Kuidas tehakse HIV-i immunoblotti. Immunoblotimine (antikehade tuvastamine patogeeni teatud antigeenide suhtes patsientide seerumis). HIV-nakkuse diagnoosimine vastsündinutel

Kirjeldus

Määramise meetod Immunoblot.

Uuritav materjal Seerum

Võimalik kodukülastus

Antinukleaarsed antikehad on autoantikehade perekond, mis seondub ribonukleiinhapete ja nendega seotud valkudega. Neid esineb rohkem kui 90% -l difuusse sidekoehaigusega patsientidest ning sageli täheldatakse neid ka autoimmuunsete maksahaiguste ja mitmete muude seisundite korral. Praeguseks on selle autoantikehade perekonna iseloomustatud umbes 200 sorti, kuid kõiki neist ei saa kliinilises praktikas kasutada.

Antinukleaarsete antikehade immunoblot võimaldab ühe testiga üheaegselt uurida 15 põhitüüpi antinukleaarseid antikehi, mis tagab peamiste süsteemsete reumaatiliste haiguste diferentsiaaldiagnoosi. Iga immunoblotiga tuvastatud autoantikeha tüüpi täheldatakse tavaliselt iseloomuliku kliinilise pildiga patsientidel, seega võimaldab autoantikehade spekter mitte ainult haigust diagnoosida, vaid ka kindlaks teha teatud kliiniliste ilmingute tekkimise riski.

Tuumavastaste antikehade immunoblotanalüüsi on soovitatav kasutada seroloogilise uuringu teises etapis, kui teiste testide positiivne tulemus näitab tuumavastaste antikehade olemasolu katsealuse seerumis. Need testid hõlmavad antinukleaarsete antikehade määramist (ELISA sõeluuring), tuumavastase faktori (ANF) tuvastamist Hep2 rakkudel (), tuumavastaste antikehade ja ekstraheeritava tuumaantigeeni (ENA) vastaste antikehade määramist.

Tuumavastaste antikehade immunoblotmeetodit süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimisel iseloomustab kõrge kliiniline spetsiifilisus. Kuid tuumavastaste antikehade spetsiifilisust, isegi kõrgete ANF-i () tiitrite korral, ei ole alati võimalik kindlaks teha, kuna mitmed tuumavastased antikehade antigeenid jäävad endiselt iseloomustamata. Negatiivne immunobloti tulemus ei välista sel juhul süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimist. Immunobloti - müosiidispetsiifiliste autoantikehade paneeli () ja immunobloti - sklerodermia (sklerodermia) autoantikehade paneeli abil saab tuvastada mitmeid antinukleaarseid antikehi.

Kirjandus

1. Lapin S.V. Totolyan A.A. Autoimmuunhaiguste immunoloogiline laboridiagnostika / Kirjastus "Chelovek", Peterburi - 2010. 272 ​​lk.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. Kaasaegsed standardid reumaatiliste haiguste laboratoorseks diagnoosimiseks. Kliinilised juhised / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden - 2011. 300 lk.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden - 2007. 300 lk.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science - 2006. 862 lk.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press - 2008. 598 lk.
7. Reaktiivikomplekti juhised.

Ettevalmistus

Eelistatav on vastu pidada 4 tundi pärast viimast söögikorda, kohustuslikke nõudeid pole.

Näidustused kohtumiseks

Uuring on näidustatud järgmiste seisundite diagnoosimiseks ja diferentsiaaldiagnoosimiseks:

• süsteemne erütematoosluupus;
• alaäge nahaluupus ja muud tüüpi nahaluupus;
• segatud sidekoehaigus;
• Sjögreni sündroom ja sellega seotud haigused;
• difuusne ja lokaalne skleroderma, CREST sündroom;
• põletikulised müopaatiad (polümüosiit ja dermatomüosiit);
• juveniilne krooniline artriit;
• autoimmuunne hepatiit;
• primaarne biliaarne tsirroos ja skleroseeriv kolangiit;
• selle testi kasutamine on näidustatud antinukleaarse faktori, tuumavastaste antikehade, ekstraheeritava tuumaantigeeni vastaste antikehade, DNA-vastaste antikehade, nukleosoomivastaste antikehade ja fosfolipiidvastaste antikehade kõrgete tiitrite tuvastamiseks.

Tulemuste tõlgendamine

Testitulemuste tõlgendus sisaldab teavet raviarsti jaoks ega ole diagnoos. Selles jaotises olevat teavet ei tohiks kasutada enesediagnostikaks ega eneseraviks. Täpse diagnoosi paneb arst, kasutades nii selle uuringu tulemusi kui ka vajalikku teavet muudest allikatest: ajalugu, teiste uuringute tulemused jne.

Mõõtühikud: kvalitatiivne test, tulemus esitatakse kujul "tuvastatud" või "ei leitud".

Kui tuvastatakse mis tahes tüüpi antikeha olemasolu iseloomustav riba, kirjeldatakse riba värvi intensiivsust lisaks plusside ("ristide") arvuga iga tuvastatud antikehatüübi puhul. Positiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust.

Võrdlusväärtused: Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, histooni, nukleosoomi antikehad , Rib P, AMA-M2, Jo-1 ei leitud.

Autoantikehade määramise tulemus on esitatud iga vastava antigeeni "ristidena". Seropositiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust. Seropositiivsuse skoori valikud on loetletud allpool:

1. Antikehi ei leitud.
2. +/- - piiripealne tulemus;
3. + - spetsiifilise antigeeni vastaste autoantikehade vähene sisaldus;
4. ++ on konkreetse antigeeni vastaste autoantikehade keskmine sisaldus;
5. +++ - kõrge autoantikehade sisaldus konkreetsele antigeenile.

Peamised tuumavastaste antikehade tuvastamisega seotud haigused:

Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA)

Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA) viiakse läbi kahes etapis: esimene on antikehade interaktsioon antigeeniga, teine ​​on antigeen-antikeha kompleksi ensümaatiline näit reaktsioonisegu värvumise ilmnemise tõttu ja värvumise registreerimine visuaalselt või spektrofotomeetrilise meetodiga.

ELISA-l on kaks varianti: tahkefaasiline ja vedelfaas, mis erinevad immunokeemilise reaktsiooni komponentide eraldamise viisi poolest. Võrreldes eelnevalt kirjeldatud antigeenide ja antikehade tuvastamise meetoditega, on ELISA-l olulisi eeliseid:

kõrge tundlikkus, mis võimaldab määrata kuni 0,05 ng / ml ainet;

katsematerjali minimaalsete koguste (1--2 µl) kasutamise võimalus;

reaktsiooni instrumentaalse või visuaalse arvestuse võimalus;

kiirus ja võimalus automatiseerida kõik reaktsiooni etapid.

ELISA-d kasutatakse praegu praktikas laialdaselt paljude bakteriaalsete, seente etioloogiaga nakkushaiguste, algloomade infektsioonide ja helmintiaaside, kuid eriti viirusnakkuste, eriti A-, B-, C-, D-, E-, G-hepatiidi, HIV-nakkuse, herpesviiruse, rotaviirus, adenoviirus, astroviirus, parvoviirus ja muud infektsioonid.

immuunbloteerimine

Immuunblotanalüüsi meetodi põhimõte on tuvastada patogeeni üksikute antigeenide vastaseid antikehi. Selle meetodi abil määratakse HIV-antigeenide (viiruse ümbrise glükoproteiinid, tuumavalgud ja viiruse ensüümid) vastased antikehad. Immuunblotanalüüsi tulemusi hinnatakse positiivseteks, küsitavateks ja negatiivseteks, sõltuvalt tuvastatud antikehade kvantitatiivsest ja kvalitatiivsest komplektist.

Tuleb märkida, et immuunblotimise tundlikkus on ELISA suhtes madalam; mõnel juhul võib patsiendi HIV-nakkuse olemasolul registreerida negatiivse tulemuse. ELISA valepositiivsete tulemuste registreerimise võimalus HIV-nakkuse korral nõuab aga integreeritud lähenemist HIV-nakkuse diagnoosimisele, võttes lisaks immunoloogiliste reaktsioonide (ELISA, immuunblotanalüüs) tulemustele arvesse epidemioloogilisi ja kliinilisi andmeid.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

PCR-meetodi töötas välja Ameerika biokeemik Kary Mullis 1983. aastal, tuginedes tema avastatud termostabiilse DNA polümeraasi (Tag polymerase) kasutamisele. Meetodi põhimõte on suurendada automaatrežiimis DNA polümeraasi poolt in vitro katalüüsitud patogeeni spetsiifilise DNA piirkonna koopiate arvu 10 6 -10 8 korda.

Kunstlikes tingimustes on teatud patogeenide liigi või perekonna spetsiifilise genoomi piirkonna replikatsiooniprotsessi replikatsioon võimalik eeldusel, et selle nukleotiidjärjestus on teada. Selliste piirkondade (amplikonide) replikatsiooniproduktide tuvastamise meetodite kasutamine võimaldab kindlaks teha patogeeni olemasolu uuritavas proovis.

Eespool kirjeldatud komplementaarne ahela lõpetamine algab ainult teatud lähteplokkidest, mis on lühikesed kaheahelalised lõigud. Kui sellised plokid on kinnitatud DNA spetsiifiliste piirkondade külge, suunatakse uue ahela sünteesiprotsess ainult valitud piirkonda, mitte kogu DNA ahela pikkuses. Antud DNA piirkondades lähteplokkide loomiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit, mida nimetatakse praimeriteks. Praimerid on komplementaarsed DNA järjestustega konkreetse fragmendi vasakul ja paremal piiril ning on orienteeritud nii, et uue DNA ahela valmimine toimub ainult nende vahel.

TO PCR-meetodi eelised peaks sisaldama:

kõrge tundlikkus, mis võimaldab määrata 10-1000 rakku proovis;

kõrge spetsiifilisus, kuna uuritavas materjalis tuvastatakse selle patogeeni jaoks ainulaadne DNA fragment;

erinevate patogeenide tuvastamise protseduuri universaalsus ühest biotestist;

Suur analüüsikiirus (4--4,5 h);

Võimalus diagnoosida mitte ainult ägedaid, vaid ka varjatud infektsioone.

PCR-i kasutamine on efektiivne paljude bakteriaalsete ja viirusnakkuste diagnoosimiseks.

Viimasel ajal on üsna edukalt rakendatud PCR analüüsi kvantitatiivseid meetodeid, mis võimaldavad määrata patogeeni kontsentratsiooni materjalis (mikroobne või viiruskoormus), näiteks hinnata B-hepatiidi viiruse, HIV C replikatiivset aktiivsust. .

Siiski tuleb meeles pidada, et ka PCR-meetodil on omad piirangud, eelkõige oportunistliku autofloora põhjustatud infektsioonide diagnoosimisel.

Nukleiinhapete hübridiseerimine

nukleiinhapete hübridisatsioon nagu PCR, võimaldab teil ilma eelneva isoleerimiseta tuvastada proovis patogeeni. Analüüsiks sünteesitakse üheahelaline DNA või RNA sond, mis on komplementaarne patogeeni spetsiifiliste nukleotiidjärjestustega. Sond on märgistatud radionukliidi, ensüümi või muu kergesti äratuntava märgisega. Uuritavat materjali töödeldakse biotestis esinevate mikroorganismide lüüsimiseks, DNA eraldamiseks ja denatureerimiseks. Järgmisena inkubeeritakse sondi uuritava prooviga ja mõõdetakse märgistatud DNA kogus, mis on hübridiseerunud uuritavas proovis oleva DNA-ga. Reaktsioon võib toimuda nii tahkefaasilistel sorbentidel kui ka lahuses, kuid kohustuslik tingimus on märgistatud sondi sidumata koguste mahapesemine. Nukleiinhapete hübridisatsioonimeetodi tundlikkus on madalam PCR-i omast ja on 103 mikroobirakku proovi kohta.

Veri võetakse veenist. Seejärel viiakse uuring läbi vastavalt juhistele:

• proov asetatakse elektroforeetiliseks eraldamiseks geeli, mille tulemuseks on spetsiifilised valgud, mis on viiruse suhtes tundlikud;
• töödeldud geelile kantakse nitrotselluloospaber;
• ettevalmistatud proov asetatakse bloteerimisseadmesse.

Konkreetsete ensüümide tuvastamiseks on vaja laboriuuringute jaoks korralikult ette valmistada paber. Selleks kantakse sellele antikehad ja märgistatud radioaktiivne konjugaat. Uuringu tulemust hinnatakse visuaalselt, uuritakse konstrueeritud ensüümide ahelaid.

Tulemuste dešifreerimine

Pärast manipuleerimist jäävad paberile triibud. Need asuvad kohas, kus konjugatsioon toimus, see tähendab, et kasutatud ravim reageeris viiruse valguga. Sel viisil saab tuvastada valgu osi:

• HIV-1 tuumast - p17, p24, p55;
• HIV-2 põhjustaja - p16, p26, p56.

Western blot analüüsi tulemused loetakse positiivseks, kui tuvastatakse 2 kolmest HIV-1 või HIV-2 valgust. Kuna positiivse ELISA kinnitamiseks kasutatakse sageli Western blot'i (uuringu teine ​​nimi), kontrollitakse reaktsiooni spetsiifiliste valkude suhtes: gp120 / 160, gp41 või p24. Need on osa kolmest peamisest AIDSi geenist – gag, pol ja env. Esialgse diagnoosimise ajal tehakse test ainult valkude p25, gp110 / 120 ja gp160 jaoks, kui see andis positiivse tulemuse, tehakse test p24 jaoks. See valgu osa võimaldab teil viirust varajases staadiumis tuvastada.

Positiivne tulemus on põhjus keerulisema diagnoosi taotlemiseks. See on vale ainult kolmel juhul:

• kõrge bilirubiinisisaldusega patsientidel;
• kokkupuutel viiruse antigeenidega;
• sidekoe patoloogiate korral.

Kui patsiendil ei ole AIDSi valkudele vastavaid jooni, hinnatakse tulemus negatiivseks. See tähendab, et inimene ei ole HIV-iga nakatunud või on “aknaperioodis”. Viimane tähendab, et viirus võib kehasse sattuda, kuid mitte selles veel areneda. Diagnoosimise täpsuse parandamiseks kasutatakse testsüsteeme:

• Rekombinantne-HIV;
• antigeen;
• Peptoscreen.

Pärast nende kontrollimist loetakse tulemus negatiivseks, kui gp120, gp160, Sp4 valke proovis ei leidu.

On veel üks tõlgendusvõimalus - neutraalne või küsitav tulemus. See esineb neil, kes on olnud seksuaalvahekorras HIV-nakatunud partneriga. Nende veres leitakse gp120 ja gp160 valkude vastaseid antikehi. Samuti antakse blotimisel kahtlane vastus, kui infektsioon on asümptomaatiline, see tähendab, et see on puhkeolekus.

Küsitav tulemus on oluline põhjalikult kontrollida. Selleks kasutage vereseerumi uurimist dünaamikas, see tähendab regulaarseid kontrolle immunoblotanalüüsi ja ELISA abil kuue kuu jooksul. Samuti on ette nähtud täiendavad uuringud, kuna autoantikehade ja immuunkomplekside esinemine veres võib olla tingitud:

• nakkushaigused;
• vähkkasvajate esinemine;
• allergiad.

Tahkefaasi ELISA - testi variant, kui üks immuunreaktsiooni komponentidest (antigeen või antikeha) sorbeeritakse tahkele kandjale, näiteks polüstüreenplaatide süvenditesse. Komponendid tuvastatakse märgistatud antikehade või antigeenide lisamisega. Positiivse tulemuse korral muutub kromogeeni värvus. Iga kord pärast järgmise komponendi lisamist eemaldatakse sidumata reaktiivid aukudest pesemise teel,

Antikehade määramisel (vasakul joonisel) lisatakse adsorbeeritud antigeeniga plaatide süvenditesse järjestikku patsiendi vereseerum, ensüümiga märgistatud antiglobuliini seerum ja ensüümi substraat/kromogeen.

II. Antigeeni määramisel (joonis parempoolne) viiakse antigeen (näiteks soovitud antigeeniga vereseerum) adsorbeeritud antikehadega süvenditesse, lisatakse selle vastane diagnostiline seerum ja ensüümiga märgistatud sekundaarsed antikehad (diagnostilise seerumi vastu), ja seejärel ensüümi substraat / kromogeen.

Konkurentsivõimeline ELISA antigeeni tuvastamiseks: sihtantigeen ja ensüümiga märgistatud antigeen konkureerivad üksteisega piiratud koguse immuunseerumi antikehade sidumisel.

Teine test on konkureeriv ELISA antikehade tuvastamiseks: huvipakkuvad antikehad ja ensüümiga märgistatud antikehad konkureerivad üksteisega tahkele faasile adsorbeerunud antigeenide pärast.

Immunoblotanalüüs– ülitundlik meetod valkude tuvastamiseks, mis põhineb elektroforeesi ja ELISA või RIA kombinatsioonil. Immunoblotimist kasutatakse HIV-nakkuse diagnostilise meetodina jne.

Patogeeni antigeenid eraldatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga, kantakse seejärel geelilt üle aktiveeritud paberile või nitrotselluloosmembraanile ja arendatakse ELISA abil. Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega". Nendele ribadele kantakse patsiendi seerum. . Seejärel, pärast inkubeerimist, pestakse patsient patsiendi sidumata antikehadest ja kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastane seerum. . Ribale moodustunud kompleks [antigeen + patsiendi antikeha + inimese Ig vastane antikeha] tuvastatakse kromogeense substraadi lisamisega, mis muudab ensüümi toimel värvi.

52. Interferoonid, loodus. Saamis- ja rakendusmeetodid.

Interferoon on üks immuunsüsteemi olulisi kaitsvaid valke. See avastati, kui uuriti viiruste interferentsi, st nähtust, kui ühe viirusega nakatunud loomad või rakukultuurid muutusid teise viirusega nakatumise suhtes tundetuks. Selgus, et interferents on tingitud tekkivast valgust, millel on kaitsev viirusevastane omadus. Seda valku nimetati interferooniks.

Interferoon on glükoproteiinide perekond, mida sünteesivad immuunsüsteemi rakud ja sidekoe. Sõltuvalt sellest, millised rakud interferooni sünteesivad, on neid kolme tüüpi: α, β ja γ-interferoonid.

Alfa interferoon leukotsüütide poolt toodetud ja seda nimetatakse leukotsüütideks; beeta-interferoon nimetatakse fibroblastiliseks, sest seda sünteesivad fibroblastid – sidekoerakud ja gamma-interferoon- immuunne, kuna seda toodavad aktiveeritud T-lümfotsüüdid, makrofaagid, looduslikud tapjad, st immuunrakud.

Interferoon sünteesitakse kehas pidevalt ja selle kontsentratsioon veres hoitakse umbes 2 RÜ / ml (1 rahvusvaheline ühik - ME on interferooni kogus, mis kaitseb rakukultuuri viiruse 1 CPD 50 eest). Interferooni tootmine suureneb järsult nii viirustega nakatumisel kui ka kokkupuutel interferooni indutseerijatega, nagu RNA, DNA, komplekspolümeerid. Selliseid interferooni indutseerijaid nimetatakse interferonogeenid.

Lisaks viirusevastasele toimele on interferoonil kasvajavastane kaitse, kuna see aeglustab kasvajarakkude proliferatsiooni (paljunemist), samuti immunomoduleerivat aktiivsust, stimuleerib fagotsütoosi, looduslikke tapjaid, reguleerib B-rakkude poolt antikehade moodustumist, aktiveerib peamise histo-sobivuse ekspressiooni. keeruline.

Toimemehhanism interferoon on keeruline. Interferoon ei mõjuta otseselt viirust väljaspool rakku, vaid seondub spetsiaalsete rakuretseptoritega ja mõjutab viiruse paljunemisprotsessi rakus valgusünteesi staadiumis.

Interferooni kasutamine. Interferooni toime on seda tõhusam, seda varem hakkab see sünteesima või kehasse väljastpoolt sisenema. Seetõttu kasutatakse seda paljude viirusnakkuste, näiteks gripi, profülaktilistel eesmärkidel, samuti krooniliste viirusnakkuste, nagu parenteraalne hepatiit (B, C, D), herpes, hulgiskleroos jne, ravimisel. Interferoon annab positiivse tulemuse tulemuseks on pahaloomuliste kasvajate ja immuunpuudulikkusega seotud haiguste ravi.

Interferoonid on liigispetsiifilised, st inimese interferoon on loomadele vähem efektiivne ja vastupidi. See liigispetsiifilisus on aga suhteline.

Interferooni saamine. Interferooni saadakse kahel viisil: a) inimese leukotsüütide või lümfotsüütide nakatamisel ohutu viirusega, mille tulemusena nakatunud rakud sünteesivad interferooni, mis seejärel isoleeritakse ja sellest konstrueeritakse interferoonipreparaadid; b) geenitehnoloogia abil – kasvatades tööstuslikes tingimustes rekombinantseid bakteritüvesid, mis on võimelised tootma interferooni. Tavaliselt kasutatakse Pseudomonase, Escherichia coli rekombinantseid tüvesid, mille DNA-sse on sisestatud interferooni geenid. Geenitehnoloogia abil saadud interferooni nimetatakse rekombinantseks. Meie riigis sai rekombinantne interferoon ametliku nime "Reaferon". Selle ravimi tootmine on palju tõhusam ja odavam kui leukotsüütide ravim.

Rekombinantne interferoon on leidnud meditsiinis laialdast rakendust viirusnakkuste, neoplasmide ja immuunpuudulikkuse profülaktilise ja raviainena.

Nakkushaiguste laboratoorse diagnostika praktikas tekib mõnikord vajadus määrata antikehi mitte patogeeni üldiselt, vaid teatud selle valkude (antigeenide) suhtes, see tähendab spetsiifiliste antikehade spektrit. Kui selleks kasutatakse ensüümseotud immunosorbentanalüüsi meetodit, siis on sel juhul vaja patogeeni kultuurist eraldada ja puhastada vajalikud antigeenid. Saadud valgud kantakse tahkele faasile eraldi. 96-süvendilise plaadi kasutamise korral - igas süvendis ühte tüüpi antigeen. Seejärel määratakse spetsiifilised antikehad kaudse meetodiga.

Positiivse reaktsiooni olemasolul süvendis ühe või teise antigeeniga saab hinnata vastavate spetsiifiliste antikehade olemasolu. Selliseid ensüümi immuunanalüüsi testsüsteeme pakuvad tootjad, kuid tänu suuremale teabesisaldusele ja uuringu enda teostamise lihtsusele on immuunblotanalüüs (Western blot) muutunud laialt levinud.

Immuunblotanalüüs võimaldab tuvastada vereseerumis antikehi üheaegselt ja samal ajal diferentseeritult kõigi diagnostiliselt oluliste patogeeni valkude suhtes. Tõlge inglise keelest Western blot tähendab westerni ülekannet (sõna-sõnalt - blot). Selle ebatavalise termini ajalugu on järgmine.

Teadlane nimega Southern (E. Southern) pakkus 1975. aastal esmakordselt välja meetodi elektroforeetiliselt eraldatud DNA fragmentide ülekandmiseks geelist membraanile. Autori sõnul nimetati meetodit Southern blot, mis tähendab "lõunasiiret". RNA molekulide ülekandmise meetodit kutsusid spetsialistid omakorda hüüdnimeks Northern blot - "northern transfer". Algul naljana ja siis fikseeriti see nimi ametlikus teaduskirjanduses.

G. Toubin avaldas 1979. aastal valgublotanalüüsi esimeste katsete tulemused. Jätkates bioloogiliste makromolekulide ülekandmise meetodite "geograafiliste" nimetuste traditsioone, sai see meetod tuntuks "lääne" ülekandena - Western blot.

Selle meetodi esimeses etapis viiakse läbi patogeensete valkude segu elektroforeetiline eraldamine polüakrüülamiidgeelis naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul. Pindaktiivse ainena ümbritseb SDS ühtlaselt valgumolekule ja annab neile kõigile ligikaudu võrdse suurusega negatiivse laengu. Seetõttu liiguvad molekulid elektriväljas ühes suunas ning liikumise kiirus sõltub ainult valgu molekuli suurusest (molekulmassist).

Elektroforeetilise protseduuri tulemusena saadakse geelplaat, mille paksuses paiknevad valgud eraldi õhukeste lineaarsete tsoonide kujul. Liikumissuunas jagunevad need järgmises järjekorras: suure molekulmassiga, umbes 120-150 kDa valgud on stardile lähemal ja 5-10 kDa massiga valgud on edasi jõudnud finišisse. Teises etapis asetatakse geelplaat nitrotselluloosi lehele ja see struktuur asetatakse alalisvooluallika elektroodide vahele. Elektrivälja toimel voolavad valgud poorsest geelist tihedamale membraanile, kus need on kindlalt fikseeritud.

Saadud blotti töödeldakse blokeeriva lahusega, mis sisaldab antigeenselt ükskõikseid valke ja/või mitteioonseid detergente (Tween 20), mis blokeerivad membraani antigeenivabu kohti. Seejärel lõigatakse membraanileht kitsasteks ribadeks, nii et iga riba sisaldab kõiki antigeenseid fraktsioone. Kirjeldatud sammud viib läbi tootja.

Kaubanduslikud testisüsteemid antikehade tuvastamiseks immuunblotanalüüsi abil sisaldavad analüüsiks valmis blotte (ribasid või ribasid). Kasutaja määrab patogeeni valkude spetsiifiliste antikehade kogu spektri vastavalt kaudse meetodi skeemile. Kromogeenina värvi (ensümaatilise) reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse lahustuvat värvitut ainet, mille saadus omandab värvuse, muutub lahustumatuks ja settib (sadeneb) nitrotselluloosile.

Järjestikuste immuun- ja ensümaatiliste reaktsioonide tulemusena tekivad uuritavas proovis patogeeni valkude vastaste antikehade olemasolul blotile tumedad põikitriibud, mille asukoht on teatud patogeensete valkude tsoonis. Iga selline riba näitab vastava antigeeni spetsiifiliste antikehade olemasolu. Immuunblotanalüüsi meetodil tehtud uuringu tulemus väljastatakse patogeeni spetsiifiliste valkude vastaste antikehade loeteluna. Näiteks: "tuvastati p17 ja p24 valkude vastased antikehad."

Nitrotselluloosi blotte saab pärast väljatöötamist säilitada kuivatatud kujul pikka aega. Värvi intensiivsus on aga oluliselt nõrgenenud. Märgblotte saab pildistada või skannerite abil nende graafilise pildi personaalarvutite mällu sisestada. Spetsiaalsed arvutiprogrammid võimaldavad teil tulemusi töödelda ja dünaamilise jälgimise ajal kiiresti jälgida antikehade spektri dünaamikat