисунок 4. Основные типы межклеточных взаимодействий. В составе организма клетки тесно связаны между собой, а их активность строго скоординирована. Для этого используются: электрические сигналы (сверху ), передаваемые нейронами, химические сигналы (посередине ), передаваемые через кровь (эндокринно) или межклеточную жидкость (паракринно), а также механические силы (снизу ). Эти связи существуют как между соседними клетками, так и между даже самыми удаленными клетками организма. Клетка преобразует поступающие сигналы в инструкции для изменения спектра активных генов, а следовательно, и свойств самой клетки.

Межклеточная коммуникация лежит в основе процессов, изучаемых почти всеми медицинскими дисциплинами, в частности эндокринологией, неврологией, кардиологией, гематологией и др., но о полной расшифровке этих взаимодействий пока говорить не приходится. Если у клетки в организме нарушаются нормальные связи с окружением, она либо умирает (для этого существуют специальные механизмы самоуничтожения - апоптоз и аноикис), либо становится «асоциальной», то есть раковой. При выделении из организма и переносе в чашку Петри клетки тоже теряют почти все внешние связи, но в благоприятных условиях некоторое время живут и делятся (однако могут стать и раковыми).

В новых, искусственных условиях клетки сохраняют лишь геном, а все остальные свойства меняются - размер, скорость роста, экспрессия генов, функциональная активность, чувствительность к лекарствам, метаболизм, состав мембран и другие. В связи с этим сегодня ведется активный поиск условий in vitro , которые максимально воспроизводят условия in vivo . Большинство тканей организма содержат несколько типов клеток, имеют сложную структуру внеклеточного матрикса и пронизаны сетью сосудов и нервов (рис. 5). Полностью воссоздать такую архитектуру in vitro пока невозможно, а значит, и клетки в культуре пока остаются лишь приближением к клеткам в составе организма.

Рисунок 5. Сложная организация соединительной ткани in vivo , состоящей из: нескольких типов клеток (фибробласты, жировые клетки, макрофаги и другие лейкоциты), нескольких типов волокон (1 - эластичные, 2 - ретикулярные и 3 - коллагеновые), нервов и сосудов, заключенных в гидрогель из полисахаридов.

Выделение и культивирование клеток

Источником клеток может быть любая ткань организма. В большинстве тканей клетки находятся внутри так называемого внеклеточного матрикса , который разделяет ткань на области и формирует ее архитектуру (рис. 5 и 6) . Внеклеточный матрикс состоит из белков, образующих фибриллы: коллагена, фибронектина, эластина и протеогликанов с длинными полисахаридными ветвями (гликозаминогликанами). Последние великолепно удерживают жидкость и формируют в бoльшей части внеклеточного пространства так называемый гидрогель. В случае кости матрикс формируется из кристаллизованного фосфата кальция . Самый распространенный из белков человека - коллаген: он составляет до 30% массы всех белков организма. Компоненты матрикса синтезируются многими клетками, но специализируются на этом фибробласты.

Рисунок 6. Как выглядят ткани под микроскопом: прижизненная мультифотонная микроскопия различных участков кожи, содержащих рыхлую (а ) и плотную (б ) соединительные ткани, мышечные (в ) и нервные волокна (г ), жировые клетки (д ) и микровезикулы (е ). Коллагеновые волокна изображены красным цветом (кроме в ), кровеносные сосуды - зеленым, клетки и микровезикулы - голубым (на б - зеленым). Шкала размера - 50 мкм. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Для выделения клеток необходимо разрушить внеклеточный матрикс и разорвать связи между клетками, после чего клетки «рассыпаются» (рис. 7). Клеточную культуру можно получить и другим способом: поместив в культуральную среду кусок ткани целиком, и тогда часть клеток постепенно выползет и засеет окружающее пространство. Такой тип культуры называется эксплантом . Выделение и манипуляции с клетками обычно проводят в специальном стерильном боксе - ламинарном шкафу (рис. 8а ).

Рисунок 7. Схема выделения клеток из ткани. Фрагмент ткани, полученный прижизненно (биопсией) или после смерти, измельчают механически и обрабатывают протеолитическими ферментами, расщепляющими внеклеточный матрикс (трипсином, коллагеназой, гиалуронидазой, папаином или их комбинациями). В дополнение к ферментам используют кальций-связывающие соединения (хелаторы), которые забирают кальций у молекул клеточной адгезии и ослабляют их связь между собой и с внеклеточным матриксом. Добавление ДНКазы позволяет предотвратить склеивание клеток в тягучие сгустки за счет электростатических взаимодействий с высвободившейся из поврежденных клеток ДНК. После этого клетки отделяют от обломков матрикса (дебриса) центрифугированием и/или фильтрацией и высаживают в культуральные флаконы или чашки Петри.

У некоторых тканей нет внеклеточного матрикса или клетки не связаны с ним, что существенно упрощает процедуру выделения. Это относится, главным образом, к клеткам крови и их предшественникам, находящемся в костном мозге. Благодаря легкости выделения и сохранности поверхностных молекул для этих клеток наиболее хорошо изучено разнообразие типов и пути их формирования из стволовой клетки крови (гемопоэтической СК).

После выделения клетки помещают в питательную среду и растят в чашках Петри или флаконах в атмосфере углекислого газа (5% CO 2) и близкой к 100% влажности в CO 2 -инкубаторах (рис. 8б ). Питательная среда состоит из физиологических солей, буфера pH, аминокислот, витаминов и глюкозы, а также белковых ростовых и питательных факторов (см. врезку ниже). Добавляемый к среде индикатор феноловый красный позволяет визуально контролировать pH и придает среде красный цвет.

Рисунок 8а. Основное оборудование для культуральных работ - ламинарный шкаф. Ламинарный шкаф обеспечивает равномерный вертикальный поток стерильного воздуха, защищая культуру клеток от микробного заражения.

Рисунок 8б. Основное оборудование для культуральных работ - CO 2 -инкубатор. Углекислый газ в CO 2 -инкубаторе, во-первых, позволяет лучше воспроизвести условия in vivo , а, во-вторых, необходим для поддержания pH среды, в которой, как правило, используется бикарбонатная CO 2 -зависимая буферная система. В инкубаторе поддерживается близкая к 100% влажность, что предотвращает испарение жидкости и концентрирование ее компонентов.

Белковые ростовые и питательные факторы

Белковые факторы являются наиболее тонким местом при культивировании клеток. Самым распространенный источник этих факторов - сыворотка животных, обычно телячьих эмбрионов, реже лошадиная или из такого же животного, что и сами клетки. Клеткам добавляют цельную фильтрованную сыворотку с разбавлением до 1–10%. При исследовании действия каких-либо веществ на клетки (факторов роста, белковых гормонов, цитокинов) сыворотка создает сильный фон, который необходимо снижать, выращивая клетки без сыворотки (депривация) в течение 2–72 ч перед экспериментом. Использование сыворотки почти не поддается стандартизации и является потенциальным источником инфекций, что существенно ограничивает ее применение при производстве биомедицинских продуктов. Альтернатива сыворотке - белковые добавки стандартного состава из очищенных и рекомбинантных белков.

Проблемы культивирования и воспроизводимости в экспериментах с живыми клетками (решения от «Диаэм»)

Некоторые культуры очень чувствительны ко внешним воздействиям или колебаниям химического состава среды, в связи с чем возникает ряд вопросов:

• Как привести условия культивирования in vitro к условиям, сопоставимым с условиями in vivo ? Некоторые процессы, происходящие в живых организмах, требуют создания специальных условий (микроокружения) для клеток.
• Как организовать длительный эксперимент и вести наблюдение в динамике? Клеточные культуры - идеальный объект для постановки длительных экспериментов. Но возникает проблема гомеостаза окружающей среды: клетки постоянно потребляют питательные вещества и выделяют метаболиты. Если решать вопрос простой сменой культуральной среды, то концентрация веществ в среде между заменами будет не постоянной. Кроме того, культуру клеток придется регулярно вынимать из инкубатора, для того чтобы сменить среду или произвести наблюдение под микроскопом.
• Как обеспечить защиту культуры клеток от контаминации бактериями, микоплазмами и грибами, которые могут свести на нет все усилия по выделению клеток из тканей?
• Как добиться воспроизводимости эксперимента? Клетки - живые объекты, на поведение которых могут повлиять даже незначительные факторы: частое открывание дверцы инкубатора, разное время пребывания культуры вне инкубатора, освещение при наблюдении культур под микроскопом - все это может оказать существенное влияние на появление артефактов в эксперименте. Так что вторая задача - это добиться стабильности параметров эксперимента.

Решение:

Раковые клетки даже в организме сильно отличаются от нормальных, а в культуре это отличие только увеличивается. Так, многие раковые линии имеют увеличенный набор хромосом (анеуплоидия), что делает их более устойчивыми к повреждению ДНК. Кроме этого, многие типы раков вызваны вирусными инфекциями, передающимися и клеточным культурам, что не позволяет использовать эти клетки в производстве вакцин (см. ниже). В связи с этим в фармакологии и научных исследованиях широко востребованы линии «нормальных» - не раковых - клеток.

Именно производство вакцин послужило основным мотивом получения культуры «нормальных» клеток. С этой целью Леонард Хейфлик (рис. 10б ) выделял клетки из абортивного материала и обнаружил наличие предела числа делений клеток в культуре, получившего название предела Хейфлика . Для человеческих клеток этот предел составляет 50–70 делений и обусловлен укорочением теломер - фундаментальным механизмом старения клеток.

В 1965 году Хейфлик получил линию фибробластов легкого WI-38 (рис. 10а ), которая смертна, но была наработана и заморожена в достаточным количестве, чтобы обеспечить исследования по всему миру и по сегодняшний день . Благодаря человеческому происхождению, отсутствию вирусных инфекций и раковой трансформации эта линия нашла широкое применение в производстве вакцин. Сейчас, однако, фармкомпании опасаются, что конечный ресурс данной линии не позволит им завершить начатые исследования, и переходят на другие линии. В настоящее время эта линия широко используется для изучения молекулярных механизмов старения .

Некоторым компромиссом между раковыми и нормальными являются иммортализованные клетки: полученные из нормальной ткани, они приобрели способность к неограниченному числу делений. Такой переход к бессмертию может происходить либо спонтанно, либо в результате искусственного введения определенных генов или слияния с раковыми клетками, как в случае гибридoм . «Бессмертие» клеткам могут придать онкогены: большой Т-антиген вируса SV40, H-Ras, c-myc, E1A. Эти гены по сути вызывают опухолевую трансформацию клеток со всеми вытекающими недостатками (нестабильность генома, потеря физиологических функций и т.д.). Наиболее деликатный и получающий все большее распространение способ иммортализации - это введение в клетку гена теломеразной обратной транскриптазы (TERT) , которая достраивает теломеры и предотвращает их укорачивание при делении (рис. 11). За открытие теломеразы в 2009 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине .

Хотя такая трансдукция тоже является, по сути, онкогенной, она позволяет лучше сохранить физиологические функции и меньше дестабилизировать геном по сравнению с трансдукцией другими онкогенами. Также стоит отметить, что этот метод работает не для всех клеток: например, он не подходит для Т- и B-клеток.

Рисунок 11. Концевые участки хромосом - теломеры - укорачиваются при каждом клеточном делении, и при их истощении в клетке запускается механизм самоуничтожения. Теломеры у позвоночных состоят из повторяющихся последовательностей нуклеотидов TTAGGG. При каждом делении эти участки укорачиваются, но теломераза TERT предоставляет собственную одноцепочечную ДНК в качестве матрицы, с которой сама синтезирует сначала одну цепь, а потом ДНК-полимераза достраивает и вторую цепочку ДНК теломер. Таким образом теломераза способна поддерживать бессмертие клеток.

Дифференцированные клетки (которые приобрели свою конечную специализацию) составляют бoльшую часть клеток организма и практически не делятся. Будучи основными составляющими и «рабочими лошадками» во всех органах и тканях, они служат мишенью действия большинства лекарств, что делает их весьма востребованными для исследований. В культуре их можно получить путем направленной дифференцировки плюрипотентых стволовых клеток в нужный тип клеток (см. далее), однако этот путь имеет существенные технические и, в случае человеческих клеток, еще и этические сложности.

Наиболее распространенными культурами дифференцированных клеток являются первичные клеточные культуры - клетки, выделенные из зрелой ткани и не пассированные in vitro (рис. 12). Число делений таких клеток критически зависит от условий культивирования, но редко составляет более 5–10 раз. Исключением являются стволовые, прогениторные и некоторые специализированные клетки, например, активированные Т- и B-лимфоциты. Кроме того, при длительном культивирование первичная культура склонна к замещению фибробластами.

Многие исследования выполняются именно на первичных клеточных культурах, обладающих рядом преимуществ по сравнению с раковыми и иммортализованными клетками:

1. Они гораздо лучше соответствуют клеткам in vivo : нейроны проводят электрические импульсы, гепатоциты секретируют альбумин, макрофаги фагоцитируют бактерии и т.д.
2. Если говорить о клетках животных, они легко доступны при наличии вивария - остается лишь получить их (что, впрочем, довольно трудоемко). Доступность человеческих клеток определяется типом ткани: распространены культуры эндотелиальных клеток из пуповинной вены (HUVEC, рис. 12г) и мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, источниками которых служат побочные продукты акушерства и хирургии соответственно.
3. Они несут генотип донора, а поэтому могут использоваться для изучения причин патологий конкретного пациента на молекулярном уровне.

Культуры клеток человека, мыши, крысы, кролика и других животных собраны в коллекциях, хранящихся в жидком азоте при температуре −196 °C (рис. 13а ). Наиболее полная коллекция - ATCC в США - насчитывает более 4600 клеточных культур эукариот. В МГУ сейчас создают уникальный по своим масштабам депозитарий живых систем «Ноев ковчег» , в котором среди всевозможных образцов живых объектов есть и клетки животных и человека (рис. 13б ). Некоторые институты тоже имеют свои коллекции: например, в ИБХ РАН коллекция организована по принципу облачного хранилища с общим журналом и клетками, распределенными по разным лабораториям.

Линии клеток из коллекций можно купить; они существуют почти для каждого типа опухоли и здоровой ткани и детально охарактеризованы. Это позволяет подобрать наиболее подходящие для конкретного исследования линии и сравнивать результаты с полученными ранее в своей или в других лабораториях.

«Диаэм»: все что нужно для работы с культурами клеток

Оборудование для клеточных технологий:

Культуральный пластик, среды, сыворотки, заменители, добавки:

Материал предоставлен партнёром - компанией «Диаэм»

Использование клеток в научных исследованиях

Клеточные культуры являются прежде всего инструментом для научных исследований. Какие возможности дает этот инструмент и для чего его можно использовать? Для клеток в культуре имеется богатый арсенал методов манипуляции и анализа: некоторые входят в 12 методов настоящего спецпроекта , а о многих других рассказывают отдельные статьи на «Биомолекуле». Здесь мы кратко остановимся на основных, но перед этим обсудим уникальные преимущества клеточных культур как модельных объектов.

В отличие от клеток в организме, для клеток в культуре исследователь полностью определяет внешние условия. Хотя эти условия часто и не соответствуют условиям in vivo , воспроизводимость и контроль позволяют ставить точные эксперименты и выявлять ответ клеток на определенные стимулы. Для изучения внутриклеточных процессов эта возможность уникальна, но надо помнить, что, чем сильнее клетки в культуре отличаются от клеток в организме, тем больше вероятность, что механизмы этих процессов тоже будут отличаться.

В клетке находится отнюдь не разбавленный раствор, используемый в биохимических и структурных исследованиях, а очень плотное и насыщенное микроокружение (crowded environment ) (рис. 14 и видео 2). Как следствие, активности молекул в искусственном растворе и «в жизни» иногда отличаются на несколько порядков. Именно поэтому клетка является гораздо более адекватной моделью при изучении активностей и взаимодействий биомолекул и при анализе воздействия потенциальных лекарств на молекулы-мишени в фармакологии.

Видео 2. Трехмерная реконструкция различных внутриклеточных структур в срезе из рисунка 14. подпись

Желтый - эндоплазматический ретикулум, синий - мембранно-связанные рибосомы, оранжевый - свободные рибосомы, светло-зеленые нити - микротрубочки, голубой - плотные коровые везикулы, белый - клатрин-негативные везикулы, светло-красный - клатрин-содержащие везикулы, пурпурный - клатрин-негативные компартменты, полости со светло- и темно -зелеными внутренними и внешними поверхностями - митохондрии. Отдельные молекулы и комплексы малого размера не отображены.

Как доставить ген в клетку?

Если интересующая нас молекула - белок, то самый простой способ поместить его в клетку и изучить - это заставить его синтезироваться прямо «на месте», введя внутрь клетки ген этого белка. Существует множество методов доставки генов в клетки (рис. 15) , как на основе чисто физико-химических принципов (трансфекция ), так и с использованием вирусов в качестве носителя (трансдукция ).

Эффективность трансфекции существенно зависит от типа клеток и методики: для раковых и иммортализованных клеток это обычно 30–80%, однако для первичных клеток - редко более 10%. Исключением является метод электропорации, который иногда позволяет добиться высокой эффективности доставки генов в первичные культуры. Химические методы трансфекции не предназначены для встраивания введенного гена в геном клетки, и со временем введенная ДНК теряется .

Небольшая доля ДНК все-таки может закрепиться в геноме при трансфекции и передаваться по наследству, что позволяет получить линию со стабильной экспрессией введенного гена. Отбор ведется путем селекции таких клеток по устойчивости к антибиотику (вместе с исследуемым геном обычно вставляют и ген, обеспечивающий такую устойчивость) или с помощью нескольких циклов клеточной сортировки.

Рисунок 15. Методы трансфекции и трансдукции. Для внедрения гена в клетку необходимо преодолеть внешнюю мембрану. Чаще всего для этого используют наноразмерные комплексы ДНК с липидными везикулами (липофекция), полимерными носителями или кристаллами кальция, которые сами поглощаются клеткой. Также можно временно продырявить мембрану с помощью электрического разряда - электропорации. Для случаев, когда ген нужно ввести лишь в несколько клеток (например, при изучении единичных нейронов), используют метод микроинъекции. В случае трансдукции используют вирусные частицы, в которые вместо части их собственного генома помещен необходимый ген. При этом вирусы сохраняют способность проникать в клетки, эффективно доставлять ген до ядра и, в случае некоторых вирусов, встраивать его в ДНК клетки.

Методы вирусной трансдукции имеют ряд преимуществ перед трансфекцией: высокая эффективность в отношении первичных клеточных линий, возможность встраивания гена в геном, применимость in vivo и избирательность действия вирусов на определенные типы клеток и тканей.

Для трансфекции создают искусственные вирусные частицы, снаружи похожие на натуральные вирусы и проникающие в клетку по тем же механизмам. Но внутри вместо части собственной ДНК они несут нужные исследователю гены и лишены программы саморепликации (то есть, такие частицы не заразны). Сегодня широко применяется около десятка генно-инженерных конструктов на базе различных вирусов. Для изменения избирательности вирусных частиц они могут быть дополнительно модифицированы заданными поверхностными молекулами.

Отредактируй это

Сейчас возможности клеточных технологий выходят на новый уровень после недавнего прорыва в методах редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas-9 . Методика уже активно используется, и в продаже имеются наборы для избирательного удаления определенных генов из клеток (генетический нокаут). Преимуществом CRISPR/Cas-9 является простота по сравнению с доступными прежде методами редактирования генома (цинковыми пальцами, TALEN) . С помощью CRISPR/Cas-9 можно не только удалять и выключать гены, но и менять их и восстанавливать. На CRISPR/Cas-9 сегодня возлагают большие надежды в лечении моногенных наследственных заболеваний .

Да будет свет

Относительная простота введения желаемых генов в клетки открывает доступ к богатым возможностям, пожалуй, самого мощного на сегодня инструмента молекулярной биологии - генетически кодируемых флуоресцентных белков . Они позволяют отслеживать отдельные клетки в организме и даже молекулы в клетках, окрашивать определенные органеллы, изучать межмолекулярные взаимодействия и конформацию белков, измерять концентрации вторичных посредников (Ca 2+ , H 2 O 2 , цАМФ, H + , АТФ/АДФ, НАДН и др.), визуализировать и определять активность различных белков .

Помимо этого, в последние пять лет широкое распространение получила оптогенетика - метод, в котором с помощью генетически кодируемых светочувствительных белков можно управлять клеточными процессами с высоким временным и пространственным разрешением, буквально посветив в нужную область лазером (рис. 16) .

Рисунок 16. Оптогенетические конструкции позволяют с помощью лазера в заданной точке клетки и в заданное время запускать всевозможные процессы: 1 - ток ионов через мембрану и электрические импульсы, 2 - активность генов, 3 - активность белков, 4 - активность рецепторов и передачу сигналов в клетки, 5 - поглощение веществ снаружи, 6 - взаимодействия между белками, 7 - перемещение внутриклеточных везикул, 8 - синтез и деградацию белков, 9 - дыхательную цепь митохондрий и гибель клетки, 10 - передачу сигнала вторичными посредниками.

Флуоресцентные белки и оптогенетика проявляют весь свой потенциал в связке с современными методами флуоресцентной микроскопии . Эти методы достигли чувствительности единичных молекул при пространственном разрешении в несколько десятков нанометров, а при временнoм - до нескольких десятков микросекунд (рис. 17). Хотя такое пространственное разрешение и ниже, чем у электронной микроскопии, наличие временнoго разрешения (то есть применимость к живым клеткам) и возможность анализировать одновременно несколько молекул делают методы оптической микроскопии уникальными для широкого круга задач.

Рисунок 17. Пространственное и временнoе разрешение современных методов оптической микроскопии высокого разрешения. Обозначения: FRET - Forster resonant energy transfer (Фёрсторовский резонансный перенос энергии ); SPT - single particle tracking (микроскопия траекторий единичных частиц); PALM/STORM - photoactivation localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy (фотоактивированная локализационная микроскопия/микроскопия стохастической оптической реконструкции); STED - stimulated emission depletion (микроскопия подавления стимулированного испускания ); FCS - fluorescence correlation spectroscopy (флуоресцентная корреляционная спектроскопия); TIRF - total internal reflection (микроскопия полного внутреннего отражения); SIM - structured illumination microscopy (микроскопия структурированного освещения); - confocal microscopy (конфокальная микроскопия).

Типирование и сортировка

Еще одним мощным методом, который применим только к клеткам in vitro и ex vivo (сразу после выделения), является проточная цитометрия - поштучное исследование клеток в потоке жидкости: клетки по одной проходят через луч лазера, а специальные детекторы ловят сигнал флуоресценции и светорассеяния от освещенной лазером клетки. В отличие от микроскопии, она является исходно количественным методом, то есть позволяет точно измерить интенсивность флуоресценции и обладает высокой производительностью: скорость обработки достигает миллиона клеток в минуту. Это позволяет проводить «перепись» гетерогенных клеточных популяций, коими являются все первичные клеточные культуры. В частности, ей нет альтернатив при идентификации, подсчете и сортировке редких в популяции клеток, таких как стволовые клетки или антиген-специфичные лимфоциты, которых может быть лишь несколько клеток на миллион. Наибольшее распространение цитометрия нашла в иммунологии для анализа субпопуляций лейкоцитов без перевода их в культуру. Важной разновидностью цитометрии является клеточная сортировка в потоке, которая позволяет не только анализировать, но и выделять отдельные субпопуляции из гетерогенных клеточных смесей с чистотой более 99%.

От клеток к организму с помощью стволовых клеток

До этого мы рассматривали традиционные методы работы с клетками, многие из которых предложены во второй половине прошлого столетия. В то время это были передовые технологии, которые впоследствии внесли существенный вклад в развитие биомедицинской науки и молекулярной биологии, а сейчас являются частью обыденной лабораторной практики. Сегодня передовые клеточные технологии позволяют достичь впечатляющих результатов. Однако в научных и, в особенности, научно-популярных статьях авторы часто склонны преувеличивать масштаб открытия и замалчивать сложности и ограничения. Это создает несколько искаженную картину, в которой уже сегодня где-то есть врачи, которые печатают органы на 3D-принтере, избавляют людей от ВИЧ и слепоты и способны вылечить практически любой рак. Действительно, успехи клеточных технологий позволяют надеяться, что это и правда станет возможным в будущем, но пока ведущие специалисты призывают не торопиться с прогнозами, поскольку организм и ткань гораздо сложнее, чем просто сумма составляющих клеток.

Эмбриональные стволовые клетки

Рисунок 20а. Стимуляция формирования эмбриоидных телец в подвешенных каплях.

Рисунок 20б. Культивирование клеток в камере Максимова. В ней капля с кусочком ткани или клетками помещается на малое покровное стекло. С помощью капельки воды и капиллярных сил малое покровное стекло адгезируется к большому, которое, в свое очередь, кладется на основание и герметизируется парафином.

Справочная информация по работе с культурами клеток от «Диаэм»

Хотите узнать больше о тонкостях работы с культурами клеток или увидеть, как организована клеточная лаборатория?

Дополнительная информация по теме «Клеточные технологии».