Millistel juhtudel peetakse immunoblotti kahtlaseks? Mis on immunoblot? Lisa oma hind andmebaasi Kommenteeri. III. Nitrotselluloosmembraanile immobiliseeritud valkude immunokeemiline värvimine

Immuunblotanalüüs (immunoblot, Western blot, Western blot)- kombineerib ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) viiruse antigeenide eelneva elektroforeetilise ülekandega nitrotselluloosi ribale (ribale).

Selles ilusas teaduslikus nimes tõlgitakse "blot" tõenäoliselt kui "blot" ja "western" kui "western" peegeldab selle "bloti" leviku suunda paberil vasakult paremale, see tähendab geograafilisel kaardil, see vastab suunale läänest itta. "Immuunblot" meetodi olemus seisneb selles, et immunoensümaatiline reaktsioon viiakse läbi mitte antigeenide seguga, vaid HIV-antigeenidega, mis on eelnevalt immunoforeesi teel jaotatud fraktsioonideks, mis paiknevad molekulmassi järgi nitrotselluloosmembraani pinnal. Selle tulemusena jaotuvad peamised HIV-valgud, antigeensete determinantide kandjad, pinnale eraldi ribadena, mis ilmnevad ensüümi immuunanalüüsi käigus.

Immunoblot sisaldab mitut etappi:

Riba ettevalmistamine. Immuunpuudulikkuse viirus (HIV), mis on eelnevalt puhastatud ja selle koostisosadeks hävitatud, allutatakse elektroforeesile, samas kui HIV-i moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel kantakse blotimisega (analoogselt "blotteril" liigse tindi väljapressimisega) antigeenid üle nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd HIV-le iseloomulike, silmale nähtamatute antigeensete ribade spektrit.

Näidisuuring. Uuritav materjal (patsiendi seerum, vereplasma jne) kantakse nitrotselluloosi ribale ja kui proovis on spetsiifilised antikehad, siis need seonduvad rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega. Järgnevate manipulatsioonide tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks.

Tulemuse tõlgendamine. Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Rada A – positiivne juhtimine

Rada B – nõrk positiivne kontroll

Rada C – negatiivne kontroll

Riba D – positiivne proov (tuvastatud HIV-1 antikehad)

Praegu on immuunblotanalüüs (immunoblot) peamine meetod viirusspetsiifiliste antikehade olemasolu kinnitamiseks uuritavas seerumis. Mõnedel HIV-nakkuse juhtudel tuvastatakse spetsiifilised antikehad enne serokonversiooni tõhusamalt immunoblotanalüüsiga kui ELISA-ga. Immuunblotanalüüs näitas, et gp 41 vastaseid antikehi avastatakse kõige sagedamini AIDS-i patsientide seerumis ja profülaktilisel eesmärgil uuritud isikutel p24 tuvastamine nõuab täiendavaid uuringuid HIV-nakkuse tuvastamiseks. Geneetiliselt muundatud rekombinantsetel valkudel põhinevad immunoblot-testisüsteemid osutusid spetsiifilisemaks kui tavalised puhastatud viiruslüsaadil põhinevad süsteemid. Rekombinantse antigeeni kasutamisel ei moodustu mitte difuusne, vaid selgelt piiritletud kitsas antigeeniriba, mis on arvestuseks ja hindamiseks kergesti ligipääsetav.

HIV-1-ga nakatunud isikute seerum, tuvastada järgmiste peamiste valkude ja glükoproteiinide antikehad - struktuursed ümbrise valgud (env) - gp160, gp120, gp41; tuumad (gag) - p17, p24, p55, samuti viiruse ensüümid (pol) - p31, p51, p66. HIV-2 puhul on tüüpilised env-vastased antikehad - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Reaktsiooni spetsiifilisuse kindlakstegemiseks vajalikest laboratoorsetest meetoditest on suurim tunnustus HIV-1 ümbrisvalkude - gp41, gp120, gp160 ja HIV-2 - gp36, gp105, gp140 antikehade tuvastamisel.

WHO loeb seerumi positiivseks, kui immunoblotanalüüsiga tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV glükoproteiini vastu. Nende soovituste kohaselt, kui reaktsioon tekib ainult ühe ümbrisvalguga (rp 160, rp 120, rp 41) kombinatsioonis või ilma reaktsioonita teiste valkudega, peetakse tulemust kahtlaseks ja soovitatakse teha teist katset, kasutades komplekti. teisest sarjast või mõnest teisest firmast. Kui pärast seda jääb tulemus kahtlane, on soovitatav jälgida 6 kuud (uuring 3 kuu pärast).

Positiivse reaktsiooni olemasolu p24 antigeeniga võib viidata serokonversiooni perioodile, kuna selle valgu vastased antikehad ilmuvad mõnikord esimesena. Sel juhul soovitatakse olenevalt kliinilistest ja epidemioloogilistest andmetest uuringut korrata seerumiprooviga, mis on võetud vähemalt 2 nädalat hiljem ja just seda juhul, kui HIV-nakkuse korral on vaja paariseerumit.

Positiivsed reaktsioonid gag- ja pol-valkudega ilma reaktsioonita env-valkudega võivad kajastada varase serokonversiooni staadiumit ning samuti võivad viidata HIV-2 infektsioonile või mittespetsiifilisele reaktsioonile. Isikud, kellel on sellised tulemused pärast HIV-2 testimist, vaadatakse uuesti 3 kuu pärast (6 kuu jooksul).

Immunoblotanalüüs (immunoblot) on ülispetsiifiline ja ülitundlik referentsmeetod, mis kinnitab diagnoosi patsientidele, kellel on saadud positiivsed või ebamäärased testitulemused, sh. RPGA või ELISA abil .

See üksikute patogeeni antigeenide antikehade tuvastamise meetod põhineb ELISA-l nitrotselluloosmembraanidel, millele kantakse spetsiifilised valgud eraldi ribadena, mis eraldatakse geelelektroforeesiga. Kui teatud antigeenide vastased antikehad on olemas, ilmub vastava riba lookuse juurde tume joon. Immunobloti unikaalsus seisneb selle kõrges teabesisalduses ja saadud tulemuste usaldusväärsuses.

Uurimismaterjal on inimese seerum või plasma. Ühe riba uurimiseks on vaja 1,5-2 ml verd või 15-25 µl seerumit.

Vastavalt WHO soovitusele kasutatakse HIV-nakkuse diagnoosimisel täiendava ekspertmeetodina immunoblotimist (western blot), mis peaks kinnitama ELISA tulemusi. Seda meetodit kasutatakse tavaliselt positiivse ELISA tulemuse kahekordseks kontrollimiseks, kuna seda peetakse tundlikumaks ja spetsiifilisemaks, kuigi keerulisemaks ja kallimaks.

Immunoblotanalüüs ühendab ensüümi immuunanalüüsi (ELISA) viirusvalkude eelneva elektroforeetilise eraldamisega geelis ja nende ülekandmisega nitrotselluloosmembraanile. Immunobloti protseduur koosneb mitmest etapist. Esiteks, eelnevalt puhastatud ja selle koostisosadeni hävitatud HIV allutatakse elektroforeesile, samal ajal kui kõik viiruse moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel viiakse antigeenid blotimise teel geelilt üle nitrotselluloosi ribale või nailonfiltrile, mis sisaldavad nüüd HIV-le iseloomulikku, silmale nähtamatut valkude spektrit. Järgmisena kantakse ribale uuritav materjal (patsiendi seerum, plasma jne) ja kui proovis on spetsiifilisi antikehi, seostuvad need neile rangelt vastavate antigeenvalkude ribadega. Järgnevate manipulatsioonide (nagu ELISA) tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks. Triipude olemasolu riba teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Immunoblotimist kasutatakse kõige sagedamini HIV-nakkuse diagnoosi kinnitamiseks. WHO peab seerumit positiivseks, kui immunoblotanalüüsiga tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV ümbrise valgu vastu. Nende soovituste kohaselt, kui reaktsioon tekib ainult ühe ümbrisvalguga (gp160, gp120, gp41) kombinatsioonis või ilma reaktsioonita teiste valkudega, peetakse tulemust kaheldavaks ja soovitatakse teha teist uuringut, kasutades erinevat komplekti. seeriast või mõnest teisest firmast. Kui pärast seda jääb tulemus kahtlane, jätkatakse uuringuid iga 3 kuu tagant.

Iseärasused

Immunoblotanalüüs on usaldusväärne meetod, mis võimaldab teil määrata esimest ja teist tüüpi HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu. Kui inimene on nakatunud, tekivad kahe nädala jooksul antikehad, mida saab tuvastada palju hiljem. HIV-i eripära on see, et antikehade arv suureneb kiiresti ja jääb patsiendi verre. Isegi kui need on olemas, ei pruugi haigus avalduda kahe või enama aasta jooksul. ELISA meetod ei määra alati haiguse esinemist täpselt, seetõttu on ensüümi immuunanalüüsi positiivse tulemuse korral vajalik tulemuste kinnitamine immunoblotanalüüsi ja PCR abil.

Näidustused kohtumiseks

Mis see "immunoblot" on, on juba välja selgitatud, kuid kellele see uuring on ette nähtud? Inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) analüüside võtmise põhjus immunoblotanalüüsiga on positiivne ELISA tulemus. Patsientidel, keda opereeritakse, on vaja läbida ensüümi immuunanalüüs. Lisaks tuleks analüüs teha nii rasedust planeerivatele naistele kui ka kõigile, kes on seksuaalselt väljamõeldud. Kui ELISA tulemused kahtlevad, määrake HIV-ga patsientidele immunoblotanalüüs.

Arsti poole pöördumise põhjuseks võivad olla järgmised murettekitavad sümptomid:

• järsk kaalulangus;
• nõrkus, töövõime kaotus;
• soolehäire (kõhulahtisus), mis kestab kolm nädalat;
• keha dehüdratsioon;
• palavik;
• paistes lümfisõlmed kehas;
• kandidoosi, tuberkuloosi, kopsupõletiku, toksoplasmoosi areng, herpese ägenemine.

Patsient ei pea enne veenivere loovutamist valmistuma. 8-10 tundi enne uuringut ei saa te süüa. Päev enne vereloovutamist ei ole soovitatav juua alkohoolseid ja kohvijooke, teha raskeid füüsilisi harjutusi, kogeda põnevust.

Kuidas uuringut tehakse?

Patsiendi seisukohalt ei erine immunoblot ühestki teisest analüüsist: võetakse veeniveri, uuritakse ja saadakse tulemus. Aga kui tehnikat veidi lähemalt kirjeldada, siis see pole väga lihtne, aga proovige siiski välja mõelda.

Esiteks võetakse reaktiivi tootvas tehases inimese immuunpuudulikkuse "referentsviirus". Seejärel hävitatakse viirus spetsiaalse protseduuri (elektroforeesi) abil geelisöötmes selle väikseimateks komponentideks: valgud (viiruse antigeenid). Seejärel, kasutades blottingut ennast (inglise keelest wetting), asetatakse osakesed spetsiaalsele materjalile - nitrotselluloosile või nailonfiltrile, saadakse kasutusvalmis indikaator, nn riba. Riba on riba, milles antigeenid jaotuvad sõltuvalt nende molekulmassist selges järjestuses, see tähendab, et igale paberimillimeetrile vastab teatud valk.

Võib-olla teate, et kui viirused esinevad inimese veres, hakkab keha tootma nende kestade (teatud valkude) vastu antikehi ja igal viirusel on oma individuaalne antigeenvalkude komplekt. Antigeenvalkude antikehade tuvastamine veres on immunoblotmeetodi aluseks. Lõppude lõpuks, kui antikeha põrkab kokku antigeeniga, suhtlevad nad kindlasti üksteisega - nad "kleepuvad".

Niisiis, antigeenid on ribaribal ja kui katsealuse veres on sobivaid antigeene, suhtlevad need tingimata üksteisega ja sellesse kohta ilmub riba ribale indikaator - tasane tahe. ilmuvad (nagu rasedustest). Veelgi enam, riba konkreetses kohas saab sel viisil arst aru, kas veres on teatud viirusele iseloomulik valkude komplekt.

Näiteks kui ribal on valgu lokaliseerimise kohtades tumenemine gp160, gp120, gp41 HIV diagnoositakse, teiste viiruste puhul on see täiesti erinev valkude komplekt.

Tuleb märkida, et immunoblot võimaldab teil viiruse olemasolu täpselt kindlaks teha ainult siis, kui antikehade komplekt veres on täielik, st kui valgud gp160, gp120, gp41 esinevad samal ajal, siis see on 100% HIV-nakkus. Aga kui vähemalt üks on puudu, näiteks: gp41 puudub, aga on ainult gp160, gp120, siis peetakse testi kahtlaseks ja nõuab kordamist.

KKK

Millised on immunobloti etapid?

1. Riba ettevalmistamine. Immuunpuudulikkuse viirus (HIV), mis on eelnevalt puhastatud ja selle koostisosadeks hävitatud, allutatakse elektroforeesile, samas kui HIV-i moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel kantakse blotimisega (analoogselt liigse tindi blotterile pigistamisega) antigeenid nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd HIV-le iseloomulike antigeensete ribade spektrit, mis on silmale nähtamatu.
2. Näidisuuring. Uuritav materjal (patsiendi seerum, vereplasma jne) kantakse nitrotselluloosi ribale ja kui proovis on spetsiifilised antikehad, siis need seonduvad rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega. Järgnevate manipulatsioonide tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks.
3. Tulemuse tõlgendamine. Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

• Rada A – positiivne kontroll
• Rada B – nõrk positiivne kontroll
• Rada C – negatiivne kontroll
• Triip D – positiivne proov (tuvastatud HIV-1 antikehad)

Kuidas analüüsi dešifreerida?

Kui ELISA näitas selle testisüsteemi kohaselt kõigi või peaaegu kõigi antigeenide vastaste antikehade olemasolu, näitab see positiivset HIV-testi. Kui vastus pärast teist seroloogilise ensüümi immuunanalüüsi on positiivne, tuleb teha immunoblot. Tema tulemuste tõlgendamine on õigem. Kui ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs andis positiivse tulemuse, siis järgmine immunoblotanalüüs näitas ka HIV esinemist, siis pannakse lõpptulemus.

Analüüside dešifreerimisel peate teadma, et positiivse HIV-testi määravad:

• 60% kuni 65% 28 päeva pärast nakatumist;
• 80% -l - 42 päeva pärast;
• 90% -l - 56 päeva pärast;
• 95% -l - 84 päeva pärast.

Kui vastus HIV-le on positiivne, tähendab see, et viirusevastased antikehad on tuvastatud. Valepositiivse vastuse vältimiseks on vaja uuesti testida, eelistatavalt kaks korda. Kui immuunpuudulikkuse antikehad tuvastatakse kahe testi läbimisel kahest või 3 testi läbimisel kahest, loetakse tulemus positiivseks.

P24 antigeeni saab verest tuvastada juba 14 päeva pärast nakatumise kuupäeva. Ensüümi immuunanalüüsi meetodit kasutades tuvastatakse see antigeen 14 kuni 56 päeva jooksul. 60 päeva pärast pole seda enam veres. Alles siis, kui organismis tekib AIDS, toimub selle p24 valgu taaskasv veres. Seetõttu kasutatakse HIV tuvastamiseks esimestel nakatumispäevadel või haiguse progresseerumise määramiseks ja raviprotsessi jälgimiseks ensüümi immuunanalüüsi testsüsteeme. Ensüümi immuunanalüüsi kõrge analüütiline tundlikkus tuvastab p24 antigeeni bioloogilises materjalis esimese alatüübi HIV puhul kontsentratsioonil 5 kuni 10 pg/ml, teise alatüübi HIV puhul kontsentratsioonil 0,5 ng/ml või vähem.

Under kahtlane ensüümi immuunanalüüsi tulemus viitab sellele, et diagnoosimisel tehti kuskil viga, reeglina ajasid meditsiinitöötajad midagi segamini või on inimesel infektsiooni tunnused ja tulemus on negatiivne, mis tekitab kahtlust, saadetakse inimene uuesti testimine.

Under valepositiivne Tulemusena mõistetakse tulemust, kui patsiendi vereanalüüsid tehti järgmistel tingimustel:

• Rasedus;
• kui inimesel on hormonaalne tasakaalutus;
• pikaajalise immunosupressiooniga.

Kuidas sel juhul analüüsi dešifreerida? Valepositiivne tulemus antakse, kui tuvastatakse vähemalt üks valk. Kuna p24 antigeen on väga sõltuv individuaalsetest variatsioonidest, tuvastatakse seda meetodit kasutades 20–30% patsientidest esimesel nakatumisperioodil.

Kui usaldusväärne on positiivne testi tulemus?

Mõnikord on ELISA-l valepositiivsed tulemused (umbes 1% juhtudest), selle tulemuse põhjuseks võib olla rasedus, mitmesugused viirusnakkused, aga ka lihtne õnnetus. Pärast positiivse tulemuse saamist on vaja täpsemat testi - immunoblot, mille tulemuste põhjal tehakse diagnoos. Positiivne immunobloti tulemus pärast positiivset ELISA tulemust on 99,9% usaldusväärne - see on iga meditsiinilise testi maksimaalne täpsus. Kui immunoblot on negatiivne, siis esimene test oli valepositiivne ja tegelikult pole inimesel HIV-d.

Mis on määramatu (kahtlane) tulemus?

Kui ELISA on positiivne või negatiivne, võib immunoblot olla positiivne, negatiivne või määramatu. Määramatu immunobloti tulemus, st. vähemalt ühe viiruse valgu olemasolu immunoblotis võib täheldada juhul, kui nakatumine on toimunud hiljuti ja veres on endiselt vähe HIV-vastaseid antikehi, sel juhul muutub immunoblot mõne aja pärast positiivseks. Samuti võib ebamäärane tulemus ilmneda HIV-nakkuse puudumisel hepatiidiga, mõnede krooniliste ainevahetushaigustega või raseduse ajal. Sel juhul muutub immunoblot negatiivseks või leitakse ebamäärase tulemuse põhjus.

Kui palju analüüs maksab?

HIV-i immunoblot ei kehti odavate uuringute puhul. Keskmiselt maksab sõeluuring ensüümi immuunanalüüsiga 500 kuni 900 rubla. Immunoblotanalüüs on kontrolluuring, mille maksumus on kolm kuni viis tuhat rubla. Keerulisemad meetodid on palju kallimad. Näiteks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi eest peate maksma umbes 12 000 rubla.

Kus analüüsi teha?

Kust saab HIV-testi teha? ELISA, immunoblotuuringud viiakse läbi linna erakliinikutes, tulemused väljastatakse päeva jooksul. Võimalik on ka kohene diagnoos. Riiklikes meditsiiniasutustes tehakse ELISA-testid ja immunoblotanalüüs vastavalt Vene Föderatsiooni õigusaktidele tasuta. Rasedad naised, samuti patsiendid, kes peavad olema haiglaravil või kellele tehakse operatsioon, peavad läbima nakkushaiguste testi.

immunoblotanalüüs -(inglise keelest "blot" - spot) - meetod antigeenide (või antikehade) tuvastamiseks tuntud seerumite (või antigeenide) abil. See on geelelektroforeesi ja ELISA kombinatsioon. Esialgu hävitatakse ultraheli abil bakterirakud või virioonid, seejärel eraldatakse elektroforeesiga kõik viiruse või bakterirakkude antigeenid ning saadakse kaubanduslik reagent spetsiaalsel nitrotsellulooskilel. Immunoblotimise seadistamisel kantakse patsiendi uuritav seerum teadaolevate antigeenidega kilele. Pärast seondumata antikehade inkubeerimist ja pesemist jätkatakse ELISA-ga – kilele kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide antiseerum ja kromogeenne substraat, mis muudab ensüümiga suhtlemisel värvi. Immunoglobuliini-ensüümi komplekside antigeen-antikeha-antiseerumi juuresolekul tekivad kandjale värvilised laigud. Immunoblotimise meetod võimaldab eraldi tuvastada patogeeni erinevate antigeenide vastaseid antikehi (näiteks HIV-nakkuse korral tuvastab immunoblotanalüüs gp120, gp24 ja teiste viiruse antigeenide vastased antikehad).

Radioimmunoanalüüs (RIA)

Meetod põhineb antigeen-antikeha reaktsioonil, kasutades antigeeni või antikeha märgist koos radionukliidiga. Märgisena kasutatakse 125I, 14C, 3H, 51Cr ja teisi radionukliide. Saadud immuunkompleksid eraldatakse süsteemist ja nende radioaktiivsus määratakse loenduritel (β-kiirgus). Kiirguse intensiivsus on otseselt võrdeline seotud antigeeni ja antikeha molekulide arvuga.

Laialdaselt kasutatakse RIA tahkefaasilist versiooni, mis kasutab märgistatud antikehi või antigeene, mis on adsorbeeritud polüstüreenpaneelide süvenditesse.

RIA-d kasutatakse mikroobide, viiruste, erinevate hormoonide, ensüümide, ravimainete, immunoglobuliinide, aga ka teiste uuritavas materjalis sisalduvate ainete tuvastamiseks väiksemates kontsentratsioonides 10–12–10–15 g/l.

Kontrollküsimused

Immuunse bakteriolüüsi reaktsioon: milline reaktsioon see on? mis on antigeen, mis on antikeha, reaktsioonimehhanism, seadistusmeetodid, praktiline rakendamine. Immuunse hemolüüsi reaktsioon: vajalikud koostisosad, seadistusviis; juhtnupud, praktiline rakendamine. Lokaalse hemolüüsi reaktsioon geelis (Yerne'i reaktsioon): reaktsiooni põhimõte, koostise meetod, praktiline rakendus. Komplemendi fikseerimise reaktsioon: reaktsiooni põhimõte; mis tekib immuunseerumi interaktsioonil spetsiifilise antigeeniga; mis juhtub täiendusega, kui see on selles interaktsioonis olemas? Milline on komplemendi saatus, kui antigeeni ja antikehade vahel puudub spetsiifiline afiinsus? Millise reaktsiooni abil saab kindlaks teha, mis komplemendiga juhtus; miks seda reaktsiooni kasutatakse; mis on RSK nähtav positiivne tulemus? Miks? Millist komplemendi omadust kasutatakse CSC esimeses faasis? Teises faasis? Kui RSK lõpptulemus on hemolüüs, kas see tähendab positiivset või negatiivset tulemust? Selgitage tulemusi: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Nimetage esimese RSK süsteemi koostisosad ja teise RSK süsteemi koostisosad. Miks on vaja testitav seerum inaktiveerida? Kuidas komplementi tiitritakse? Hemolüütiline seerum: mida see sisaldab, kuidas seda saadakse, mis on tiiter ja kuidas seda määratakse? Milliseid loomi kasutatakse RSC komponentide saamiseks? RSC külmas seadmise tehnika. Milliste järgmiste reaktsioonide etapis on vajalik komplemendi osalemine: sadestumine, flokulatsioon, aglutinatsioon, mittetäielike antikehade tuvastamine, immuunbakteriolüüs, immuunhemolüüs, Jerne, CSC? Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) – näitab sündmuste jada otseses Coonsi reaktsioonis; vajalikke koostisosi. Mis on antigeen, mis on antikeha, kuidas antikehi märgistatakse, kuidas reaktsiooni tulemust arvestatakse, milline näeb välja positiivne tulemus? Praktiline rakendus – mida saab selle reaktsiooni abil kindlaks teha? Kaudne immunofluorestsentsreaktsioon - märkige selle reaktsiooni sündmuste jada, vajalikud koostisosad, mis on antigeen, milliseid immuunseerumeid kasutatakse; praktiline kasutamine; kaudse RIF-i eelis otsese reaktsiooni ees. Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA) - reaktsiooni põhimõte; vajalikud koostisosad; näitama reaktsiooni käivitamisel sündmuste jada, et tuvastada uuritavas materjalis antigeen; vajalikud koostisosad; mis juhtub positiivse tulemusega, kuidas see välja näeb? Täpsustage ELISA toimingute järjestus, et tuvastada uuritavas seerumis olevad antikehad; vajalikud koostisosad; mis saab positiivse tulemusega? Immunoblotanalüüs - reaktsiooni põhimõte; põhietapid; vajalikud koostisosad; Kuidas tulemust arvestatakse? reaktsiooni eelised. Radioimmunoanalüüs (RIA) - millised on reaktsiooni peamised etapid; millega märgistatakse antikehi või antigeene, kuidas tulemust arvestatakse? Immunoelektronmikroskoopia - meetodi põhimõte; põhietapid; vajalikud koostisosad; Millega on antikehad märgistatud? kuidas reaktsiooni tulemust arvesse võetakse. Immobiliseerimisreaktsioonid - meetodi põhimõte, seadistamise tehnika, komponendid, tulemuste arvestamine.

Enesekoolituse käigus täidetavad ülesanded.

Selles teemas käsitletud reaktsioonide jaoks täitke immuunsusreaktsioonide tabel.

Immuunsed reaktsioonid

Õpilase tööd praktilises tunnis

Alustage kohe tööd RSC 1. etapi sõnastamisega, kuid kirjutage see hiljem märkmikusse (vt allpool).

1. Immuunse hemolüüsi reaktsioon. Vaadake immuunhemolüüsi demonstratsioonireaktsiooni, joonistage see diagrammina, selgitage tulemust katse- ja kontrollkatsutis.

2. Komplemendi sidumise reaktsioon

a) võtke RSC lahti vastavalt tabelile;

b) joonistage vihikusse tabeli kujul RSC seadistamise skeem;

c) pane RSK teine ​​faas (esimene faas pannakse tunni algusesse);

d) demonteerida RSK jaoks vajalikud diagnostilised preparaadid;

e) võtta arvesse tulemust. Sõnastage järeldus spetsiifiliste antikehade olemasolu kohta uuritavas seerumis.

3. Immunofluorestsentsreaktsioon. Uurige tabelit, koostage vihikusse reaktsiooni seadistamise skeem; vaata diagnostilisi seerumeid; määrata, mida seerum sisaldab, kuidas seda valmistatakse, milliseks reaktsiooniks (otsene või kaudne RIF) seda kasutatakse. Vaadake RIF-i demonstratsiooni tulemust fluorestsentsmikroskoobis.

4. Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA). Koostage oma märkmikus reaktsiooniskeem kahes versioonis: antigeeni tuvastamiseks uuritavas materjalis ja antikehade tuvastamiseks seerumis. Vaadake üle HIV ja B-hepatiidi diagnoosimise koostisosade komplekt. Tehke kindlaks, mida iga koostisosa sisaldab ja milleks seda kasutatakse.

5. Immunoblotanalüüs. Koostage oma märkmikusse reaktsiooni skeem; vaata demo – reaktsiooni tulemus.

6. Radioimmunoanalüüs (RIA). Joonistage oma vihikusse reaktsiooniskeem.

7. Immuunelektronmikroskoopia (IEM). Vaadake demonstratsiooni - reaktsiooni tulemust, koostage märkmikusse reaktsiooniskeem, märkige nooltega antigeen (viirus) ja märgistatud antikehad.

Immunoblotanalüüs on ülitundlik valgu tuvastamise meetod, mis põhineb elektroforeesi ja ELISA või RIA kombinatsioonil. Immunoblotimist kasutatakse HIV-nakkuse diagnostilise meetodina jne.

Üldises mõttes mõistetakse immunoblotimist kui valkude segu analüüsimist, mis on kantud tahkele tugimembraanile, millega need seostuvad kovalentsete sidemetega, millele järgneb immuuntuvastus.

Otse substraadile sadestunud valkude segu (dot blot analüüs) või pärast selle esialgset fraktsioneerimist on võimalik analüüsida elektrofokuseerimise, ketaselektroforeesi või kahemõõtmelise elektroforeesi (Western blot) abil.

Patogeeni antigeenid eraldatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga, kantakse seejärel geelilt üle aktiveeritud paberile või nitrotselluloosmembraanile ja arendatakse ELISA abil.

Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega". Nendele ribadele kantakse patsiendi seerum. . Seejärel, pärast inkubeerimist, pestakse patsient patsiendi sidumata antikehadest ja kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastane seerum. . Ribale moodustunud kompleks (antigeen + patsiendi antikeha + inimese Ig vastane antikeha) tuvastatakse kromogeense substraadi lisamisega, mis muudab ensüümi toimel värvi.

Seda metoodikat rakendatakse ka bakterite, faagide või viiruste kloonide valikul, mis ekspresseerivad kloonitud sihtgeenide tooteid.

Valkude ülekandmine membraanile toimub kas passiivselt või kasutades elektrotransferaparaati. Valkude membraanile ülekandmise efektiivsust mõjutavad paljud tegurid, nagu valkude molekulmass, geeli poorsus, ülekandeaeg ja kasutatava puhverlahuse (transpuhvri) koostis.

Sõltuvalt katse ülesannetest ja tingimustest valitakse parimaid tulemusi andvad ülekandetingimused. Tavaliselt kasutatavad substraadid on nitrotselluloos, polüvinülideendifluoriid (PVDF) või positiivselt laetud nailonmembraanid. Nitrotselluloos suudab siduda kuni 80-100 mikrogrammi valku 1 cm2 kohta.

Madala molekulmassiga valgud (molekulmassiga alla 20 kDa) võivad pesude tagajärjel kaduda, mis võimaldab eelnevalt uurida teatud geneetiliste lookuste polümorfismi vastavate restriktsiooni-DNA fragmentide pikkuste järgi.

Lisaks on Southern hübridisatsiooni abil lihtne välja selgitada, kas sihtgeeni siseosas on teatud restriktsiooniensüümi poolt hüdrolüüsi koht, mis võimaldab valida optimaalse strateegia uuritava genoomi piirkonna kloonimiseks.

Sarnase skeemi järgi saab agaroosgeelist nitrotselluloosfiltrile üle kanda ka RNA molekule. Seda meetodit on kutsutud Northern blotting'iks, mitte Southern blotting'iks, kuna perekonnanimi Southern tähendab inglise keeles "southern".

Valgugeelist filtritele ülekandmist nimetati vastavalt Western blot analüüsiks. Suured valgud (üle 100 kDa), mis on denatureeritud naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahuses, võivad membraanile halvasti kanduda, kui transpuhvris on etanool. Alkohol parandab oluliselt valkude ülekandumist SDS-polüakrüülamiidgeelist, kuid ahendab poore geelis, mis viib suurte valkude säilimiseni.

PVDF membraan on optimeeritud immuuntuvastuseks ja suudab säilitada spetsiifiliselt seotud valke kuni 160 µg/cm2 väga madala mittespetsiifilise seondumise tasemega.

Immunoblotanalüüs

Selle membraani oluline omadus on selle korduva kasutamise võimalus. Zeta-Probe nailonmembraanid seovad tõhusalt SDS-valke ilma alkoholita ja see seondumine on järgnevate töötluste suhtes vastupidav. Tõhusalt säilivad ka madala molekulmassiga valgud. Zeta-Probe membraanid võimaldavad suure seondumisvõimega, ligikaudu 480 μg valku 1 cm2 kohta, tuvastada analüüsisegudes valgu jälgi.

Pärast antigeeni immobiliseerimist membraanile blokeeritakse ülejäänud seondumiskohad želatiini või veise seerumi albumiini või kooritud piima lahustega.

Seejärel inkubeeritakse membraani testitud antigeeni vastaste polüklonaalsete või monoklonaalsete antikehade lahuses. Pärast seondumata antikehade mahapesemist inkubeeritakse membraani sekundaarsete antikehade lahuses, mis on leeliselise fosfataasi ensüümide (leeliseline fosfataas, AP) või mädarõika peroksidaasi (HRP) konjugaat liigivastaste antikehadega (kitse antikehad küüliku, hiire või hiire vastu). inimese immunoglobuliinid) või valgud A (Staphylococcus aureus valk) või G (Streptococcus sp. valk), millel on kõrge afiinsus immunoglobuliinide Fc piirkonna suhtes.

Moodustunud immuunkomplekside tuvastamine toimub keemilise või kemoluminestsentsmeetodiga. Aluselise fosfataasi konjugaatide kasutamisel keemiliste reaktsioonide substraadid on 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat (BCIP) või tetrasooliumsinine (NBT) ning mädarõika peroksidaasi konjugaatide kasutamisel - 4-kloro-1-naftool ja vesinikperoksiid.

Ensümaatiliste reaktsioonide tulemusena moodustub membraanile antigeen-antikeha kompleksi lokaliseerimise kohas värviline riba või laik.

Selle meetodi tundlikkus on AP konjugaatide kasutamisel 100 pg valku ja HRP konjugaate kasutades 100-500 pg. Immuunkomplekside kemiluminestseeruv tuvastamine võimaldab tuvastada vähem kui 5 pg antigeeni. Selle meetodi põhimõte seisneb selles, et kui HRP reageerib vesinikperoksiidi ja tsüklilise diatsüülhüdrasiinluminooliga, kiirgatakse valgust lainepikkusel 428 nm, mida saab salvestada valgustundlikule filmile.

Immunoblot-reaktsioon (RI) töötati välja ELISA põhjal. See on kõige spetsiifilisem ja tundlikum immunokeemilise analüüsi meetod. Immunoblotanalüüs (inglise keelest blot - saada märjaks, spot) ühendab ELISA ja elektroforeesi. Seda kasutatakse mitte HIV-vastaste komplekssete antikehade, vaid selle üksikute struktuurvalkude (valgud-p24, glükoproteiinid-gp120, gp41 jne) tuvastamiseks. HIV-nakkuse diagnoosimiseks vaadake ekspertide (kinnitavaid) reaktsioone.

Reaktsioon viiakse läbi mitmes etapis:

Viirus hävitatakse komponentideks - antigeenideks (p24, gp120, gp 41 jne), mis allutatakse elektroforeesile polüakrüülamiidgeelis, see tähendab antigeenide eraldamist fraktsioonideks molekulmassi järgi.

2. Geel kaetakse nitrotselluloosmembraaniga ja antigeenifraktsioonid kantakse sellele elektroforeesi abil. Nitrotselluloos käitub nagu kuivatuspaber. Membraan lõigatakse ribadeks (ribadeks). Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega".

Immunoblotanalüüs - täiendav kaudne meetod

Sellele kantud HIV-antigeenidega ribad kastetakse katsealuse seerumis ja seejärel pestakse seondumata materjalist.

4. Ribasid inkubeeritakse peroksidaasiga märgistatud antiglobuliini seerumiga ja pestakse.

Lisatakse substraat ja märgitakse värviliste fraktsioonide (laikude) arv, mis vastavad AG-AT kompleksi lokaliseerimise tsoonile.

Triipude olemasolu riba teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis. Immunoblotanalüüsi tulemus loetakse positiivseks, kui membraanil on nähtavad triibud, mis vastavad mis tahes kahele kolmest HIV antigeenist - p24, gp41 ja gp 120 (joonis 37).

JOONISED

KASUTATUD KIRJANDUSE LOETELU

Peamine kirjandus

Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: õpik arstitudengitele. ülikoolid 2. väljaanne, parandatud. ja täiendav — 702 lk. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: laboriuuringute juhend: õppejuhend / (V.B. Sboychakov et al.); toim. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 lk.: ill.

3. Meditsiiniline mikrobioloogia, immunoloogia ja viroloogia [Elektrooniline ressurss]: mee õpik.

ülikoolid - 760 p. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Peterburi: Spetslit, 2010.

4. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites / V. 1. - 448 lk. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Media, 2010. .

5. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites Vol. 2. - 480 lk. Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Media, 2010.

lisakirjandust

1. Immunodiagnostilised reaktsioonid: õpik / koostanud: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtarieva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Venemaa tervishoiuministeeriumi GBOU VPO BSMU kirjastus, 2016. - 86lk.

2. Mõnede omaduste tunnused, mis määravad Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bakterite kaaskultiveeritud variatsioonide patogeense potentsiaali: teaduslik väljaanne / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Avaleht » Immunoblot – mis see on? Immunoblot nakkushaiguste diagnoosimisel

Immunoblot - mis see on? Immunoblot nakkushaiguste diagnoosimisel

Mis on immunoblot? See on levinud meetod inimese viirusnakkuste laboratoorseks diagnoosimiseks. See on üks täpsemaid ja usaldusväärsemaid viise HIV-nakkuse tuvastamiseks.

Usaldusväärsuse huvides on see isegi suurem kui ensüümiga seotud immunosorbent (elisa) test. Immunobloti tulemusi peetakse lõplikuks ja veenvaks.Üldteave

Immunoblot - mis see on? Inimese HIV-positiivseks tunnistamiseks peate läbima laboriuuringu, et määrata antikehade olemasolu vereseerumis.

Western blot lõikude meetodit nimetatakse ka Western blot'iks (western blot). Seda kasutatakse täiendava ekspertmeetodina inimese viirusnakkuste tuvastamiseks. See on vajalik ELISA kinnitamiseks - laborianalüüs, mis võimaldab teil määrata HIV-i antikehade olemasolu veres. Immunoblot kontrollige uuesti positiivset ELISA-d.

Seda peetakse kõige tundlikumaks, keerukamaks ja kallimaks.

Sihtmärk

Mis on immunoblot? See meetod vereseerumi laboratoorseks testimiseks viirusevastaste antikehade tuvastamiseks.

Geeli ja nitrotselluloosmembraanide viiruse üldvalkude eriuuringute käigus.

Immunoblotanalüüs (antikehade tuvastamine patsientide seerumis teatud patogeeni antigeenide suhtes)

Western blot sektsiooni protseduur on ette nähtud HIV-nakkuse määramiseks erinevates etappides. Esimeses etapis allutatakse selle koostisosadest puhastatud viirusele elektroforees ja selles sisalduvad antigeenid jagatakse molekulmassiga.

Inimese immuunpuudulikkuse viirus replitseerub elusrakkudes, mis on sisestatud tema geneetilisse teabesse. Selles etapis saab inimene HI-viiruse kandjaks, kui olete nakatunud.

Selle haiguse eripära on see, et see ei avaldu pikka aega. Viirus hävitab lümfotsüüte, mistõttu inimese immuunsus langeb ja organism ei suuda infektsioonidega võidelda.

Kui HIV-i ravitakse õigesti ja õigeaegselt, elab patsient küpse vanaduseni. Ravi puudumine viib paratamatult surmani. Alates nakatumise hetkest, kuid ilma ravita, ei ole maksimaalne periood üle kümne aasta.

Iseärasused

Immunoblotanalüüs on usaldusväärne meetod, mis võimaldab teil määrata esimest ja teist tüüpi HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu.

Kui inimene on nakatunud, siis pärast kahenädalast antikehade tekkimist, mida saab tuvastada palju hiljem. HIV-i eripäraks on see, et antikehade hulk suureneb kiiresti ja jääb patsiendi verre. Isegi kui need on olemas, ei pruugi haigus avalduda kahe või enama aasta jooksul. ELISA meetod ei näita alati täpselt haiguse esinemist, mistõttu on vaja kinnitada PCR-i ja Western blot sektsioonide tulemused, kui ensüümi immuunanalüüs näitas positiivset tulemust.

Näidustused

Milline “immunoblot” on juba välja selgitatud, kuid mida uuringus tutvustatakse?

Inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) immunobloti testimise põhjus on positiivne ELISA tulemus. Patsientidel, kellel on ees operatsioon, on vaja läbida ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs. Lisaks peaksite analüüsima naisi, kes plaanivad rasedust, samuti neid, kes on lootusetud. Kui elisa tulemused on küsitavad, antakse HIV-nakkusega patsientidele Western blot lõigud.

Arsti juurde mineku põhjuseks võivad olla järgmised murettekitavad sümptomid: kiire kaalulangus, nõrkus, töövõime langus, soolehäired (kõhulahtisus), mis kestavad kolm nädalat, vedelikupuudus, palavik, lümfisõlmede turse kehas, kandidoosi teke. tuberkuloos, kopsupõletik, toksoplasmoos, herpese ägenemine.

Patsient ei pea enne veenivere loovutamist valmistuma.

Ärge sööge 8-10 tundi enne analüüsi. Ei ole soovitatav juua alkoholi ja kohvijooke, teha raskeid füüsilisi harjutusi, kogeda elevust päev enne vereloovutamist.

Kus analüüsi teha?

Kust saab HIV-testi teha?

Linna erakliinikutes läbiviidav immunoblotanalüüs ELISA annab tulemuse ühe päevaga. Võimalik on ka kohene diagnoos. Avalikes asutustes on Elisa meditsiinilised testid ja Western blot sektsioonid vastavalt Vene Föderatsiooni õigusaktidele tasuta.

Rasedate naiste ning haiglaravi või operatsiooni vajavate patsientide nakkushaiguste kohustuslik sõeluuring Kuidas seda uuringut läbi viiakse?

Kuidas ELISA-d läbi viia? Immunoblot positiivne/negatiivne kinnitab või lükkab ümber elisa tulemused. Protseduur on üsna lihtne. Spetsialist võtab venoosset verd, ajaliselt kulub alla viie minuti.

Pärast proovi võtmist tuleb süstekoht desinfitseerida ja sulgeda plaastriga. Proovide võtmine toimub tühja kõhuga, nii et pärast protseduuri ei tee paha süüa tahvel tumedat šokolaadi või magusat kuuma jooki.

Tasuta analüüsi saatekirja saamiseks riiklikku raviasutusse tuleb külastada terapeudi.

Üldiselt ei erine immunoblot teistest proovide võtmisega tehtud vereanalüüsidest. Uurimismetoodika on lihtne. Kui viirus on inimese veres, hakkab organism selle hävitamiseks tootma antikehi. Iga viiruse jaoks on palju valgu antigeene. Nende antikehade tuvastamine on Western blot jaotusmeetodi aluseks. Hind

Kui palju analüüsi? Immunoblot HIV viitab odavatele uuringutele.

Keskmiselt on sõelumise immuunanalüüsi meetodid vahemikus 500 kuni 900 rubla. Western blot sektsioonid on uuringukontroll, mille maksumus on vahemikus kolm kuni viis tuhat rubla. Keerulisemad meetodid on palju kallimad. Näiteks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi eest peate maksma umbes 12 000 rubla.

Tulemuste tõlgendamine

Kõige tavalisemad HIV-nakkuse diagnoosimise meetodid on ensüümi immunoanalüüs ja immunoblot.

Need on ette nähtud inimese immuunpuudulikkuse viiruse vastaste seerumi antikehade määramiseks. Nakatumist kinnitavad tavaliselt kaks testi: sõeluuring ja kinnitav. Tulemuste tõlgendamise peaks tegema arst, ta paneb diagnoosi ja määrab ravi. Kui immunoblot on positiivne, tähendab see, et inimkehas on viirus.

Positiivne tulemus ei tohiks olla eneseravi põhjuseks, kuna igal patsiendil võib olla haigusest oma pilt.

Kvalitatiivne analüüs hõlmab sõeluuringut ja sertifitseerimist. Kui patsiendil viirust ei ole, on tulemus "negatiivne". Kui see sertifikaat leitakse, viiakse läbi täiendavad sõeluuringud. Immunoblotanalüüs, mis kinnitab või lükkab ümber sõeluuringu. Kui testribad ilmuvad teatud piirkondade tumenemisel (valgu lokaliseerimine), on diagnoos "HIV".

Kui tulemused on kahtlased, tehakse testid kolme kuu jooksul.

Inimese immuunpuudulikkuse viirusega nakatumise vältimiseks on see võimalik, kui järgite teatud reegleid: vältige juhuslikku seksuaalset kontakti, kasutage kontakti ajal kondoome, ärge kasutage ravimeid.

Kui haigus avastatakse rasedal naisel, on oluline järgida raviarsti soovitusi, ärge unustage viiruse esinemise teste.

Mis on Western Blotting?

Valkude tuvastamine mitmesuguste kudede keerukates segudes või ekstraktides on üks sageli esinevaid probleeme. Kasutades sellist tööriista spetsiifiliste antikehadena, on võimalik määrata uuritav valk minimaalse aja- ja rahakuluga.

Western blot meetodi puhul eraldatakse valkude segu esimeses etapis naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul elektroforeesiga, seejärel kantakse elektroblotanalüüsiga nitrotselluloosmembraanile.

Selle meetodi olemus seisneb selles, et geel pärast elektroforeesi asetatakse filterpaberi kihtide vahele nitrotselluloosmembraanile. Sel viisil kokkupandud "võileib" asetatakse elektrivälja, nii et valgu-SDS kompleksid liiguvad üle geelplaadi ja immobiliseeritakse (mittespetsiifilise sorptsiooni tulemusena) nitrotselluloosmembraani pinnale.

Valk-SDS kompleksi seondumisel nitrotselluloosmembraaniga osalevad peamiselt elektrilised jõud ning see interaktsioon on mitmepunktiline ja viib valkude "levitamiseni" membraani pinnal. Seega saame pärast elektriülekannet geeli koopia nitrotselluloosil, mille valgud on paigutatud samamoodi nagu polüakrüülamiidgeelis.

Pärast SDS-i – valkude elektroforeesi, elektroülekannet ja sorptsiooni geelist nitrotselluloosmembraanile muutub valgu tertsiaarne konformatsioon oluliselt, kui üldiselt on õige rääkida valgu tertsiaarsest struktuurist pärast nii karmi töötlemist. . Seetõttu kasutatakse uuritava valgu immunokeemiliseks tuvastamiseks tavaliselt ainult valgu molekuli lineaarsetele piirkondadele spetsiifilisi mono- või polüklonaalseid antikehi.

51. Ensüümide immunoanalüüs, immunoblotanalüüs. Mehhanism, komponendid, rakendus.

Konformatsiooniliste epitoopide (või alaühikutevahelisi kontakte hõlmavate saitide) suhtes spetsiifilised antikehad ei sobi üldiselt Western blot meetodi kasutamiseks.

Pärast valgu ülekandmist inkubeeritakse membraani järjestikku uuritava valgu suhtes spetsiifiliste antikehadega ja seejärel primaarsete antikehade Fc-fragmentide suhtes spetsiifiliste sekundaarsete antikehadega, mis on konjugeeritud ensüümi (või mõne muu) märgisega (joonis fig.

1 A). Juhul, kui uuritava antigeeni suhtes spetsiifilised primaarsed antikehad on otseselt konjugeeritud märgisega, ei ole sekundaarsed antikehad vajalikud (joonis 1 B). Uuritud valgu lokaliseerimise kohas moodustunud immuunkompleksid "avaldatakse" kromogeense substraadi abil (olenevalt märgistuse tüübist).

Meetodi tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad suuresti sellest, milliseid antikehi uuringus kasutatakse.

Kasutatavad antikehad peavad olema spetsiifilised ainulaadse aminohappejärjestuse suhtes, mis on spetsiifiline ainult uuritava valgu suhtes. Vastasel juhul on võimalik antikehade interaktsioon (eriti jämedavalgu ekstraktide puhul) mitme valgu molekuliga, mis omakorda toob kaasa mitmete värviliste ribade ilmumise membraanile.

Sel juhul on uuritava valgu tuvastamine sageli keeruline või isegi võimatu.

Teine oluline tegur, mida antikehade valimisel silmas pidada, on afiinsus. Mida suurem on kasutatavate antikehade afiinsus, seda heledamalt ja selgemalt valguribad värvuvad, seda suurem on meetodi tundlikkus. Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on võimalik saavutada tundlikkus 1 ng ja isegi suurem.

Membraaniga seotud antigeeni ja antikehade interaktsiooni tulemuse visualiseerimiseks kasutatakse sekundaarseid antikehi, mis on konjugeeritud ainetega, mis on võimelised teatud tingimustel teatud signaali andma.

Tavaliselt kasutatakse sellise ainena ensüümi (peroksüdaasi või fosfataasi), mille reaktsiooniprodukt on värvunud ja sadestub membraanile lahustumatu sademena.

Selle meetodi puhul on võimalik kasutada ka fluorestseeruvaid märgiseid.

Riis. 1. Uuritava valgu immunokeemilise värvimise skeem: A - ensüümmärgisega konjugeeritud sekundaarsete antikehade kasutamine; B - primaarne antikeha on otseselt konjugeeritud ensüümi märgisega.

Protokoll:

I. Geeli ja membraani valmistamine ning valgu elektrotransfer

Polüakrüülamiidgeel pandi pärast elektroforeesi vanni koos blotpuhvriga (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiin, 10% etanool).

Kaks lehte filterpaberit, mis on lõigatud bloteerimiskasseti kuju järgi ja niisutatud bloteerimispuhvriga, asetatakse kasseti anoodi poole jäävale osale. Seejärel asetatakse filterpaberile sama puhvriga eelnevalt niisutatud nitrotselluloosmembraan, jälgides, et membraani ja paberi vahele ei jääks õhumulle.

Pärast seda tuleb geel hoolikalt membraanile asetada, pöörates taas erilist tähelepanu õhumullide puudumisele geeli ja membraani vahel. Võileiva lõpetavad kaks kihti niisutatud filterpaberit, mis asetatakse geeli pinnale (joonis 2). Saadud võileib kinnitatakse klambriga kassetti ja asetatakse elektroodide vahele nii, et membraan on anoodi poole.

Riis. 2. Valkude elektriülekande skeem membraanile.

II. elektriülekanne

Valkude elektrotransfer nitrotselluloosmembraanile viiakse läbi puhvris, mis sisaldab 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiini, 10% etanooli 30–50 minuti jooksul konstantsel pingel 100 V.

Elektrotransfer aeg sõltub ülekantavate valkude suurusest, mida suurem on valk, seda kauem võtab elektriülekanne aega. Elektrotranspordi kvaliteeti ja valguribade paigutust hinnati nitrotselluloosmembraani värvimisega 0,3% Ponceau S-ga 1% äädikhappes. Enne immunovärvimist tuleb membraani mitu korda pesta kergelt leeliselise Tris-i vesilahusega, et eemaldada valkudega seotud värvaine.

III. Nitrotselluloosmembraanile immobiliseeritud valkude immunokeemiline värvimine

Mittespetsiifiliste antikehade seondumiskohtade blokeerimiseks inkubeeritakse membraani pidevalt segades toatemperatuuril 30 minutit PBST-s (parema blokeerimise jaoks võib kasutada 10% lõssipulbrit sisaldavat PBST lahust).

Pärast blokeerimist inkubeeritakse membraani üks tund toatemperatuuril pidevalt segades PBST-s, mis sisaldab 1-10 μg/ml spetsiifilisi antikehi.

Antikehade optimaalne kontsentratsioon valitakse empiiriliselt ja see sõltub antikehade interaktsiooni afiinsusest antigeeniga.

Inkubeerimise lõpus pesti membraani 5 korda PBST-ga ja viidi üle mädarõika peroksüdaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehade lahusesse. Konjugaadi lahjenduse märgib tavaliselt pakendil tootja või valib selle empiiriliselt uurija. Inkubeerige membraani sekundaarsete antikehade lahuses 1 tund pidevalt segades.

Pärast põhjalikku pesemist (vähemalt 5-6 puhvri vahetust) viiakse PBST membraan kromogeensesse substraadi lahusesse, mis sisaldab 3 mg diaminobensidiini (DAB) ja 10 µl 30% vesinikperoksiidi 10 ml 0,1 M Tris-HCl-s, pH 7,6. .

Inkubeerimine viiakse läbi segades 5 kuni 10 minutit. Pärast substraadiga inkubeerimise lõppu tuleb membraani pesta PBST-ga, kuivatada filterpaberiga blottinguga ja teha koheselt värvilise skaneerimisega elektrooniline koopia. Kui membraan kuivab täielikult, tuhmuvad värvitud valgutriibud ning pilt on vähem hele ja kontrastne.

Märkus: DAB on mürgine ja potentsiaalne kantserogeen. Töötage ainult kummikinnastega!

Kirjeldus

Määramise meetod Immunoblot.

Uuritav materjal Seerum

Võimalik kodukülastus

Antinukleaarsed antikehad on autoantikehade perekond, mis seondub ribonukleiinhapete ja nendega seotud valkudega. Neid esineb enam kui 90% -l difuusse sidekoehaigusega patsientidest ning sageli täheldatakse neid ka autoimmuunsete maksahaiguste ja mitmete muude seisundite korral. Praeguseks on selle autoantikehade perekonna iseloomustatud umbes 200 sorti, kuid kõiki neist ei saa kliinilises praktikas kasutada.

Tuumavastaste antikehade immunoblot võimaldab ühe testiga üheaegselt uurida 15 põhitüüpi antinukleaarseid antikehi, mis tagab peamiste süsteemsete reumaatiliste haiguste diferentsiaaldiagnoosi. Iga immunoblotiga tuvastatud autoantikeha tüüpi täheldatakse tavaliselt iseloomuliku kliinilise pildiga patsientidel, seega võimaldab autoantikehade spekter mitte ainult haigust diagnoosida, vaid ka kindlaks teha teatud kliiniliste ilmingute tekkimise riski.

Tuumavastaste antikehade immunoblotanalüüsi on soovitatav kasutada seroloogilise uuringu teises etapis, kui teiste testide positiivne tulemus näitab tuumavastaste antikehade olemasolu katsealuse seerumis. Need testid hõlmavad antinukleaarsete antikehade määramist (ELISA sõeluuring), tuumavastase faktori (ANF) tuvastamist Hep2 rakkudel (), tuumavastaste antikehade ja ekstraheeritava tuumaantigeeni (ENA) vastaste antikehade määramist.

Tuumavastaste antikehade immunoblotmeetodit süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimisel iseloomustab kõrge kliiniline spetsiifilisus. Kuid tuumavastaste antikehade spetsiifilisust, isegi kõrgete ANF-i () tiitrite korral, ei ole alati võimalik kindlaks teha, kuna mitmed tuumavastased antikehade antigeenid jäävad endiselt iseloomustamata. Negatiivne immunobloti tulemus ei välista sel juhul süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimist. Immunobloti - müosiidispetsiifiliste autoantikehade paneeli () ja immunobloti - sklerodermia (sklerodermia) autoantikehade paneeli abil saab tuvastada mitmeid antinukleaarseid antikehi.

Kirjandus

1. Lapin S.V. Totolyan A.A. Autoimmuunhaiguste immunoloogiline laboridiagnostika / Kirjastus "Chelovek", Peterburi - 2010. 272 ​​lk.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. Kaasaegsed standardid reumaatiliste haiguste laboratoorseks diagnoosimiseks. Kliinilised juhised / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden - 2011. 300 lk.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden - 2007. 300 lk.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science - 2006. 862 lk.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press - 2008. 598 lk.
7. Reaktiivikomplekti juhised.

Ettevalmistus

Eelistatav on vastu pidada 4 tundi pärast viimast söögikorda, kohustuslikke nõudeid pole.

Näidustused kohtumiseks

Uuring on näidustatud järgmiste seisundite diagnoosimiseks ja diferentsiaaldiagnoosimiseks:

• süsteemne erütematoosluupus;
• alaäge nahaluupus ja muud tüüpi nahaluupus;
• segatud sidekoehaigus;
• Sjögreni sündroom ja sellega seotud haigused;
• difuusne ja lokaalne skleroderma, CREST sündroom;
• põletikulised müopaatiad (polümüosiit ja dermatomüosiit);
• juveniilne krooniline artriit;
• autoimmuunne hepatiit;
• primaarne biliaarne tsirroos ja skleroseeriv kolangiit;
• selle testi kasutamine on näidustatud antinukleaarse faktori, tuumavastaste antikehade, ekstraheeritava tuumaantigeeni vastaste antikehade, DNA-vastaste antikehade, nukleosoomivastaste antikehade ja fosfolipiidvastaste antikehade kõrgete tiitrite tuvastamiseks.

Tulemuste tõlgendamine

Testitulemuste tõlgendus sisaldab teavet raviarsti jaoks ega ole diagnoos. Selles jaotises olevat teavet ei tohiks kasutada enesediagnostikaks ega eneseraviks. Täpse diagnoosi paneb arst, kasutades nii selle uuringu tulemusi kui ka vajalikku teavet muudest allikatest: ajalugu, teiste uuringute tulemused jne.

Mõõtühikud: kvalitatiivne test, tulemus esitatakse kujul "tuvastatud" või "ei leitud".

Kui tuvastatakse mis tahes tüüpi antikeha olemasolu iseloomustav riba, kirjeldatakse riba värvi intensiivsust lisaks plusside ("ristide") arvuga iga tuvastatud antikehatüübi puhul. Positiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust.

Võrdlusväärtused: Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, histooni, nukleosoomi antikehad , Rib P, AMA-M2, Jo-1 ei leitud.

Autoantikehade määramise tulemus on esitatud iga vastava antigeeni "ristidena". Seropositiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust. Seropositiivsuse skoori valikud on loetletud allpool:

1. Antikehi ei leitud.
2. +/- - piiripealne tulemus;
3. + - spetsiifilise antigeeni vastaste autoantikehade vähene sisaldus;
4. ++ on konkreetse antigeeni vastaste autoantikehade keskmine sisaldus;
5. +++ - kõrge autoantikehade sisaldus konkreetsele antigeenile.

Peamised tuumavastaste antikehade tuvastamisega seotud haigused:

Vastavalt WHO soovitusele kasutatakse HIV-nakkuse diagnoosimisel täiendava ekspertmeetodina immunoblotimist (western blot), mis peaks kinnitama ELISA tulemusi. Seda meetodit kasutatakse tavaliselt positiivse ELISA tulemuse kahekordseks kontrollimiseks, kuna seda peetakse tundlikumaks ja spetsiifilisemaks, kuigi keerulisemaks ja kallimaks.

Immunoblotanalüüs ühendab ensüümi immuunanalüüsi (ELISA) viirusvalkude eelneva elektroforeetilise eraldamisega geelis ja nende ülekandmisega nitrotselluloosmembraanile. Immunoblot-protseduur koosneb mitmest etapist (joonis 27). Esiteks, eelnevalt puhastatud ja selle koostisosadeni hävitatud HIV allutatakse elektroforeesile, samal ajal kui kõik viiruse moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel viiakse antigeenid blotimise teel geelilt üle nitrotselluloosi ribale või nailonfiltrile, mis sisaldavad nüüd HIV-le iseloomulikku, silmale nähtamatut valkude spektrit. Järgmisena kantakse ribale uuritav materjal (patsiendi seerum, plasma jne) ja kui proovis on spetsiifilisi antikehi, seostuvad need neile rangelt vastavate antigeenvalkude ribadega. Järgnevate manipulatsioonide (nagu ELISA) tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks. Triipude olemasolu riba teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Immunoblotimist kasutatakse kõige sagedamini HIV-nakkuse diagnoosi kinnitamiseks. WHO peab seerumit positiivseks, kui immunoblotanalüüsiga tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV ümbrise valgu vastu. Nende soovituste kohaselt, kui tekib reaktsioon ainult ühe ümbrisvalguga (