Miks teha kalatesti onkoloogias. Rinnavähi avastamine: kuidas mitte jätta vahele salakavalat haigust? FISH-testi poleemika

Pakub kliinik Assuta. Fluorestseeruv hübridisatsioon, mida muidu nimetatakse FISH-iks (FISH), on geneetiline test, mis annab aimu kasvaja olemusest. Uurides kasvajat FISH-meetodil, selgitab arst välja, kas vähk on HER2 geeni suhtes positiivne või negatiivne. Keharakkudes esineva geeni koopiad stimuleerivad ebatüüpiliste vähirakkude kasvu. Pärast diagnoosi panemist saab arst koostada kõige üksikasjalikuma raviplaani.

Assuta kliiniku kaasaegne laborikompleks teeb FISH (FISH) analüüsi, et hinnata rinnavähi patoloogiaid:

• Unikaalne testimine annab täpse ülevaate kasvaja olemusest, selle omadustest.
• Erahaiglal on tulemuste saavutamiseks võimsad ressursid.
• Meil töötavad Iisraeli parimad arstid, diagnostika ja teraapia toimub individuaalsete skeemide järgi.

Helistage ja uurige, kuidas ravi taotleda. Taasta oma tervis Lähis-Ida suurimas haiglas.

Registreeruge konsultatsioonile

Rinnavähi kalatest - onkoloogia arengu mehhanism

HER2 geeni retseptorid vastutavad HER2 valkude tootmise eest, mis on vähirakkudes leiduvad retseptorid. Kui retseptorid on aktiveeritud, saavad vähirakud signaali jagunemise ja paljunemise vajaduse kohta. Tavaliselt reguleerivad HER 2 retseptorid rinnarakkude kasvu, säilitades kudede tervise tasakaalu.

Siiski on tõestatud, et HER 2 geen on ületootmine igal viiendal onkoloogiajuhtumil. See tähendab, et inimesel on ühe geenikoopia asemel geen igalt vanemalt. See seletab HER-i retseptorite liigset suurenemist kehas, põhjustades kontrollimatut ja agressiivset kasvaja kasvu.

Rinnavähi kalaanalüüsi läbimine on vajalik selleks, et välja selgitada, kui palju on patoloogia arengu põhjus organismis seotud retseptorite ebanormaalse tootmisega. Peate teadma, kas vähi tüüp on HER2 positiivne või negatiivne. HER 2 retseptor-positiivse rinnavähi jaoks on spetsiaalselt välja töötatud ravimeetodeid. Analüüs võimaldab teil mitte raisata aega tõhusate mõjutamismeetodite otsimisele.

Kui rinnavähi korral tehakse kalareaktsioon, kasutab arst kromosoomianomaaliate visualiseerimiseks profiilplekke. Uuritud kudedele kantud lahus võimaldab näha anomaaliaid. FISH-analüüsi eeliseks on see, et see suudab tuvastada geneetilisi kõrvalekaldeid, mis on liiga väikesed, et neid mikroskoobi all alternatiivsete meetoditega uurida.

Testimise eeliseks on ka see, et patsient saab tulemused mõne päeva pärast, samas kui teised meetodid annavad joonduse alles mõne nädala pärast. Lisaks piimanäärme pahaloomulise kasvaja määramisele kasutatakse kalatesti põie vähipatoloogia diagnoosimisel, leukeemia määramisel.

Analüüside tüübid

HER2 positiivse või negatiivse olemuse kindlakstegemiseks suunavad Assuta kliiniku arstid patsiendi testimiseks oma laborisse. Teste on kahte tüüpi:

• Immunohistokeemia – IHC paljastab suure hulga valke. Uuringu käigus uurib patoloog kudesid spetsiaalsete plekkide abil mikroskoobi all. 1+ tulemuse või 0 punkti saamiseks ei ole vaja täiendavat testimist. Tulemust 2+ peetakse määramatuks ja see nõuab täiendavat testimist. Tulemus 3+ kinnitab negatiivset stsenaariumi.
• MOG test (hübridisatsioon) on järgmine samm onkoloogia kahtluse korral. On oluline, et analüüsi viiks läbi kogenud patoloog, mis välistab vead tulemuste dešifreerimisel. Teste on kahte peamist tüüpi – rinnavähi kalatest ja heleda välja meetod. Positiivne kalatest on lõplik diagnoosimismeetod.

Väga harva on kalaanalüüs ebamäärane või mitmetähenduslik. Nendel asjaoludel on diagnoosi kinnitamiseks vaja teist biopsiat ja uut kalareaktsiooni rinnavähi korral.

Kuidas käib kalatest rinnavähi suhtes – juhend patsiendile

HER 2 staatuse pädevaks diagnoosimiseks teeb arst biopsia, mille käigus eemaldab ta patoloogia tõttu muutunud kudede proovid. Enamikul juhtudel kasutatakse ebamugavustunde leevendamiseks kohalikku anesteesiat. Seejärel saadetakse ekstraheeritud kude uurimiseks laborisse, kus patoloog sellega töötab. On väga oluline, et labor oleks meditsiinikeskkonnas autoriteetne, sest õigest diagnoosist sõltub otseselt patsiendi elu. Rinnavähi kalatest on osutunud ohutuks protseduuriks. See ei nõua palju aega, eraldi protseduure, välja arvatud biopsia ja täiendav koetrauma.

Miks üldse tehakse IHC testimine? See on lihtsam ja kättesaadavam. Kui analüüsid ei ole siiski lõplikud, on FISH-testi tegemine kohustuslik. Harvadel juhtudel on võimalik korduv biopsia koos proovide võtmisega. Kuid seda juhtub tõesti harva. Kui rinnavähi kalatest on HER2-positiivne, määratakse teile HER2-positiivse vähi vastu tõhus ravi. Hoolimata asjaolust, et tegemist on patoloogia agressiivse vormiga, on selle diagnoosiga inimeste väljavaated viimastel aastatel oluliselt paranenud. Selle põhjuseks on uued ja tõhusad rinnavähi ravimeetodid Iisraelis, mis on suunatud HER 2 retseptoritele.

Taotlege ravi

Rinnavähk (BC) on levinud onkoloogia tüüp ja kahjuks pole veel välja töötatud ühtegi ravimeetodit, mis annaks täieliku paranemise garantii. Seetõttu on patsiendi jaoks parim väljapääs rinnavähi ennetamine ja õigeaegne diagnoosimine. Kala - rinnavähi analüüs on moodsaim uurimismeetod, mis võimaldab suunata patsiendi ravi kõige õigemat teed pidi.

Vaatamata selle haiguse uurimisel ja ravimisel omandatud tohututele kogemustele ei suuda meditsiin ikka veel välja selgitada välistegureid, mis põhjustavad rinnanäärme pahaloomulist kasvajat. Ühtegi teadaolevatest kantserogeenidest ei saa selle haiguse esinemisega usaldusväärselt seostada. Kaasaegsed diagnostikameetodid annavad üldiselt häid tulemusi ja võimaldavad täpselt kindlaks teha haiguse olemasolu või puudumise ja arenguetapi. Kuid mitte kõik neist ei anna põhjalikku teavet, mis võimaldab teil ravi täpselt määrata.

1. Täielik vereanalüüs – kontrollib leukotsüütide taset, erütrotsüütide settimise kiirust ja hemoglobiini. Esimesed kaks näitajat onkoloogias suurenevad, viimane, vastupidi, väheneb. Kuid see analüüs võimaldab meil hinnata ainult teatud probleemide olemasolu kehas. Selle abil on võimatu "rinnavähi" täpset diagnoosi panna, eriti kasvaja arengu varases staadiumis.
2. Biokeemia - määrab ensüümide ja elektrolüütide taseme, mis võimaldab hinnata metastaaside olemasolu. Need andmed ei ole aga alati objektiivsed. See uuring näitab ka mõnede onkomarkerite olemasolu veres, mis aitavad jälgida vähkkasvaja olemasolu ja selle asukohta.
3. Spektraalanalüüs võimaldab kindlaks teha vähi esinemist tõenäosusega üle 90%, sealhulgas varajases staadiumis.Meetod põhineb vere uurimisel infrapunakiirguse all, mis võimaldab määrata selle molekulaarset koostist.
4. Biopsia – tehakse rinnast koeproovi võtmise ja edasise tsütoloogilise analüüsiga, mis määrab vähirakkude olemasolu ja nende arvu, mis sõltub haiguse arenguastmest.
5. Geneetiline analüüs määrab patsiendi eelsoodumuse rinnavähi tekkeks.See viiakse läbi, tuvastades veres teatud geenid, mis vastutavad vähi põlvest põlve edasikandumise eest.

Tänapäeva uusim ja tõhusaim uurimismeetod on aga nn FISH (kala) test. Inglise keelest tõlgitud lühend kõlab nagu "tsellulaarne fluorestsentshübridisatsioon".

Kalade testimise meetod on suhteliselt uus – seda on kasutatud alates 1980. aastast. Vaatamata keerukusele ja kõrgele hinnale õnnestus tal aga teenida positiivseid hinnanguid nii arstidelt kui ka patsientidelt, kes tänu temale edukalt vähist vabanesid.

Geen nimega HER2 vastutab rinnarakkude kasvu eest inimkehas. Nimetus inglise keelest tõlgituna tähendab inimese östrogeeni retseptorit – 2. Tavaliselt toodavad selle geeni retseptorid HER2 – valku, mis reguleerib näärmerakkude jagunemist. Vähikasvaja (tavaliselt kartsinoom) oma alguses "petab" seda geeni, sundides seda kasvatama täiendavat kudet, mida kasvaja oma arenguks kasutab. See anomaalia ilmneb umbes 30% juhtudest ja seda iseloomustab termin "võimendus".

Seega aitab patsiendi keha ise onkoloogiat arendada. Kui seda protsessi ei peatata, ei pruugi ka kõige kaasaegsemad ja võimsamad ravimeetodid patsienti aidata.

HER2 geeni amplifikatsiooni uurimine toimub tavaliselt kahes etapis:

• IHC (immunohistokeemiline test);
• otse FISH - analüüs (fluorestsentshübridisatsioon).

Kohaliku anesteesia all tehakse patsiendile biopsia - koeproovide võtmine, mis saadetakse spetsialiseeritud laborisse.

Esiteks tehakse tavaliselt immunohistokeemia - vähi kasvaja koeproovi mikroskoopiline analüüs. See määrab HER2 geeni fundamentaalse esinemise kasvajakoes. See uuring on palju odavam kui kalatest ning seda on ka lihtsam ja kiirem läbi viia. Nii täpset infot see aga ei anna.Tulemus määratakse numbritega nullist kolme punktini. Kui tulemus on väiksem või võrdne ühega, siis HER2 geen kasvajas puudub ja edasisi uuringuid pole vaja. Kahest kuni kolmest punktist - piirseisund, rohkem kui kolm - on pahaloomuline moodustis kasvuprotsessis ja on vaja minna diagnoosimise teise etappi.

Rinnavähi kalauuring viiakse läbi järgmiselt: verre viiakse spetsiaalse värvainega märgistatud DNA (desoksüribonukleiinhappe) molekulide elemendid. Need markerid sisestatakse patsiendi DNA molekulidesse ja määravad, kas ja millisel tasemel toimub HER2 amplifikatsioon. Analüüs viiakse läbi reaalajas, arst võrdleb geeni jagunemise kiirust väidetava kasvaja asukohas rinna tavalise piirkonna jagunemise kiirusega.

Rinnavähi korral võib FISH-uuring anda järgmised tulemused:

• reaktsioon on positiivne - HER2 geeni jagunemise kiirus kasvajakoes ületab normaalset kaks korda või rohkem, sel juhul on vaja täiendavat ravi;
• reaktsioon on negatiivne - HER2 ei osale vähirakkude jagunemise protsessis ja kui kasvaja on ikka veel olemas, siis see geen selle arengut ei katalüüsi.

Seega võimaldab analüüs määrata HER2 geeni ebaõige käitumise ja korrigeerida ravi, rakendades paralleelset teraapiat, mille eesmärk on selle geeni supresseerimine. Praegu kasutatakse selleks ravimit Herceptin.

Kui kalatesti ei tehta õigel ajal või kui tulemustele tähelepanu ei pöörata, ei ole arstil andmeid HER2 käitumise kohta. Sel juhul määratakse ravi, võtmata arvesse selle geeni võimalikku agressiivset aktiivsust. Tõenäoliselt ei anna selline ravi tulemusi - kasvaja areneb edasi agressiivselt.

Lisaks eelnevale annab HER2 geeni käitumise jälgimine onkoloogidele arusaamise kasvaja agressiivsuse astmest ning võime ennustada selle kasvu ja leviku kiirust. See mängib patsiendi ravi kavandamisel väga olulist rolli. Selgitatakse, kas on vaja määrata rasket ravi (näiteks kiiritus- või keemiaravi) või piisab hormoonravist, kas operatsioon on mõttekas või mitte.

Kalade analüüsi plussid ja miinused

Nagu igal teisel diagnostilisel meetodil, on FISH-uuringul oma plussid ja miinused.

1. Uuring viiakse läbi kiiresti – tulemus on valmis mõne päevaga, teiste diagnostikameetodite puhul kulub kuni mitu nädalat. See hetk on onkoloogiavastases võitluses äärmiselt oluline.
2. Lisaks rinnavähi uuringule võimaldab analüüs välja selgitada patsiendi eelsoodumuse mis tahes kõhuõõne organi onkoloogiale. Patsiendile esitatakse üksikasjalik aruanne, millest juhindudes saab ta läbida täiendavaid uuringuid, et vältida võimalikku vähi arengut.
3. Tänu kalaanalüüsi spetsiifikale suudab see tuvastada kõige ebaolulisemaid geneetilisi kõrvalekaldeid, mida pole võimalik teiste meetoditega diagnoosida.
4. Erinevalt mõnest muust uurimistööst on kalatest patsiendile ohutu. Lisaks biopsiale ei nõua see täiendavaid traumeerivaid mõjusid.

Mõned onkoloogid peavad kalatesti tõhusust vastuoluliseks. Need põhinevad uuringutel, mis ei ole näidanud selle meetodi olulist eelist odavama IHC uuringu ees.

• uurimistöö kõrge hind;
• kuna DNA-sse sisestatud markerid on mõnevõrra spetsiifilised, ei saa neid kromosoomide mõnes osas kasutada;
• analüüs ei paljasta kõiki geneetilisi kahjustusi, mis võivad põhjustada diagnostilisi vigu.

Üldiselt, vaatamata kriitikale, on kalaanalüüs rinnavähi diagnoosimise meetoditest kiireim ja täpsem. Samuti on oluline, et see võimaldab ennustada mõne muu onkoloogia tüübi arengut.

Igasugust vähki on kõige lihtsam ravida varases arengujärgus. Kahjuks on irooniline, et enamikku teadaolevatest pahaloomuliste kasvajate tüüpidest on varases staadiumis äärmiselt raske diagnoosida. Lisaks on paljud kasutatavad diagnostikameetodid aeganõudvad ega anna täiesti objektiivset pilti. Kalade analüüs ei anna mitte ainult kõige täpsemat pilti kasvaja seisundist, vaid võimaldab ka päästa patsiendi keha hävitavatest ravivormidest (näiteks keemiaravi), kuna määratakse kasvaja agressiivsuse aste ja vastavalt metastaaside tõenäosus.

Kaasaegne tsütogeneetilise analüüsi meetod, mis võimaldab määrata kromosoomide kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid muutusi (sh translokatsioonid ja mikrodeletsioonid) ning mida kasutatakse pahaloomuliste verehaiguste ja soliidtuumorite diferentsiaaldiagnostikas.

Vene sünonüümid

Fluorestseeruv in situ hübridisatsioon

KALA analüüs

Ingliskeelsed sünonüümid

Fluorestsents kohapeal hübridisatsioon

Uurimismeetod

Fluorestseeruv in situ hübridisatsioon.

Millist biomaterjali saab uurimistööks kasutada?

Koeproov, koeproov parafiiniplokis.

Kuidas uuringuteks õigesti valmistuda?

Ettevalmistust pole vaja.

Üldine teave uuringu kohta

Fluorestseeruv in situ hübridisatsioon (FISH) sisse- situ hübridisatsioon) on üks kaasaegsemaid meetodeid kromosoomianomaaliate diagnoosimiseks. See põhineb fluorestsentsmärgisega märgistatud DNA-sondide kasutamisel. DNA sondid on spetsiaalselt sünteesitud DNA fragmendid, mille järjestus on komplementaarne uuritavate aberrantsete kromosoomide DNA järjestusega. Seega erinevad DNA proovid koostiselt: erinevate kromosoomianomaaliate määramiseks kasutatakse erinevaid spetsiifilisi DNA proove. DNA sondid on ka erineva suurusega: mõned võivad olla suunatud tervele kromosoomile, teised kindlale lookusele.

Hübridisatsiooniprotsessi käigus, kui uuritavas proovis on hälbivaid kromosoome, seostuvad need DNA-sondiga, mis fluorestsentsmikroskoobiga uurides määratakse fluorestsentssignaalina (FISH-testi positiivne tulemus). Aberrantsete kromosoomide puudumisel "pestakse" reaktsiooni käigus välja sidumata DNA proovid, mida fluorestsentsmikroskoobiga uurides määratletakse fluorestsentssignaali puudumisena (negatiivne FISH-testi tulemus). Meetod võimaldab hinnata mitte ainult fluorestsentssignaali olemasolu, vaid ka selle intensiivsust ja lokaliseerimist. Seega pole FISH-test mitte ainult kvalitatiivne, vaid ka kvantitatiivne meetod.

FISH-testil on teiste tsütogeneetiliste meetodite ees mitmeid eeliseid. Esiteks saab FISH-uuringut rakendada nii metafaasi- kui ka interfaaside tuumadele, see tähendab mittejagunevatele rakkudele. See on FISH-i peamine eelis võrreldes klassikaliste karüotüpiseerimismeetoditega (nt kromosoomide Romanowsky-Giemsa värvimine), mida rakendatakse ainult metafaasi tuumadele. See muudab FISH-uuringu täpsemaks meetodiks kromosomaalsete kõrvalekallete tuvastamiseks madala proliferatiivse aktiivsusega kudedes, sealhulgas soliidtuumorites.

Kuna FISH-testis kasutatakse interfaaside tuumade stabiilset DNA-d, saab uurimistööks kasutada mitmesuguseid biomaterjale – peennurga aspiratsioonibiopsiaaspiraate, määrdeid, luuüdi aspiraate, biopsiaproove ja, mis kõige tähtsam, säilinud koefragmente, näiteks histoloogilisi plokke. Nii saab näiteks "rinna adenokartsinoomi" diagnoosi ja kasvaja HER2/neu staatuse määramise vajaduse kinnitamisel edukalt sooritada FISH-testi korduvatele preparaatidele, mis on saadud rinna biopsia proovi histoloogilisest plokist. Tuleb rõhutada, et hetkel soovitatakse FISH-uuringut kinnitava testina, kui saadakse HER2/neu kasvajamarkeri (IHC 2+) määramatu kasvaja immunohistokeemilise uuringu tulemus.

FISH-i teine ​​eelis on selle võime tuvastada mikrodeletsioone, mida ei tuvastata klassikalise karüotüpiseerimise või PCR-iga. See on eriti oluline DiGeorge'i sündroomi ja velokardiofatsiaalse sündroomi kahtluse korral.

FISH-testi kasutatakse laialdaselt pahaloomuliste haiguste diferentsiaaldiagnostikas, eelkõige onkohematoloogias. Kromosoomianomaaliad koos kliinilise pildi ja immunohistokeemiliste andmetega on aluseks lümfo- ja müeloproliferatiivsete haiguste klassifitseerimisel, ravitaktika määramisel ja prognoosimisel. Klassikalised näited on krooniline müeloidleukeemia - t (9; 22), äge promüelotsüütleukeemia - t (15; 17), krooniline lümfotsüütleukeemia - trisoomia 12 jt. Mis puutub tahketesse kasvajatesse, siis FISH-uuringut kasutatakse kõige sagedamini rinna-, põie-, käärsoolevähi, neuroblastoomi, retinoblastoomi jt vähi diagnoosimisel.

FISH-uuringut saab kasutada ka sünnieelses ja preimplantatsioonidiagnostikas.

FISH-testi tehakse sageli koos teiste molekulaar- ja tsütogeneetilise diagnostika meetoditega. Selle uuringu tulemust hinnatakse koos täiendavate labori- ja instrumentaalandmete tulemustega.

Milleks uuringuid kasutatakse?

• Pahaloomuliste haiguste (veri ja tahked elundid) diferentsiaaldiagnostikaks.

Millal on uuring planeeritud?

• Kui kahtlustate pahaloomulise verehaiguse või soliidkasvajate esinemist, sõltub ravi taktika ja prognoos kasvaja klooni kromosomaalsest koostisest.

Mida tulemused tähendavad?

Positiivne tulemus:

• Aberrantsete kromosoomide olemasolu uuritavas proovis.

Negatiivne tulemus:

• Aberrantsete kromosoomide puudumine uuritavas proovis.

Mis võib tulemust mõjutada?

• Aberrantsete kromosoomide arv.

• Kliinilise materjali immunohistokeemiline uuring (kasutades 1 antikeha)
• Kliinilise materjali immunohistokeemiline uuring (kasutades 4 või enamat antikeha)
• HER2 kasvaja staatuse määramine FISH abil
• HER2 kasvaja staatuse määramine CISH meetodil

Kes tellib uuringu?

Onkoloog, lastearst, sünnitusarst-günekoloog, geneetik.

Kirjandus

• Wan TS, Ma ES. Molekulaarne tsütogeneetika: asendamatu vahend vähi diagnoosimiseks. Anticancer Res. 2005 juuli-august;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Tsütogeneetiliste ja molekulaarsete tsütogeneetiliste uuringute mõju hematoloogilistele pahaloomulistele kasvajatele. Chang Gung Med J. 2012 märts-aprill;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Molekulaartsütogeneetika metafaasi- ja interfaasirakkudes vähi- ja geeniuuringuteks, diagnoosimiseks ja prognoosimiseks. Kasutamine koelõikudes ja rakususpensioonides. Genet Mol Res. 2002 juuni 30;1(2):117-27.

FISH-tehnika, fluorestsents in situ hübridisatsioon, töötati välja 1980. aastate keskel ja seda kasutatakse spetsiifiliste DNA järjestuste olemasolu või puudumise tuvastamiseks kromosoomides, samuti 6. kromosoomi tsentromeeril asuva alfa-DNA satelliidi CEP6 (6p11.1-q11.1) tuvastamiseks.

See andis tänu kasvajaantigeenide tuvastamisele olulise nihke melanotsüütilise päritoluga onkoloogiliste haiguste diagnoosimisel. Pahaloomulise kasvaja taustal määratakse mutatsioon kolmes antigeenis: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) ja CMM1 (1p). Sellega seoses on melanoomi ja selle eelkäijate varajasel diagnoosimisel suur tähtsus objektiivse diferentsiaaldiagnostika võimalusel, mis põhineb naha melanotsüütiliste kasvajate geneetiliste omaduste määramisel. Normaalse uuritud geenide komplekti ja 6. kromosoomiga tuumas on kaks kollase värviga värvitud RREB1 geeni, kaks tsentromeerset geeni on näidatud CCND1, kaks on kromosoomiga Tom6 geeni Diagnostika eesmärgil kasutatakse fluorestseeruvaid proove.

Reaktsiooni tulemuste hindamine: iga proovi 30 tuumas loendatakse punaste, kollaste, roheliste ja siniste signaalide arv, tuvastatakse neli erinevate geneetiliste häirete variantide parameetrit, milles proov on geneetiliselt kooskõlas melanoomiga. Näiteks vastab proov melanoomile, kui CCND1 geeni keskmine arv tuuma kohta on ≥2,5. Sama põhimõtte järgi hinnatakse ka teiste geenide koopiate arvu. Ravim loetakse FISH-positiivseks, kui on täidetud vähemalt üks neljast tingimusest. Proovid, milles kõik neli parameetrit on alla murdepunktide, loetakse FISH-negatiivseteks.

Kromosoomide spetsiifiliste DNA järjestuste määramine viiakse läbi biopsiaproovide või kirurgilise materjali lõikudel. Praktilises teostuses on FISH-reaktsioon järgmine: melanotsüütide tuumades DNA-d sisaldav testmaterjal töödeldakse selle molekuli osaliseks hävitamiseks, et lõhkuda kaheahelaline struktuur ja hõlbustada seeläbi juurdepääsu soovitud geenipiirkonnale. Proovid klassifitseeritakse DNA molekuli kinnituskoha järgi. Kliinilises praktikas FISH-reaktsiooni materjaliks on parafiinkoe ​​lõigud, määrded ja jäljendid.

FISH-reaktsioon võimaldab leida muutusi, mis on toimunud DNA molekulis geeni koopiate arvu suurenemise, geeni kadumise, kromosoomide arvu muutumise ja kvalitatiivsete muutuste – geenilookuse liikumise nii samas kromosoomis kui ka kahe kromosoomi vahel.

FISH reaktsiooni abil saadud andmete töötlemiseks ja kolme uuritud rühma geenide koopiaarvude vaheliste seoste uurimiseks kasutatakse Spearmani korrelatsioonikordajat.

Melanoomi iseloomustab koopiate arvu suurenemine võrreldes nevuse ja düsplastiliste nevustega.

Düsplastilise nevusiga võrreldes on lihtsal nevusel vähem koopiate arvu kõrvalekaldeid (st normaalseid koopiaid).

Otsustusreeglite koostamiseks, et ennustada, kas proov kuulub teatud klassi (lihtsa ja düsplastilise nevi diferentsiaaldiagnostika), kasutatakse "otsustuspuude" matemaatilist aparaati. See lähenemisviis on end praktikas tõestanud ja selle meetodi rakendamise tulemusi (erinevalt paljudest teistest meetoditest, näiteks närvivõrkudest) saab selgelt tõlgendada, et luua otsustusreegleid lihtsate, düsplastiliste nevi ja melanoomi eristamiseks. Kõigil juhtudel olid esialgsed andmed nelja geeni koopiate arvud.

Diferentsiaaldiagnostika otsustusreegli koostamise ülesanne on jagatud mitmeks etapiks. Esimeses etapis eristatakse melanoom ja nevus, võtmata arvesse nevuse tüüpi. Järgmises etapis koostatakse otsustusreegel lihtsate ja düsplastiliste nevi eraldamiseks. Lõpuks on viimases etapis võimalik luua "otsuste puu", et määrata düsplastilise nevus düsplaasia aste.

Selline nevi alamülesanneteks klassifitseerimise ülesande jaotus võimaldab saavutada ennustuste suure täpsuse igal etapil. Otsustuspuu koostamise sisendandmeteks on andmed nelja geeni koopiate arvu kohta melanoomdiagnoosiga patsientidel ja mittemelanoomdiagnoosiga patsientidel (patsiendid, kellel on erinevat tüüpi nevus - lihtne ja düsplastiline). Iga patsiendi kohta on geenikoopiate numbrid saadaval 30 raku kohta.

Seega võimaldab diagnoosi ennustamise ülesande jagamine mitmeks etapiks koostada ülitäpseid otsustusreegleid mitte ainult melanoomi ja nevi eristamiseks, vaid ka nevi tüübi määramiseks ja düsplaasia nevuse düsplaasia astme ennustamiseks. Konstrueeritud "otsustuspuud" on selge viis diagnoosi ennustamiseks geenikoopiate arvu põhjal ja neid saab hõlpsasti kasutada kliinilises praktikas healoomuliste, pahaloomuliste ja pahaloomuliste melanotsüütiliste nahakasvajate eristamiseks. Kavandatav täiendav diferentsiaaldiagnostika meetod on eriti oluline hiiglaslike kaasasündinud pigmenteerunud nevi ja düsplastiliste nevi väljalõikamisel pediaatrilistel patsientidel, kuna sellised patsiendid külastavad meditsiiniasutusi suure diagnostiliste vigade protsendiga. Kirjeldatud meetodi kasutamise tulemused on väga tõhusad, seda on soovitav kasutada pigmenteerunud nahakasvajate diagnoosimisel, eriti FAMM-i sündroomiga patsientidel.

hübridisatsiooni meetod kohapeal* (kohal, lat.) põhineb DNA või RNA võimel moodustada stabiilseid hübriidmolekule koos DNA/RNA sondidega otse fikseeritud kromosoomide ja interfaasiliste tuumade preparaatidel. Seda meetodit kasutades saate määrata peaaegu iga DNA või RNA järjestuse täpse asukoha otse rakus, raku tuumas või kromosoomides.

Hübridiseerimiseks. kohapeal mis tahes kudede või elundite rakkude sobivad tsütoloogilised või histoloogilised preparaadid, mis on valmistatud standardmeetodite kohaselt. Kliinilises tsütogeneetilises laboris kasutatakse kultiveeritud perifeerse vere lümfotsüütide, koorioni epiteeli tsütotrofoblasti rakkude, lootevee kultiveeritud ja kultiveerimata rakkude, abordimaterjalist erinevaid kudesid, samuti põseepiteeli ja vererakkude määrdeid.

hübridisatsiooni meetod kohapeal on praktilise tsütogeneetika jaoks eriti oluline mitteisotoopse variandi väljatöötamise tõttu, mis põhineb mitteradioaktiivsete modifitseeritud nukleotiididega märgistatud sondide kasutamisel. Mitteisotoopsetel hübridisatsioonivariantidel preparaatidel (eriti fluorestseeruvatel) on isotoopidega võrreldes mitmeid eeliseid: kõrge eraldusvõime, mis võrdub mikroskoobi lahutusvõimega (0,1 - 0,2 μm), tulemuste statistilise töötlemise vajadus, kiirus ja ohutus teadlaste tervisele.

Lisaks võimaldab erinevate tuvastussüsteemide abil tuvastatud erinevalt modifitseeritud sondide kombinatsioon üheaegselt määrata kahe või enama DNA järjestuse asukohta ühes rakus või ühel metafaasiplaadil. Ja fluorokroomidega märgistatud korduvate järjestuste kasutamine DNA-sondidena vähendab protseduuri aega 7–9 tunnini (klassikaline mitteisotoopide hübridisatsioon võtab aega kaks päeva, isotoobivariandid nädalast kuuni), mis on eriti oluline sünnieelse diagnoosi jaoks. Kasutamine KALA meetod tsütogeneetilises diagnostikas võimaldab see tuvastada kromosoomide struktuurseid ümberkorraldusi, tuvastada markerkromosoomide olemust ja analüüsida kromosoomikomplekti arvulisi rikkumisi nii metafaasi kromosoomidel kui ka interfaasilistes tuumades.

FISH-meetodi põhimõte

Keskmiselt KALA meetod seisneb hübridisatsioonireaktsioonis kunstlikult loodud DNA sondi ja selle komplementaarse tuuma DNA nukleotiidjärjestuse vahel. DNA molekul koosneb kahest spiraalselt ühendatud nukleotiidahelast ja hübridiseerumine on võimalik ainult siis, kui ahelad eralduvad. DNA nukleotiidahelate lahtiühendamiseks kasutatakse denatureerimist (edaspidiseks hübridiseerimiseks tuleb denatureerida nii uuritava proovi tuumades olev DNA kui ka DNA sond ise). Pärast denatureerimist hübridiseerub DNA sond oma komplementaarse nukleotiidjärjestusega ja seda saab tuvastada fluorestsentsmikroskoobiga.

Seega häälestamise protokolli üldvorm KALA saab esitada järgmisel kujul:

1. Histoloogilise või tsütoloogilise preparaadi valmistamine.
Histoloogilise preparaadi valmistamine toimub vastavalt standardskeemile: lõikamine, märgistamine, juhtmestik, valamine, mikrotoomia, lõikekoha asetamine slaidile ja deparafiini eemaldamine. Tsütoloogilise preparaadi valmistamisel kasutatakse spetsiaalseid sadestamislahuseid ja tsentrifuugimist, mis võimaldab saada kontsentreeritud rakususpensiooni.

2. Eeltöötlus (vajadusel).
Preparaati töödeldakse proteaasidega, et kõrvaldada hübridisatsiooni takistavate valkude olemasolu.

3. DNA-sondi rakendamine preparaadile ja sellele järgnev denatureerimine.
Sondi ja proovi DNA denatureerimiseks töödeldakse neid formamiidiga ja kuumutatakse temperatuurini umbes 85–90 °C.

4. Hübridiseerimine.
Pärast denatureerimist jahutatakse preparaat teatud temperatuurini (kliiniliste uuringute puhul 37°C) ja inkubeeritakse niiskes kambris mitu tundi (inkubatsiooni kestus on märgitud igas konkreetses protokollis). Praegu kasutatakse denatureerimiseks ja hübridiseerimiseks automaatseid hübridisaatoreid.

5. Pesemine.
Kui hübridisatsioon on lõppenud, tuleb sidumata sondid ära pesta, mis muidu looks tausta, mis raskendab FISH-i tulemuste hindamist. Loputamiseks kasutatakse tavaliselt tsitraati ja naatriumkloriidi (SSC) sisaldavat lahust.

6. Vastuvärvimine.
Fluorestseeruvate värvainete (DAPI - 4,6-diamidiin-2-fenüülindool; propiidiumjodiid) abil värvitakse kogu tuuma DNA.

7. Tulemuste analüüs fluorestsentsmikroskoobi abil. Rutiinseid toiminguid (vahaeemaldus, eeltöötlus, pesemine) saab automatiseerida.

* - Materjal on koostatud avatud allikatest pärineva teabe põhjal.