Rakukultuurid

Loomad

Viiruste märkimine järgmiste nähtuste põhjal

Arengu viivitus

surm, muutus

embrüo membraanid, RGA

CPP, naastude moodustumine, RIF, RGads, häired

Haigus, surm,

histoloogilised muutused

kudedes, kandmisel

Eraldatud viiruse tiitrimine; tööannuse valik.

Viiruse tiiter- viirust sisaldava materjali maksimaalne lahjendus, mille puhul on endiselt täheldatud oodatud mõju (CPE, RGA, looma surm).

Eraldatud viiruse tuvastamine neutraliseerimisreaktsioonides, RTGads, RSC, naastude moodustumise pärssimine jne diagnostiliste seerumitega. Viiruse tüüp (tüüp). määratakse viiruse spetsiifilise toime neutraliseerimisega sobiva immuunseerumi abil.

Märkus. Tiitrimisel ja viiruse tuvastamisel kasutatakse sama nähtust.

Viiruse kasvatamine

KABARDINO-BALKARIA RIIK

ÜLIÜLIK on oma nime saanud. Kh.M.BERBEKOVA

_________________________________________________________________

RNA-VIIRUSE JA DNA-VIIRUSE OMADUSED

INFEKTSIOONID
Metoodilised soovitused teoreetilise materjali õppimiseks

kursusel “Erameditsiiniline viroloogia”

välisüliõpilastele
Erialale 060101 – Üldmeditsiin

Naltšik - 2010

52,63 BBK73

Ülevaataja:

bioloogiateaduste kandidaat, Kabardi-Balkari osariigi mikrobioloogia, hügieeni ja kanalisatsiooni osakonna vanemlektor

põllumajanduse akadeemia

M.H. Peževa

Koostanud: Blieva Larisa Zaurbekovna

RNA viirus- ja DNA viirusnakkuste tunnused: Metoodilised soovitused välisüliõpilastele mõeldud kursuse “Erameditsiiniline viroloogia” teoreetilise materjali uurimiseks - Naltšik: Kab.-Balk. ülikool, 2010.- 48 lk.

Metoodilistes soovitustes esitatakse iga teema eesmärgid ja eesmärgid, teoreetiline teave eraviroloogia kohta ning nõuded üliõpilaste valmisoleku tasemele. Iga teema kohta antakse testiküsimused, situatsioonilised ülesanded ja soovitatava kirjanduse loetelu. Töö sisaldab privaatviroloogia põhimõistete ja definitsioonide sõnastikku.

Väljaanne on mõeldud erialal “Üldmeditsiin” 3. kursusel õppivatele välistudengitele.

UDC 576.858(075.8)

52,63 BBK73

Riiklik Ülikool, 2010

Kursust “Erameditsiiniline viroloogia” õpetatakse arstiteaduskonna 3. kursuse üliõpilastele ja see on distsipliini “Mikrobioloogia, viroloogia, immunoloogia” lahutamatu osa. Distsipliini auditoorsete tundide kogumaht on 184. Meditsiinilise viroloogia erialale on ette nähtud 11 tundi, millest 2 tundi loengutele ja 3 tundi laboritundidele. Need juhised on välja töötatud laboritööga seotud teemadel. Olemasolev laboritöökoda ei sisalda kogu vajalikku materjali nende teemade valdamiseks.

Välisüliõpilastel on 3 laboriklassis raske omandada suurt hulka teavet. Autor pidas sobivaks käesolevas väljaandes esitada lühikirjeldus viirusnakkuste tekitajatest ja nende poolt põhjustatud haiguste patogeneesist.

Iga teema kohta antakse kontrollküsimuste loend; situatsioonilised ülesanded, mis võimaldavad õpilastel hinnata oma valmisolekut käsitletava teema kohta; soovitatava kirjanduse loetelu.

Väljaande teatmeteos sisaldab tänapäeva viroloogias kasutatavate põhimõistete ja terminite ning levinumate viiruste ehituse kirjeldust. Terminoloogiasõnastik-teatmiku tähestikuline esitlusjärjekord on mugav kasutada.
TEEMA 1. RNA viirused

Sihtmärk– RNA-d sisaldavate viiruste struktuuriomaduste ja nende poolt põhjustatud haiguste patogeneesi uurimine.

Ülesanded:

1 – teadma iga patogeeni süstemaatilist asukohta;

2 – tunneb patogeenide morfoloogiat ja struktuuri;

3 – plaani järgi uurida kõigi nendest patogeenidest põhjustatud haiguste patogeneesi: a) nakkusallikas; b) nakkuse meetodid; c) nakkuse sissepääsu värav; d) patogeneesi etapid;

4 – tunneb haiguse laboratoorse diagnoosimise meetodeid;

5 – teadma spetsiifilist ennetust ja spetsiifilist teraapiat;

6 – oskama eristada erinevaid viirusi;

7 – oskab lahendada teemakohaseid olustikuülesandeid;

8 – valdab teemakohaste situatsiooniülesannete koostamist.
RNA viiruste omadused

1. tund

Perekond Orthomyxoviridae (kreeka keelest orthos - sirge, myxa - lima)

Perekond 1 – gripiviirus A, B

A-gripiviirus

B-gripiviirus

Perekond 2 – gripiviirus C

C-tüüpi gripiviirus

Gripi patogeneesi tunnused

Allikas – haige inimene, kandja; Nakatumise meetod on õhus. Inkubatsiooniperiood on 1-3 päeva. Prodromaalne periood on üldine halb enesetunne, nõrkustunne. Peamised sümptomid on kiire temperatuuri tõus 37,5-38 0 C-ni, millega kaasneb müalgia, nohu, köha, peavalud; Palavikuperioodi kestus on 3-5 päeva. A-gripiviirus on neurotroopne, seega on võimalik neurotoksikoosi teke. Tekib ülemiste hingamisteede katarr (kuiv köha, valu rinnus, riniit). Võimalik on hemorraagiline kopsupõletik ja kopsuturse, mille tagajärjeks on kiire surm. Harva ja sagedamini lastel esineb kõhu sündroom (kõhuvalu, iiveldus, oksendamine, kõhulahtisus).

Laboratoorsed diagnostikad

Ekspressdiagnostika. Viiruse antigeenid tuvastatakse uuritavas materjalis (nasofarüngeaalne eraldumine), kasutades immunofluorestsentsreaktsiooni (RIF) (otsene ja kaudne versioon) ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA). Materjalis on võimalik tuvastada viiruste genoomi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil.

Viroloogiline meetod. HeLa-2 rakukultuurid on nakatunud ja mikroskoopia 24 tunni jooksul näitab rakukultuuris peent fokaalset degranulatsiooni. Viiruste tuvastamine toimub ka "naastude", "värvitesti", hemaglutinatsioonireaktsiooni ja hemadsorptsioonireaktsiooniga. Viirused tuvastatakse nende antigeense struktuuri järgi. Kasutatakse komplemendi sidumise reaktsiooni, hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni ja viiruste bioloogilist neutraliseerimisreaktsiooni.

Seroloogiline meetod. Diagnoos tehakse 10–14-päevase intervalliga saadud antikehade tiitri neljakordse suurenemisega patsiendi paarisseerumites. Tsütopaatilise toime neutraliseerimise reaktsiooni seadistamisel märgitakse A-tüüpi seerumi lisamisel positiivne tulemus. Kasutatakse hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni, komplemendi sidumise reaktsiooni, immunofluorestsentsreaktsiooni ja ensüümi immuunanalüüsi. Spetsiifiline ennetus – nõrgestatud elusvaktsiin, tapetud vaktsiin, jagatud vaktsiinid, keemiline vaktsiin. Spetsiifiline ravi on gripivastane γ-globuliin.

Perekond Paramyxoviridae (ladina keelest para - umbes)

Perekond 1 – Respiroviirus – 1. ja 3. tüüpi paragripiviirused

Perekond 2 – Rubulaviirus – 2. ja 4. tüüpi mumpsi ja paragripiviirused

Perekond 3 – Morbilivirus – leetrite viirus

Perekond 4 – Pneumoviirus – respiratoorne süntsütiaalne viirus (RS viirus)

Paragripi patogeneesi tunnused

Allikas – haige inimene, kandja; Nakatumise meetod on õhus. Inkubatsiooniperiood – 3-6 päeva; täiskasvanutel - ülemiste hingamisteede katarri (larüngiit) kujul; lastel - see on raskem, sageli joobeseisundi sümptomitega; kõige sagedamini täheldatakse larüngotraheobronhiiti koos vale laudja tekkega; alla üheaastastel lastel – bronhioliit koos kopsupõletikuga.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Patsiendilt võetakse lima või hingamisteede heitvesi ja röga ning rakukultuur nakatatakse. Näidustus viiakse läbi viiruste tsütopaatilise toime ja hemaglutinatsioonireaktsiooni alusel. Identifitseerimisel kasutatakse hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni, komplemendi sidumise reaktsiooni ja neutraliseerimisreaktsiooni.

Seroloogiline meetod. Viiruse antigeenide tuvastamiseks ja antikehade tuvastamiseks paaris patsiendi vereseerumites viiakse läbi hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsioon, komplemendi sidumise reaktsioon ja neutraliseerimisreaktsioon (retrospektiivne diagnostika). Spetsiifiline ennetus ja spetsiifiline ravi puuduvad.

Mumpsi ehk mumpsi patogeneesi tunnused

Allikas on haige inimene; Nakatumise meetod on õhus. Inkubatsiooniperiood on 14-21 päeva. Haiguse tüüpiline vorm avaldub ühe- või kahepoolse parotiidina, millega kaasneb palavik. Parotiidsete süljenäärmete nakatumine toimub viiruse hematogeense leviku kaudu, mis toimub 3-5 päeva pärast esimeste sümptomite ilmnemist. Vireemia põhjustab viiruse levikut kogu kehas; võimalikud seroosne meningiit ja epididümoorhiit, mille tagajärjeks on viljatus. Immuunsus on tugev.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Uuritavat materjali (sülg, tserebrospinaalvedelik, uriin, vereseerum) kasutatakse kana fibroblasti rakukultuuri või kana embrüo nakatamiseks. Viirus tuvastatakse hemaglutinatsiooni inhibeerimisreaktsiooni, immunofluorestsentsreaktsiooni, neutraliseerimisreaktsiooni ja komplemendi sidumise reaktsiooni abil.

Seroloogiline meetod. Antikehad määratakse paaris patsiendi seerumites, kasutades ensüümi immuunanalüüsi, komplemendi sidumise reaktsiooni ja hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni. Spetsiifiline diagnostika – elusvaktsiin, sellega seotud vaktsiin (leetrite, mumpsi, punetiste vastu). Spetsiifilist ravi ei ole.

Leetrite patogeneesi tunnused

Allikas - haige inimene (tavaliselt 4-5-aastased lapsed); nakatumisviisid levivad õhus, harvemini kontaktis. Inkubatsiooniperiood on 8-15 päeva. Ägedad hingamisteede ilmingud (riniit, farüngiit, konjunktiviit, valguskartus, temperatuur 38,8-39 0 C). 3.-4. päeval tekib limaskestadele ja nahale makulopapulaarne lööve: esmalt näole, seejärel torsole ja jäsemetele. Päev enne lööbe tekkimist tekivad põskede limaskestale väikesed täpid, mida ümbritseb punane halo. Haigus kestab 7-9 päeva, lööve kaob jälgi jätmata. Eluaegne immuunsus.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Nad uurivad ninaneelu loputamist, lööbe elementide kraapimist, verd ja uriini. Viirus tuvastatakse patoloogilises materjalis ja nakatunud rakukultuurides, kasutades immunofluorestsentsreaktsiooni, hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni ja neutraliseerimisreaktsiooni. Iseloomustab mitmetuumaliste rakkude ja patogeeni antigeenide olemasolu neis.

Seroloogiline meetod. Seroloogiliseks diagnoosimiseks kasutatakse komplemendi sidumise reaktsiooni, hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni ja neutraliseerimisreaktsiooni. Spetsiifiline ennetus on nõrgestatud elusvaktsiin. Spetsiifilist ravi ei ole.

Respiratoorse süntsütiaalviiruse põhjustatud haiguste patogeneesi tunnused

Allikas on haige inimene; nakatumisviisid - õhus, kontaktis ja majapidamises. Patogeen tungib ülemiste hingamisteede epiteelirakkudesse, paljuneb, põhjustades nende surma, patoloogiline protsess levib alumiste hingamisteedesse, tekib sekundaarne immuunpuudulikkus, mis viib sekundaarsete bakteriaalsete infektsioonide tekkeni. Inkubatsiooniperiood on 3-5 päeva. Ägedate hingamisteede infektsioonide tunnused, seejärel trahheobronhiit, kopsupõletik. Immuunsus on lühiajaline, on võimalikud retsidiivid.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Rakukultuurid nakatatakse uuritava materjaliga (nasofarüngeaalsed eritised, kopsukude). Viiruste määramine toimub tsütopaatilise toime olemuse järgi - süntsüütiumi moodustumine ja viiruste tuvastamine - kasutades neutraliseerimisreaktsiooni, komplemendi sidumise reaktsiooni.

Seroloogiline meetod. Spetsiifilise antigeeni tuvastamiseks kasutatakse immunofluorestsentsreaktsiooni, ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (kiirdiagnostika).

Virusoskoopiline meetod. Mikroskoopiline (histoloogiline) uurimine paljastab bronhide limaskesta epiteelis mitmetuumalised rakud ja süntsütiumi. Spetsiifiline ennetus ja spetsiifiline ravi puuduvad.

Kontrollküsimused:

1. 
   Gripiviirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
2. 
   Paragripiviirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
3. 
   Mumpsi viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
4. 
   Leetrite viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
5. 
   Respiratoorse süntsütiaalviirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.

1. 
   Materjal (lööbe elementide kraapimine) saadi lapselt, kellel oli ägedad hingamisteede ilmingud, valgusfoobia, temperatuur 38,8-39,0 0 C ning makulopapulaarne lööve limaskestadel ja nahal. Kui rakukultuurid olid nakatunud, leiti mitmetuumalised rakud. Tuvastage patogeen.
2. 
   Materjal (ninaneelu voolus) saadi ägeda respiratoorse haiguse tunnustega lapselt. Patogeen tuvastati viroloogilise meetodi abil. Rakukultuuris täheldati süntsiumi moodustumist. Tehke kindlaks haiguse põhjustaja.

PerekondPicornaviridae

Perekond 1 – Enteroviirus – poliomüeliidi viirused, Coxsackie viirused, ECHO viirused

Poliomüeliidi patogeneesi tunnused

Allikas on haige inimene; nakkusviis - fekaal-oraalne; õhus liikuv; kontakti. Inkubatsiooniperiood on 7-14 päeva. Lastehalvatusel on 3 kliinilist vormi: paralüütiline, meningeaalne, abortiivne. Haigus algab kehatemperatuuri tõusu, üldise halb enesetunne, peavalu, oksendamine ja kurguvalu. Kõige sagedamini põhjustab paralüütilist vormi poliomüeliidi viiruse serotüüp 1. Immuunsus on eluaegne.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Uurimismaterjaliks on väljaheited, ninaneelu eritis ning surma korral pea- ja seljaaju tükid ning lümfisõlmed. Rakukultuurid nakatatakse uuritava materjaliga. Viiruste paljunemist hinnatakse nende tsütopaatilise toime järgi. Eraldatud viirus tuvastatakse (tüüpitakse), kasutades rakukultuuris neutraliseerimisreaktsioonis tüübispetsiifilisi seerumeid.

Seroloogiline meetod. Serodiagnoos põhineb paarispatsiendi seerumite kasutamisel, kasutades diagnostilise vahendina võrdlusviiruse tüvesid. Klasside IgG, IgA, IgM seerumi immunoglobuliinide sisaldus määratakse radiaalse immunodifusiooni meetodil vastavalt Mancinile. Spetsiifiline ennetus on laste massiline immuniseerimine suukaudse 3 serotüübi elusvaktsiiniga. Spetsiifilist ravi ei ole.

Coxsackie viiruste põhjustatud haiguste patogeneesi tunnused

Allikas on haige inimene; Nakatumise meetod on fekaalne-suuline, kontakt. Sageli täheldatakse infektsioone lastel. Tavaliselt täheldatakse teadmata päritoluga külmetuse või palaviku sümptomeid. Harvadel juhtudel tekivad rasked kahjustused - suuõõne ja jäsemete pemfigus, epideemiline pleurodüünia, perikardiit ja müokardiit. Ägedaid soolestiku viirushaigusi põhjustavad ainult A-rühma viirused.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Uurimismaterjaliks on väljaheide ja ninaneelu eritis. Nad nakatavad HeLa rakkude või ahvide neerude kultuure (Coxsackie B, Coxsackie A üksikud serotüübid) või imetavaid hiiri. Arvesse võetakse nakatunud hiirte patoloogiliste muutuste olemust. Viirused tuvastatakse hemaglutinatsiooni inhibeerimise testi, komplemendi sidumise testi, neutralisatsioonitesti ja ensüümi immuunanalüüsi abil. Spetsiifiline ennetus ja spetsiifiline ravi puuduvad.

ECHO viiruste põhjustatud haiguste patogeneesi tunnused

Allikas on haige inimene; Nakkusviis on fekaal-oraalne, õhu kaudu leviv. Viirused põhjustavad külmetushaigusi, nakkushaigusi, aseptilist meningiiti, mis on suhteliselt kerge, harvem tõusev halvatus ja entsefaliit, palavikuga seisund, millega kaasnevad leetrite sarnased lööbed.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Viirus isoleeritakse tserebrospinaalvedelikust, väljaheitest ja ninaneelu eritistest. Ahvide neerurakukultuurid nakatatakse ja identifitseeritakse hemaglutinatsiooni inhibeerimise testi, komplemendi sidumise testi, neutralisatsioonitesti ja ensüümi immuunanalüüsi abil.

Seroloogiline meetod. Antikehade tiitri suurenemine tuvastatakse vereseerumis, kasutades hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni, komplemendi sidumise reaktsiooni, neutraliseerimisreaktsiooni ja ensüümi immuunanalüüsi. Spetsiifiline ennetus ja spetsiifiline ravi puuduvad.
PerekondTogaviridae

Perekond 1 – Rubivirus – punetiste viirus

Punetiste patogeneesi tunnused

Allikas – haige inimene, kandja; nakkuse meetodid - õhu kaudu leviv, transplatsentaarne. Haigusel on 2 vormi: 1 - omandatud. Inkubatsiooniperiood on 11-24 päeva. Haigus algab kerge temperatuuri tõusuga ja kergete katarraalsete sümptomitega, konjunktiviidiga, samuti emakakaela tagumise ja kuklalümfisõlmede suurenemisega. Seejärel ilmub kogu kehas makulopapulaarne lööve. Immuunsus on tugev.

2 – kaasasündinud – aeglane viirusinfektsioon, mis areneb loote emakasisese transplatsentaarse infektsiooni tagajärjel. Seda haigust iseloomustavad kae, kurtuse ja südamerikete teke ning muud arenguhäired. Pimedus koos kurtuse ja kesknärvisüsteemi kahjustusega viib vaimse alaarenguni. Immuunsus on uskumatu.

Laboratoorsed diagnostikad

Viroloogiline meetod. Viirus isoleeritakse nina ja neelu limaskestalt, verest, uriinist, harvemini väljaheitest, aga ka surnud laste siseorganitest. Tundlikud rakud nakatatakse uuritava materjaliga ja viirused on näidustatud tsütopatogeensete viiruste sekkumise või tsütopaatilise toime tuvastamise alusel.

Seroloogiline meetod. Antikehade tuvastamiseks kasutatakse neutraliseerimisreaktsiooni, komplemendi sidumise reaktsiooni, hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi. Diagnostilise tähtsusega on antikehade tiitrite neljakordne või enam tõus haiguse dünaamikas, samuti spetsiifilise IgM määramine, mis viitab hiljutisele haigusele või haigusele uurimise ajal. Spetsiifiline ennetus – elusvaktsiin, sellega seotud vaktsiin. Spetsiifilist ravi ei ole.

Perekond Rhabdoviridae

Perekond 1 – Lessavirus – marutaudiviirus

Marutaudi patogeneesi tunnused

Allikad - metsik marutaudi - rebased, hundid, närilised, nahkhiired, linna marutaudi - koerad, kassid; nakkusmeetodid - kontakt hammustuste kaudu, harvem - kahjustatud naha liigse süljeerituse korral, nahkhiirtega asustatud koobastes, mõnikord ka toiduga, on aerogeenne võimalik. Haige looma süljega kahjustatud väliskesta sattunud viirus paljuneb ja püsib sissetoomiskohas. Seejärel levib see mööda perifeersete närvide aksoneid, jõudes aju- ja seljaaju rakkudeni, kus see paljuneb. Babes-Negri kehasid leidub aju neuronite tsütoplasmas. Rakud läbivad degeneratiivseid muutusi. Pärast paljunemist liigub viirus ajust tsentrifugaalneuronite kaudu erinevatesse kudedesse, sealhulgas süljenäärmetesse. Inkubatsiooniperiood on 10 päeva kuni 3 kuud, mõnikord kuni aasta. Haiguse alguses - halb enesetunne, hirm, ärevus, unetus, seejärel areneb neelu- ja kõrilihaste reflekserutuvus ja spasmilised kokkutõmbed. Krambid intensiivistuvad, kui proovite juua, kui näete vett, ereda valguse, müra tõttu. Arenevad hallutsinatsioonid ja haiguse lõpus - jäsemete lihaste ja hingamise halvatus. Harvemini areneb haigus ilma agitatsiooni ja hüdrofoobiata; Tekivad halvatus ja süljeeritus. Suremus – 95%. Infektsioonijärgset immuunsust ei ole uuritud.

Laboratoorsed diagnostikad

Virusoskoopiline meetod. Surmajärgne diagnoos hõlmab Babes-Negri kehade tuvastamist sõrmejälgede määrdumisel või ajukoe lõikudel. Babes-Negri kehad tuvastatakse värvimismeetoditega vastavalt Romanovsky-Giemsa, Mann, Turevich, Muromtsev jne.

Viroloogiline meetod. Patoloogiline materjal süstitakse intratserebraalselt valgetesse hiirtesse. Viiruste identifitseerimiseks kasutatakse ensüümi immuunanalüüsi, samuti neutraliseerimisreaktsiooni hiirtel, kasutades viiruse neutraliseerimiseks marutaudi immunoglobuliini.

Seroloogiline meetod. Antikehad määratakse patsientidel, kasutades komplemendi sidumise reaktsiooni ja ensüümi immuunanalüüsi. Spetsiifiline ennetus ja ravi – inaktiveeritud Fermi vaktsiin, geneetiliselt muundatud vaktsiin. Immuniseerige inimesi, keda hammustavad marutaudikahtlusega loomad. Sel juhul moodustub inkubatsiooniperioodil aktiivne immuunsus. Mitme hammustuse korral tekib marutaudi immunoglobuliini manustamisega passiivne immuunsus.

Perekond Retroviridae

Perekond 1 – Lentiviirus – HIV

HIV-nakkuse patogeneesi tunnused

Allikas – haige inimene, kandja; nakkuse meetodid - seksuaalne, parenteraalne, transplatsentaarne. HIV-nakkuse etapid:

1 – peiteaeg – 2-4 nädalat;

2 – esmaste ilmingute staadium: äge palavik, lümfadenopaatia, kõhulahtisus, staadium lõpeb asümptomaatilise faasiga, heaolu taastumine, võib kesta aastaid;

3 – sekundaarsete haiguste staadium, mis väljendub hingamisteede, närvisüsteemi, seedetrakti kahjustustes ja pahaloomuliste kasvajate esinemises erinevates kombinatsioonides;

4. etapp – AIDS ise, mida iseloomustavad kahheksia, püsiv kõhulahtisus, adünaamia, aneemia, dementsus, kõigi immuunnäitajate langus surmaga lõppeva tulemusega.

Laboratoorsed diagnostikad

Seroloogiline meetod. Diagnoosi kinnitamiseks määratakse HIV-1-s antikehad valkude gp41, gp120, gp160, p24 ja HIV-2-s valkude gp36, gp105, gp140 vastased antikehad. HIV-antikehad tekivad 2-4 nädalat pärast nakatumist ja neid tuvastatakse HIV-nakkuse ja AIDS-i kõikides staadiumides. Iga positiivse testi korral tehakse tulemuste kinnitamiseks immunoblotanalüüs. Kasutatakse ka PCR-i. Spetsiifiline ennetus ja spetsiifiline ravi puuduvad.

Kontrollküsimused:

1. 
   Poliomüeliidi viirus: haiguse taksonoomia, struktuur, patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
2. 
   Coxsackie viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
3. 
   ECHO viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
4. 
   Punetiste viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
5. 
   Marutaudiviirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.
6. 
   Inimese immuunpuudulikkuse viirus: taksonoomia, struktuur, haiguse patogenees, laboratoorne diagnoos, spetsiifiline ennetamine ja ravi.

1. 
   Materjal uurimistööks saadi (nina ja neelu limaskestalt pesemine) kergete katarraalsete sümptomitega ning suurenenud tagumiste kaela- ja kuklalümfisõlmedega lapselt. Nakatati rakukultuur, milles pärast inkubeerimist tuvastati CPE. Tuvastage patogeen.
2. 
   Uurimismaterjal (väljaheide) saadi lapselt, kellel esines üldise halb enesetunne, peavalu ja palavik. Nad inokuleerisid rakud kultuuri, milles pärast inkubeerimist leiti eetri suhtes resistentseid viirusosakesi. Tuvastage patogeen.

Kirjandus

1. 
   Suur meditsiiniterminite sõnastik / Koost. Fedotov V.D. – M.: ZAO Tsentrpoligraf, 2007.
2. 
   Vorobjov A.A. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: õpik. – M.: MIA, 2004.
3. 
   Vorobjov A.A., Bykov A.S. Meditsiinilise mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia atlas. – M.: MIA, 2003.
4. 
   Vorobjov A.A., Krivošein Yu.S., Širobokov V.P. Meditsiiniline ja sanitaarmikrobioloogia. – M.: ASADEMA, 2003.
5. 
   Golubev D.B. Rakukultuuride kasutamise juhend viroloogias. – L., 1986. Elektrooniline õpik.
6. 
   Krasilnikov A.P., Romanovskaja T.R. Mikrobioloogiasõnastik-teatmik./ - 2. tr., lisa. ja töödeldud – Mn.: “Asar”, 1999.
7. 
   Korotyaev A.I., Babichev S.A. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: mee õpik. ülikoolid – 3. väljaanne, rev. ja täiendav – Peterburi: SpetsLit, 2002.
8. 
   Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: õpik / Toim. A.A. Vorobjova - M.: Meditsiiniinfo Agentuur, 2004.
9. 
   Üldmeditsiiniline viroloogia / N.S. Goryachkina ja teised; toimetanud N.S. Goryachkina, L.I. Kafarskaja. – Rostov n/d: Phoenix, 2007.
10. 
    www. infektsioonid.ru/rus/all/mv b ajakirjad.shtml

Peamised viirushaiguste diagnoosimise meetodid on viiruste kasvatamine ja tuvastamine.

Haiguse viirusliku etioloogia tõestamiseks on vajalik: viiruse isoleerimine haige kala kehast, selle kandmine rakukultuurile või tundlikule kalale, haiguse paljunemine sama või sugulasega tervetel kaladel. liigid, sama viiruse korduv eraldamine katseloomadest.

Viiruste tuvastamiseks kasutatakse mitmeid üksteist täiendavaid meetodeid: viiruse elektronmikroskoopia, selle füüsikalis-keemiliste omaduste uurimine, iseloomulike morfoloogiliste muutuste tuvastamine nakatunud rakkudes ja sümptomite tuvastamine nakatunud loomadel, mitmesugused immunoloogilised meetodid.

Viirused eraldatakse peamiselt ühekihilistel primaarsetel või pidevatel rakukultuuridel, valides igal juhul välja kultuurid, mis on antud viiruse suhtes tundlikud. Kalarakkude primaarsete kultuuride saamiseks kasutatakse kõige sagedamini emase karpkala või ristikarpkala sugunäärmeid. Sugunäärmed peaksid olema Kiselevitši skaala järgi II või II-III küpsusastmes. Sellised sugunäärmed ei sisalda palja silmaga nähtavaid mune. Vastasel juhul mõjutab munade sisu rakkude kasvu negatiivselt. Karpkala ja ristikarpkala sugunäärmete rakukultuurid valmistatakse heakskiidetud meetodil.

Pidevate kultuuridena kasutatakse enim järgmisi rakuliine: FHM - rasvatihase sabavarre kudedest; RTG - vikerforelli sugunäärmetest; EPC – rõugekasvudest karpkala nahal. Neid liine hoitakse kalahaiguste uurimiseks spetsialiseeritud laborites veterinaar- ja kalandusuuringute instituutides, kus neid saab tellida ja vastu võtta.

Hästi uuritud viirushaiguste diagnoosimisel uuritakse elundeid ja kudesid, kuhu haigustekitaja on koondunud.

Kalahaiguste korral, mille kohta teave on ebapiisav, tehakse viroloogiline uuring enim mõjutatud elunditest. Naha ja lõpuste kaabitsad, nende elundite tükid koos limaga asetatakse steriilsetesse viaalidesse 2-3 ml steriilse füsioloogilise või puhverlahusega. Proovid siseorganitest võetakse rangelt aseptilistes tingimustes.

Juhtudel, kui materjali ei ole võimalik kiiresti uurida, hoitakse seda külmkapis temperatuuril kuni 5 °C mitte kauem kui üks päev. Külmutatud materjali saab pikemat aega säilitada.

Uurimiseks mõeldud patoloogiline materjal purustatakse homogenisaatoris või jahvatatakse portselanmördis kvartsliivaga. Purustatud kudedest valmistatakse Hanksi, Earle'i, puhver- või soolalahuses 10% suspensioon ja tsentrifuugitakse 10-15 minutit kiirusel 2000-3000 p/min, supernatant imetakse pipetiga ära ja asetatakse steriilsetesse viaalidesse. Kui suspensioon ei ole steriilne, filtreeritakse valmistatud materjalid läbi membraanfiltrite pooride läbimõõduga 0,2-0,45 μm või töödeldakse antibiootikumidega (penitsilliin 1000 U/ml ja streptomütsiin 1000 μg/ml).

Steriilses destilleeritud vees valmistatakse soole sisust 20% suspensioon ja tsentrifuugitakse 10-15 minutit kiirusel 2000 p/min. Supernatanti tsentrifuugitakse uuesti kiirusel 4000-5000 p/min 30 minutit. Seejärel aspireeritakse supernatant steriilsesse viaali ja töödeldakse antibiootikumidega. 1 ml kohta lisada 1000 μg/ml streptomütsiini ja 1000 U/ml penitsilliini. Segu hoitakse 2-3 tundi toatemperatuuril. Kõiki materjale testitakse bakterite steriilsuse suhtes MPB ja MPA-ga nakatamise teel. Valmistatud materjalid kasutatakse koheselt tööks või äärmisel juhul säilitatakse külmutatult (temperatuuril miinus 20°C).

Rakukultuuri nakatumine. Nakatumiseks kasutatakse torusid, millel on hea raku monokiht või eksplantaadi ümber kasvutsoon. Toitekeskkond imetakse välja ja igasse katseklaasi lisatakse 0,2-0,3 ml uuritavat suspensiooni. Samal ajal lisatakse katseklaasidesse 0,8-0,9 ml toitekeskkonda 2-3% seerumiga.

Igast proovist valmistatud materjali kasutatakse koekultuuri nakatamiseks 4-6 katseklaasis. Igast uuringute seeriast jäetakse kontrolliks sama palju katseklaase, millele lisatakse 1 ml toitekeskkonda. Katseklaasid jäetakse 1-2 tunniks toatemperatuurile, et viirus rakkudele adsorbeeruks, seejärel imetakse pipetiga supernatant ära ja lisatakse säilitustoitekeskkonda esialgsele mahule.

Nakatunud ja kontrollrakukultuure inkubeeritakse temperatuuril 22-26°C ning neid uuritakse iga päev väikese suurendusega mikroskoobi all, et tuvastada rakkude morfoloogilisi muutusi. Raske raku degeneratsiooni korral imetakse kultuurivedelik välja ja tehakse passaažid ning tsütopatogeense efekti (CPE) puudumisel tehakse kaks järjestikust passaaži. Selleks kasutatakse kultuurivedelikku koos korduval külmutamisel ja sulatamisel hävinud rakufraktsiooniga. Värskete kultuuride nakatamiseks kasutage tsentrifuugitud rakumassi supernatanti. CPE-d pärast kolmandat passaaži võetakse arvesse viirusliku toimeaine spetsiifilise toimena.

Raku monokihi kahjustuse astet hinnatakse 4-ristisüsteemi abil; " + - kahjustused kuni 25%, " + + " - kuni 50%, "+ + +" - kuni 75% ja " + + + + " - kuni 100% monokihist.

Mõnede kalade viirushaiguste korral tekivad inklusioonikehad erinevate elundite ja kudede rakkudes (tsütoplasmaatilises tuumas). Viirusesulgude uurimise materjaliks on nakatunud koekultuurid, kaabitsad ja jäljendimäärded elunditest ja kudedest; enne värvimist fikseeritakse need materjalid üldtunnustatud meetoditel, kasutades Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy vedelikke või 10% lahust neutraalne formaldehüüd.

Viiruse lisandid värvitakse erinevate meetoditega: Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa jne.

Viiruse tiitrimine- viiruse aktiivsuse kvantitatiivne määramine. Viiruse tiitrit väljendatakse viiruse suspensiooni mahuühikus sisalduvate nakkuslike ühikute arvuna. Viiruse nakkav ühik on annus, mis põhjustab nakatumise 50% viirusega nakatunud tundlikest objektidest. Seda viiruse annust nimetatakse nakkavaks ja tähistatakse ID 50-ga.

Rakukultuure kasutatakse peamiselt kalaviiruste tiitrimisel tundlike objektidena. Rakukultuuri tiitrimine toimub vastavalt viiruste tsütopatogeensele toimele. Sel juhul nimetatakse ID 50 koe tsütopatogeenseks annuseks (TCD 50) ja viiruse tiitrit väljendatakse TCD 50 kogusena 1 ml viirussuspensioonis. Viiruse tiiter määratakse lõpliku lahjendusmeetodiga. Selle meetodi kohaselt süstitakse tundlikesse rakukultuuridesse teatud kogus viirussuspensiooni järjest suurenevates lahjendustes ja, võttes arvesse iga süstimise tulemust positiivsena (kui on CPD) või negatiivsena, kui CPP puudub, tiitritakse. lõpp-punkt arvutatakse - 1 TCD 50.

Selge CPE-d andvate viiruste tiitrimiseks kasutatakse ka naastude meetodit. Sel juhul valatakse viirusega nakatunud rakkude monokiht toitesöötme seguga agariga, et vältida viiruse ülekandumist teistele rakkudele, mis on algselt nakatunud rakkudest oluliselt eemaldatud, ja et oleks võimalik nakatada algselt nakatunud rakkudest. naastude infektsioonikolded).

Iga naast pärineb ühest nakkuslikust ühikust, mida nimetatakse PFU-ks (plaque-forming unit), ja viiruse tiitrit väljendatakse PFU-de arvuna suspensiooni mahuühiku kohta.

Neutraliseerimisreaktsioon(RN) rakukultuuri kohta.

Reaktsioon põhineb antigeeni seondumisel homoloogse antiseerumi antikehadega. Reaktsiooni kasutatakse patogeenide tuvastamiseks viirusliku etioloogiaga haiguste diagnoosimisel. See võimaldab teil määrata tundmatu viiruse antigeeni teadaolevate antikehade või teadaoleva (standardse) antigeeni abil – tundmatud antikehad haigete või tervenenud kalade seerumis.

Isoleeritud viiruse määramine neutraliseerimisreaktsioonis viiakse läbi nendega homoloogsete antigeenide (viiruste) diagnostiliste hüperimmuunsete antiseerumite (antikehade) abil.

Hüperimmuunsed antiseerumid saadakse laboriloomade (näiteks küüliku) nakatamisel teadaolevate kalahaigusi põhjustavate viirustüvedega. Saadud antiseerumites määratakse spetsiifiliste antikehade tiitrid. Tööks võtke kõrge tiitriga antikehi sisaldavad antiseerumid.

Reaktsiooni järjekord.

1. Normaalse ja hüperimmuunse seerumi inaktiveerimine kuumutamisel 56 o C juures 30 minutit.

2. Reaktsiooni koostisosade lahjenduste valmistamine. Antigeen ja seerum lahjendatakse ilma seerumita ja antibiootikumideta toitesöötmega, alates 1:5, 1:50, 1:500 ja kuni saadakse lahjendus, mis sisaldab vähem kui 1 TCD 50 / 0,2 ml. Hüperimmuunseerumit lahjendatakse vahekorras 1: 2 või 1: 5. Kui tiiter on madal, kasutatakse seerumit lahjendamata kujul. Tavalist seerumit lahjendatakse samamoodi nagu hüperimmuunset seerumit.

3. Reaktsiooni seadistamine. Kolm rida steriilseid torusid asetatakse riiulisse. Esimesse ritta valatakse lahjendatud hüperimmuunseerum, teise lahjendatud tavaline seerum ja kolmandasse toitekeskkond. Iga koostisosa lisatakse 0,5 ml mahus.

Viiruse valmistatud lahjendused kantakse 0,5 ml kogustes iga kolme rea vastavatesse katseklaasidesse ja iga lahjenduse I viirus kantakse eraldi pipetiga, alustades suurimast lahjendusest. Nii saadakse igas katseklaasireas järjestikused 10-kordsed viiruse lahjendused: 10-1, 10-2 jne.

Seerumite toksilisuse kontrollimiseks lisage eraldi katseklaasi 0,5 ml hüperimmuunseerumi ettevalmistatud lahjendust ja seejärel lisage võrdne kogus toitainekeskkonda. Sama tehakse ka tavalise seerumiga.

Segudega katseklaase loksutatakse põhjalikult ja hoitakse 1 tund toatemperatuuril. Seejärel nakatatakse rakukultuur iga viiruse lahjendusega (0,2 ml tuubi kohta) hüperimmuunse normaalse seerumi ja toitainekeskkonnaga, igas 4 rakukultuuri katsutit. Samal ajal paigutatakse kontrollid kasutatud rakkude toksilisuse ja kontrollrakukultuuri proovide kohta.

Rakukultuuriga torusid inkubeeritakse termostaadis antud viiruse paljundamiseks optimaalsel temperatuuril ja neid uuritakse iga päev väikese suurendusega mikroskoobi all, et tuvastada viiruse CPE. Tulemused kantakse tabelisse (tabel 11).

Viiruse tiitrit väljendatakse viiruse suspensiooni mahuühikus sisalduvate nakkuslike ühikute arvuna. Leidke neutraliseerimisindeks (IN). See vastab maksimaalsele ID50 kogusele, mida saab neutraliseerida hüperimmuunseerumiga. IN arvutatakse järgmise valemi abil: logIN = logT 1 -lgT 2, kus T 1 on viiruse tiiter normaalse seerumi juuresolekul; T 2 - viiruse tiiter hüperimmuunseerumi juuresolekul. IN väärtus leitakse antilogaritmide tabelist. Üldiselt aktsepteeritakse, et IN väärtus kuni 10 on negatiivne, 10 kuni 49 on kaheldav ja 50 või rohkem on positiivne tulemus.

Reaktsiooni tulemusi võib pidada usaldusväärseks ainult siis, kui hüperimmuunseerumi spetsiifilist neutraliseerivat aktiivsust testitakse. Selleks määratakse esmalt neutraliseerivate antikehade tiiter selles seerumis või selle neutraliseerimisindeks reaktsioonis homoloogse viirusega.

Rabdoviiruste eraldamine naastude meetodil. See meetod on spetsiifiline, seda kasutatakse karpkala ja forelli rabdoviiruste isoleerimiseks, esialgseks tüpiseerimiseks ja selekteerimiseks spetsiifiliste immuunseerumite juuresolekul viiruse tuvastamiseks.

Ümmargused kolooniad (naastud) moodustuvad rakukultuurides agarkatte all viiruse juuresolekul uuritavas materjalis.

Aseptilistes tingimustes kogutakse Pasteuri pipetiga neeru-, maksa-, põrna ja kõhuõõnde kude, mis viiakse pudelisse, mis sisaldab 500 RÜ (mcg)/ml antibiootikume vahekorras 1:10. Inkubeeritakse 60-90 minutit temperatuuril 18-22 °C, seejärel tsentrifuugitakse 10 minutit kiirusel 2-3 tuhat pööret minutis. Supernatant lahjendatakse toitainekeskkonnaga 1:10 (lahjendus 1:100). Rakukultuuride nakatamiseks kasutatakse mõlema lahjenduse supernatantvedelikke.

Uuringu jaoks valitakse 3-päevane pidev rakukultuur, mida kasvatatakse täpselt määratletud ühekihilise kihiga madratsites kiirusega 2 madratsit iga patoloogilise materjali lahjenduse kohta ja 2 madratsit kontrolliks. Toitekeskkond eemaldatakse pudelitest ja lisatakse 2 ml looteseerumita söödet. Seejärel lisatakse 0,2 ml uuritavat materjali ja lastakse 60 minutit viirust adsorbeerida kala nakatavate viiruste jaoks optimaalsel temperatuuril (karpkala viirustel - 24-26°C ja forelliviirustel - 16-18°C).

Kontroll asetatakse 2 madratsisse, millest igaüks sisaldab 0,2 ml rakukultuure, mis sisaldavad 100 TCD 50 / ml teadaolevat viirust, ja 2–0,2 ml viiruseta toitesöötmesse.

60 minuti pärast eemaldatakse vedelik pudelitest. Piki monokihi vastas olevat seina lisage 50 ml pudelisse 50 ml pudelisse temperatuurini 40-42 °C kuumutatud agarkatet, mis on kuumutatud temperatuurini 40-42 °C (HCV viiruse eraldamisel - mitte üle 38 °C). Madratsid keeratakse ühekihiliseks ja kaetud musta paberiga. 15-20 minuti pärast viiakse madratsid inkubeerimiseks uuritavate viiruste jaoks optimaalsel temperatuuril. Madratsid asetatakse agarkattega ülespoole. Kui viirus on teadmata, hoitakse kultuure kahel temperatuuril – 14-18 ja 22-24°C.

Nakatunud rakukultuure vaadeldakse valgel taustal. Kui uuritavas rakukultuuris on viirus, tekivad kõigepealt kultuuri roosakas-mati taustal läbipaistvad täpid. Seejärel suureneb nende suurus, moodustades ümmargused läbipaistvad kolooniad - naastud, mille olemasolu näitab rabdoviiruste esinemist patoloogilises materjalis.

Võtke Pasteuri pipetiga tükk naastu kahjustatud ja mõjutamata osade piirilt, nii et mitte ainult agarikiht, vaid ka rakukiht oleks kaasatud. Valitud tükk asetatakse katseklaasi koos 1 ml kasvusöötmega, külmutatakse temperatuuril miinus 20 °C ja hoitakse 60 minutit. Suure hulga naastude korral (kogu rakukiht on läbipaistev) korratakse uuringuid lahjendustes 10 -3 ja 10 -4.

3-8 mm läbimõõduga karpkala rabdoviiruse naastud EPC ja FHM pideval kultuuril, mida inkubeeritakse temperatuuril 24-26°C, tekivad 4.-7. päeval.

Naastude puudumisel ja CPD esinemisel rakukultuurides tehakse täiendavaid uuringuid viirust sisaldava kultuurivedelikuga lahjendustes 10-2-10-3 (2-3 passaaži). Täiendavad meetodid viiruste tuvastamiseks hõlmavad: fluorestseeruvate antikehade meetodit; viiruse tundlikkuse määramine kloroformi, eetri, pH väärtuse, kuumutamise suhtes; elektronmikroskoopiline viiruste morfoloogia uuring.

15.1. Mikrobioloogiliste ja immunoloogiliste laborite omadused

Kogu töö mikroobidega toimub laborites, mis olenevalt põhiülesannetest võivad olla uurimistööd, diagnostika või tootmine.

Tervishoiusüsteem hõlmab:

Üld- või eritüüpi (biokeemilised, bakterioloogilised, immunoloogilised, tsütoloogilised jne) kliinilised diagnostikalaborid, mis on osa haiglatest, kliinikutest, ambulatooriumist ja muudest meditsiini- ja ennetusasutustest;

riikliku sanitaar- ja epidemioloogilise järelevalve (GSN) bakterioloogilised laborid;

GSN-i sanitaar- ja bakterioloogilised laborid;

Riigivalitsuse sanitaar- ja keemialaborid;

Tsentraalsed (TsNIL), probleem-, tööstus-, ülikoolide õppelaborid;

Spetsialiseeritud laborid (eriti ohtlikud infektsioonid jne).

Praegu on laborid ja suuremad laboriasutused (osakonnad, instituudid, tootmisettevõtted) reeglina spetsialiseerunud ja töötavad ühe või teise mikroobirühmaga.

Nad töötavad viirustega viroloogialaborites, millel on vastav aparatuur ja kus kasutatakse spetsiaalseid uurimismeetodeid. Seal on mükoloogilised ja protozooloogilised laborid. Spetsialiseeritud loodus

Samuti omandavad bakterioloogilised laborid, kus töö keskendub teatud bakterirühmadele, näiteks rahketsiaalne, tuberkuloos, leptospiroos, anaeroobne jt. Immunoloogilisi uuringuid tehakse immunoloogilistes laborites, kuigi teatud tüüpi uuringuid saab teha ka mikrobioloogilised laborid, näiteks nakkushaiguste serodiagnostika.

Laboratoorsed tööd patogeensete mikroobidega tehakse spetsiaalselt varustatud laborites, mis tagavad töötingimused ja ettevaatusabinõud, välistades personali nakatumise ja mikroobide lekkimise väljaspool laborit.

Laboritöötajatele ja ümbritsevale elanikkonnale erineval määral ohtlike mikroobidega töötingimuste selge reguleerimise vajadus viis mikroobide klassifikatsiooni väljatöötamiseni, jagades nad 4 rühma vastavalt nende bioloogilise ohu astmele (WHO). klassifikatsioon). Venemaal jagatakse patogeensed mikroobid vastavalt WHO soovitustele ka 4 rühma: 1. rühm - eriti ohtlike infektsioonide patogeenid; 2. rühm - väga nakkavate inimeste epideemiliste haiguste patogeenid; 3. rühm - nakkushaiguste patogeenid, mis on klassifitseeritud iseseisvatesse nosoloogilistesse rühmadesse; 4. rühm - oportunistlikud mikroobid - oportunistlike infektsioonide tekitajad. Venemaal kasutusele võetud mikroobirühmade numeratsioon erineb vastupidises järjekorras WHO klassifikatsioonist, kus 1. rühma kuuluvad madalaima patogeensusega mikroobid ja 4. rühma kuuluvad eriti ohtlikud.

Vastavalt mikroobide jaotusele rühmadesse bioloogilise ohu astme järgi jagunevad laborid ka kategooriatesse. WHO nomenklatuuri järgi jagunevad mikrobioloogilised laborid kolme kategooriasse:

Baas- (põhi- või üldtüüpi) laborid, mida töö eripärast tulenevalt on võimalik varustada erinevate kaitseseadmetega;

Turva- (isoleeritud) laborid ja erirežiimiga laborid (maksimaalne isolatsioon).

Töö ohutuse kõigi kategooriate laborites tagab laboris töötamise rutiinist ja reeglitest kinnipidamine, laboriruumidele ja nende sisseseadele esitatavate nõuete järgimine ning laborite varustamine vastavate seadmetega.

töötajate terviseseisundi meditsiiniline jälgimine, personali koolitus ja koolitus laboriohutuse protseduuride alal.

15.2. Mikrobioloogiliste ja immunoloogiliste laborite seadmed

Laboratooriumi põhiruumid peavad olema avarad, et tagada laboritööde ohutu läbiviimine. Seintel, lagedel ja põrandatel peab olema sile, kergesti puhastatav, vedelikke mitteläbilaskev ja laboris tavaliselt kasutatavate desinfektsioonivahendite suhtes vastupidav pind. Töölaudade pind peab olema veekindel, vastupidav desinfektsioonivahenditele, hapetele, leelistele, orgaanilistele lahustitele ja mõõdukale kuumusele. Laborimööbel peab olema vastupidav. Laudade ja mööbli vahele jääv ruum peaks olema puhastamiseks kergesti ligipääsetav. Laboris peab olema autoklaav jäätmete desinfitseerimiseks.

Põhilised laboriseadmed peavad piirama või vältima mikrobioloogide kokkupuudet nakkusohtlike materjalidega ning olema valmistatud vastupidavatest materjalidest, vedelikke mitteläbilaskvatest ja korrosioonikindlatest. Seadmed peavad olema projekteeritud ja paigaldatud nii, et neid oleks lihtne puhastada, desinfitseerida ja kontrollida.

Laboratoorium on varustatud mikroskoobi, autoklaavi, termostaatide, kuivatus- ja steriliseerimiskappide, vadaku koagulatsiooniaparaadi, destilleerija, tsentrifuugide, laborikaalude, pH-meetri, FEC-i, magnetsegisti ja pesuvanniga.

Labori tööruumid peavad olema varustatud külma ja sooja veevarustuse, elektri, vaakumi, hapniku, kõrgsurveõhu jms. Mõned kontorid on varustatud kastide ja tõmbekappidega.

Kohustuslike ruumide hulka kuuluvad soole- ja piisknakkuse laboratooriumid, sanitaar-bakterioloogilised, seroloogilised, samuti abiruumid: söötmete ettevalmistamine, pesemine, steriliseerimine (puhas ja must), registreerimine, laoruumid, töötajate vannituba, vivaarium. Mikroorganismide veo testimispunktidega laborites varustatakse kogumiseks lisaks vastuvõtuala, ravituba ja tualetid.

materjalist. Ruumid paiknevad nii, et määrdunud ja puhtad voolud ei ristu ega puutu kokku.

Kõrge turvalisusega laborite ruumide puhul tuleb järgida samu nõudeid, mis on ette nähtud baaslaborile. Lisaks tuleks seda tüüpi labor eraldada nendest hooneosadest, kus töötajate liikumine ei ole piiratud. Kätepesuvahendid peavad olema varustatud jalgpedaali või küünarnukist juhitava mehhanismiga vee avamiseks. Aknad peavad olema suletud ja pitseeritud. Laboriruumide sissepääsuuksed peavad olema isesulguvad ja tabalukustatavad. Väljatõmbeventilatsioon on konstrueeritud nii, et madalaim rõhk tekib ruumides, kus on kõrgeim nakkusoht. Sel juhul toimub õhu liikumine abiruumidest põhitööruumi suunas. Väljatõmbeõhk pääseb keskkonda alles pärast filtreerimist läbi bakterifiltrite. Kõrge turvalisusega laborite varustamisel seadmetega juhindutakse põhilaborite jaoks välja töötatud soovitustest, millele lisandub, et kogu neis leiduva nakkusohtliku materjaliga töö toimub kaitsekastides. Maksimaalselt isoleeritud laborite režiimis on mitmeid funktsioone, mis tagavad personali, avalikkuse ja keskkonna maksimaalse bioloogilise ohutuse. Laborisse sisenemine ja sealt väljumine toimub läbi sanitaarkontrolli. Sisenemisel on vajalik riiete täielik vahetamine eririietuse vastu, väljumisel enne riiete vahetamist on vajalik personali sihipärane desinfitseerimine (dušš, desinfektsioonivahendid). Nakkusliku materjali keskkonda sattumise ohu vähendamiseks kasutatakse poksimist. Kasutades kastid (lauaarvuti, laminaarne) luua füüsilisi tõkkeid, et vältida töötavate inimeste võimalikku kokkupuudet nakkusohtliku materjaliga.

15.3. Mikrobioloogialaboris töötamise reeglid

Põhilaboris töötamise põhireeglid on järgmised:

Suu kaudu pipetiga töötamise keeld;

Töötsoonis söömise, joomise, suitsetamise, toidu hoidmise ja kosmeetika kasutamise keeld;

Puhtuse ja korra säilitamine;

Desinfitseerige tööpindu vähemalt üks kord päevas ja pärast iga kokkupuudet nakkusohtliku materjaliga;

Töötajad pesevad käsi pärast nakkusohtlike materjalidega, loomadega töötamist ja enne laborist lahkumist;

Kõik tööd teha nii, et aerosooli moodustumise võimalus oleks minimaalne;

Enne kõrvaldamist või taaskasutamist desinfitseerige kõik saastunud materjalid.

15.4. Nakkushaiguste mikrobioloogilise diagnoosimise põhimõtted

Nakkushaiguste laboratoorses diagnostikas on kõige olulisem koht spetsiifilisel mikrobioloogilisel diagnostikal, mida teostatakse bakterioloogilistes, viroloogilistes, immunoloogilistes jm laborites. See koosneb kolmest etapist: eelanalüütiline, analüütiline ja postanalüütiline.

Mikrobioloogilise diagnostika esimene etapp on eelanalüütiline, sealhulgas uurimistööks materjali võtmine. Uuritava materjali valiku määrab nakkushaiguse patogenees ja kliiniline pilt. Uuritav materjal võetakse võimalusel aseptilistes tingimustes, asetatakse steriilsetesse anumatesse ja toimetatakse võimalikult kiiresti (soovitavalt 1 tunni jooksul) laborisse. Mõnel juhul külvatakse materjali patsiendi voodi kõrval. Mõnikord on materjali lühiajaline ladustamine reguleeritud tingimustes lubatud. Uuritava materjaliga on kaasas dokument, kus peab olema märgitud kogumise aeg, materjali iseloom, allikas ning täpselt määratletud uuringu eesmärk.

Meditsiinilise mikrobioloogia uuringute materjaliks on mitmesugused bioloogilised ja patoloogilised kehavedelikud (veri, mäda, uriin, röga, vedelik, väljaheited, okse, pesuvesi jne) ja kude - elusalt inimeselt võetud biopsia või surnukeha lahkamine. Sanitaarmikrobioloogias võetakse uuringuteks keskkonnaobjekte (õhk, vesi, toidukaubad jne) või nendelt võetud tampoonid. Materjali kogumisel

Mikrobioloogiliste uuringute puhul tuleb järgida järgmisi reegleid:

Materjal võetakse otse nakkusallikast või uuritakse vastavat eritist (mäda, uriin, sapp jne);

Materjali kogus peaks olema piisav uuringu läbiviimiseks ja vajadusel kordamiseks;

Materjal võetakse võimalusel haiguse algperioodil, kuna just sel perioodil isoleeritakse patogeene sagedamini, neid on rohkem, neil on tüüpilisem lokalisatsioon;

Materjal võetakse enne antimikroobse keemiaravi algust või teatud aja möödudes pärast antibakteriaalse ravimi võtmist, mis on vajalik selle organismist eemaldamiseks;

Vältida tuleks antimikroobsete ainete (desinfektsioonivahendid, antiseptikumid, antibiootikumid) sattumist materjali;

Materjali transportimine laborisse peaks toimuma võimalikult kiiresti tingimustes, mis välistavad ebastabiilsete mikroobiliikide surma, või asetada see spetsiaalsesse transpordikeskkonda;

Transpordi ajal tuleb järgida kõiki bioloogilise ohutuse eeskirju;

Materjalile on lisatud saatedokument, mis sisaldab mikrobioloogilise uuringu läbiviimiseks vajalikku põhiteavet (perenimi, eesnimi, patsiendi isanimi, haigusloo number, kliiniline diagnoos jne).

15.5. Mikrobioloogilised diagnostikameetodid

Analüütiline etapp hõlmab mikrobioloogilise diagnostika mikroskoopilisi, kultuurilisi, bioloogilisi, seroloogilisi ja allergoloogilisi meetodeid.

Mikroskoopiline meetod seisneb preparaatide (natiivsete või lihtsate või keerukate meetoditega värvitud) valmistamises uuritavast materjalist ja nende mikroskoopiast, kasutades erinevat tüüpi mikroskoopilisi seadmeid (hele-, tumevälja-, faasikontrast-, fluorestsents-, elektrooniline jne). Bakterioloogias nimetatakse mikroskoopilist meetodit bakterioskoopiliseks, viroloogias - virusoskoopiliseks.

Kultuuri meetod seisneb katsematerjali inokuleerimises tehissöötmesse, rakukultuuridesse või kanaembrüotesse, et isoleerida ja identifitseerida patogeeni või patogeenide puhaskultuur. Bakterioloogias nimetatakse kultuurimeetodit bakterioloogiline, mükoloogias - mükoloogiline, protozooloogias - protozooloogiline, viroloogias - viroloogiline.

Bioloogiline meetod (katse- või bioanalüüs) seisneb tundlike laboriloomade või muude bioloogiliste objektide (kana embrüod, rakukultuurid) nakatamises uuritava materjaliga. Seda kasutatakse patogeeni puhaskultuuri eraldamiseks, toksiini tüübi, antimikroobsete keemiaravi ravimite aktiivsuse määramiseks jne.

Seroloogiline meetod seisneb spetsiifiliste antikehade tiitri määramises patsiendi vereseerumis, harvemini - mikroobse antigeeni tuvastamises uuritavas materjalis. Sel eesmärgil kasutatakse immuunreaktsioone.

Allergoloogiline meetod seisneb nakkusliku allergia (HRT) tuvastamises diagnostilise mikroobse ravimi allergeeni suhtes. Selleks tehakse naha allergiatestid vastavate allergeenidega.

Nende meetodite diagnostiline väärtus on ebavõrdne. Mikrobioloogilise diagnostika juhtiv meetod on bakterioloogiline meetod, kuna see võimaldab isoleerida ja tuvastada patogeenset mikroobi, st. haiguse algpõhjus. Teised meetodid on vähem informatiivsed, kuna need võimaldavad tuvastada organismis mikroobi olemasolust põhjustatud muutusi. Tähtsuselt teine ​​koht on seroloogiline meetod, kuna antigeeni ja antikeha vahelist interaktsiooni iseloomustab kõrge spetsiifilisus. Ülejäänud kolme meetodi teabesisaldus on madal ja need täiendavad tavaliselt bakterioloogilisi ja seroloogilisi meetodeid. Seega ei võimalda uuritava materjali mikroskoopia alati mikroskoobi all näha ja tuvastada. Neid saab tuvastada ainult siis, kui materjal on nendega väga saastunud. Isegi kui bakterid avastatakse mikroskoobi all, on neid võimatu liikide kaupa morfoloogiliselt tuvastada. Nagu teada, taandub kogu bakterite liigiline mitmekesisus neljale peamisele morfoloogilisele vormile: kookid, vardad, keerdunud ja hargnevad vormid. Seetõttu on mikro-

Koopilise pildi põhjal on võimalik vaadeldud baktereid umbkaudu omistada suurele taksonile, näiteks grampositiivsetele kokkidele. Ainult üksikjuhtudel, kui bakteritel on ainulaadne morfoloogia, saab nende perekonda mikroskoopiliselt määrata. Seente ja algloomade mikroskoopilise meetodi teabesisaldus on suurem, kuna seened ja algloomad on eukarüootidena suuremate mõõtmetega ja iseloomulikuma morfoloogiaga.

Bioloogilise meetodi diagnostilisi võimalusi piirab asjaolu, et laboriloomad on immuunsed enamiku inimtekkeliste inimnakkuste patogeenide suhtes, mistõttu ei ole neil võimalik eksperimentaalset infektsiooni tekitada.

Allergoloogilise meetodi võimalusi piirab asjaolu, et enamik inimorganismis leiduvaid mikroobe ei põhjusta HAR-i.

Kuna mikrobioloogilised uuringud on üks kallimaid laboriuuringute liike, seisab mikrobioloogi ees ülesanne panna usaldusväärne mikrobioloogiline diagnoos minimaalse aja-, jõu- ja rahakuluga. Seetõttu kasutatakse diagnoosi tegemiseks 1-5 diagnostikameetodit, et valitud meetodite komplekt garanteeriks õige vastuse.

Eriti olulised on kiirdiagnostika meetodid, mis võimaldavad mikrobioloogilise diagnoosi panna lühikese aja jooksul (mitu minutit kuni mitu tundi) alates uuritava materjali laborisse toimetamise hetkest. Ekspressmeetodite hulka kuuluvad RIF, ELISA, RIA, PCR, biokiipide kasutamine, kromatograafia jne. Anaeroobsete infektsioonide diagnoosimise tunnused on kirjeldatud ketta materjalides.

Koos traditsiooniliste klassikaliste mikrobioloogilise diagnostika meetoditega on viimastel aastatel muutunud järjest olulisemaks molekulaarbioloogilised diagnostikameetodid (DNA sondid, PCR, ligaasi ahelreaktsioon - LCR, kromatograafia, elektroforees, immunoblot, biokiibid jne).

Molekulaarbioloogilised diagnostikameetodid põhinevad konkreetsele mikroobiliigile spetsiifilise DNA ja RNA tuvastamisel ning hõlmavad DNA-sondidel põhinevat hübridisatsiooni ja PCR-põhist diagnostikat.

Postanalüütiline Mikrobioloogilise diagnostika etapp koosneb laboratoorsete tulemuste kliinilisest tõlgendamisest. Sel juhul peab raviarst hindama patsiendilt eraldatud mikroobide etioloogilist tähtsust, kohandama patsiendile manustatavat empiirilist antimikroobset keemiaravi mikrobioloogilise monitooringu andmete põhjal jne.

15.5.1. Bakteriaalsete infektsioonide mikrobioloogilise diagnoosimise meetodid

Bakterioloogias kasutatakse uuritavas materjalis patogeenide tuvastamiseks bakterioskoopilisi, bakterioloogilisi ja bioloogilisi meetodeid.

Bakterioskoopilise meetodi eelised on lihtsus, kiirus ja tõhusus. Siiski leiab see piiratud rakendust, kuna seda saab kasutada ainult siis, kui patogeenil on morfoloogilisi või toonilisi tunnuseid ja selle piisav sisaldus uuritavas materjalis. See meetod on soovituslik.

Peamine ja täpseim meetod bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimiseks on bakterioloogiline, mida kasutatakse peaaegu kõigi haiguste puhul, hoolimata selle puudustest: uuringu kestus (4-5 päevast 2 kuuni), oht (kuna patogeeni puhaskultuur). koguneb) ja suhteliselt kõrge hind. Kui eeldatakse, et uuritav materjal sisaldab piisavas koguses patogeeni, inokuleeritakse materjal isoleeritud kolooniate saamiseks tahkele toitainekeskkonnale. Kui mikroobide sisaldus on ebaoluline, inokuleeritakse uuritav materjal esmalt vedelale toitekeskkonnale – rikastussöötmele. Eraldatud puhaskultuuri identifitseerimine toimub morfoloogiliste, tintoriaalsete, kultuuriliste, biokeemiliste, antigeensete ja toksikogeensete omaduste järgi (olenevalt patogeeni tüübist). Loetletud omaduste kindlaksmääramine võimaldab teil määrata patogeeni tüübi. Epidemioloogilise märgistamise eesmärgil viiakse läbi isoleeritud kultuuri intraspetsiifiline identifitseerimine: määratakse selle fagovar, biovar jne. Lisaks määratakse ratsionaalse ravi määramiseks reeglina isoleeritud kultuuri tundlikkus antibiootikumide suhtes.

Normaalse mikrofloora esindajate, oportunistlike mikroobide põhjustatud haiguste mikrobioloogilisel diagnoosimisel on kohustuslik määrata patogeenide arv uuritavas materjalis.

Bioloogiline meetod on ebaökonoomne ja ebainimlik ning seetõttu on selle kasutamine piiratud. Katseloomadena kasutatakse valgeid hiiri, merisigu, küülikuid, ahve ja teisi loomi.

Nakkushaiguse diagnoosi saab määrata ka seroloogilise meetodiga, mis võimaldab tuvastada kas spetsiifilisi antikehi patsiendi seerumis või spetsiifilisi antigeene otse uuritavast materjalist. Antikehad haiguse tekitaja vastu ilmnevad reeglina esimese haigusnädala lõpuks. Meetodi tõsine puudus on võimetus neid haiguse esimestel päevadel avastada, eriti ägeda haiguse korral. Lisaks nõuavad paljud haigused antikehade moodustumise dünaamika uurimist ja antikehade arvu suurenemise tuvastamist, mis samuti ei võimalda kiiret diagnoosi. Selle meetodi puuduseks on see, et seda ei saa kasutada patogeeni täpseks tuvastamiseks ja selle antibiogrammi määramiseks. Kuid samal ajal on see täiesti ohutu, suhteliselt odav meetod, mis võimaldab teil lühikese aja jooksul diagnoosi panna. Praegu määratakse mitmete haiguste puhul mitte ainult immunoglobuliinide kogus, vaid ka klassid.

Mõnede haiguste puhul kasutatakse seroloogilist meetodit spetsiifiliste antigeenide tuvastamiseks uuritavas materjalis. Kuna patogeeni moodustavad spetsiifilised antigeenid esinevad patoloogilises materjalis haiguse esimestest minutitest alates, kasutatakse seda seroloogilise meetodi versiooni kas kiirendatud (esimesel haiguspäeval) või isegi kiireks diagnoosimiseks (mitme tunni jooksul). nakkushaigustest.

Väikese rühma nakkushaiguste abimeetodina kasutatakse allergoloogilist meetodit, mis võimaldab tuvastada suurenenud tundlikkust konkreetse antigeeni (allergeeni) suhtes, mis on haiguse põhjustaja.

15.5.2. Viirusnakkuste mikrobioloogilise diagnoosimise meetodid

Viroloogias on viirusnakkuste laboratoorse diagnoosimise meetoditel oma eripärad, võttes arvesse viiruste bioloogia iseärasusi. Kasutatakse viirusoskoopilisi, viroloogilisi ja seroloogilisi laboratoorseid diagnostikameetodeid.

Viruskoopiline meetod hõlmab viiruse tuvastamist uuritavas materjalis mikroskoobi all. Sagedamini kasutatakse elektronmikroskoopi, harvemini fluorestsentsmikroskoopi. Valgusmikroskoopiat viiruste tühise suuruse tõttu praktiliselt ei kasutata. Valgusmikroskoopi saab kasutada ainult suurte viiruste tuvastamiseks supervärvimismeetodite abil. Lisaks saate valgusmikroskoobi abil tuvastada intratsellulaarsed kandmised, mis moodustuvad mõjutatud rakkudes mõne infektsiooni ajal.

Viroloogiline meetod seisneb tundliku bioloogilise mudeli (laboriloomad, kanaembrüod või rakukultuurid) nakatamises uuritava materjaliga, näidates ära viiruse ja selle hilisema identifitseerimise. Laboratoorsete loomade nakatumisel tuvastatakse viirused tavaliselt haiguse kliinilise pildi, patoloogiliste ja anatoomiliste muutuste põhjal, esialgselt ja lõpuks näiteks hemaglutinatsioonireaktsiooni abil. Sama reaktsioon võimaldab avastada viiruseid kanaembrüos, mis reeglina lahkamisel nähtavaid muutusi ei näita. Rakukultuuris määrab viiruse esinemise selle tsütopaatiline toime (sealhulgas intratsellulaarsete inklusioonide moodustumine), hemadsorptsioon, naastude moodustumise nähtus, hemaglutinatsioonireaktsioon ja indikaatori värvuse muutuste puudumine. Viiruse identifitseerimine toimub seroloogiliste reaktsioonide abil (RPGA, RTGA, RN, RSK, ELISA jne). Viroloogiline meetod võimaldab täpselt määrata patogeeni olemust, kuid see nõuab piisavalt aega (5-7 päeva või rohkem), olulisi materiaalseid kulusid ja on ohtlik.

Seroloogilise meetodi eripäraks viroloogias on paarisseerumite uurimine. Esimene seerum võetakse patsiendilt ägeda perioodi jooksul haiguse alguses, säilitatakse temperatuuril 4-8°C ja teine ​​seerum võetakse 10-14 päeva pärast. Seerumid

uuriti samaaegselt. Haigusele viitab serokonversioon, s.o. antikehade tiitri tõus teises seerumis võrreldes esimesega. 4-kordne või suurem serokonversioon on diagnostiline. Kuna paljud viirushaigused on ägedad, kasutatakse seda seroloogilise meetodi versiooni tavaliselt retrospektiivseks diagnoosimiseks.

Viirusnakkuste laboratoorse diagnoosimise juhtiv meetod on viroloogiline.

Viirushaiguste kiirendatud ja ekspressdiagnoosimine toimub samamoodi nagu bakteriaalsete infektsioonide puhul.

15.5.3. Mükooside mikrobioloogilise diagnoosi tunnused

Seennakkuste diagnoosimiseks kasutatakse tavaliselt mikroskoopilist meetodit. Mükoloogiline meetod seisneb patoloogilise materjali inokuleerimises spetsiaalsele toitainekeskkonnale, patogeeni puhaskultuuri eraldamises ja selle identifitseerimises morfoloogiliste, kultuuriliste ja biokeemiliste omaduste järgi. Selle meetodi eripära on selle kestus - seente aeglase kasvu tõttu mitu nädalat. Antikehade avastamine seroloogilise analüüsi käigus on võimalik alates 2.-4. haigusnädalast. Mõne haiguse puhul tuvastatakse uuritavas materjalis spetsiifilised antigeenid. Allergoloogilist meetodit kasutatakse harva. Sageli kasutatakse mükooside puhul histoloogilist meetodit, mis seisneb seeneelementide (eosed, koniidipead jne) tuvastamises seentest mõjutatud elundites ja kudedes. Selleks valmistatakse histoloogilised õhukesed või üliõhukesed koelõigud, värvitakse spetsiaalsete histoloogiliste ja histokeemiliste meetoditega ning uuritakse valgus- ja vajadusel elektronmikroskoopiaga.

15.5.4. Algloomade infektsioonide mikrobioloogilise diagnoosi tunnused

Patoloogilise materjali mikroskoopiline uurimine koosneb nii natiivsete preparaatide (“paks tilk”) kui ka Romanovsky-Giemsa meetodil värvitud äigepreparaadi valmistamisest ning see on peamine meetod algloomade põhjustatud haiguste diagnoosimisel. Mõnel juhul kasutatakse seroloogilisi ja allergoloogilisi diagnostikameetodeid.

15.6. Inimese haiguste immunoloogilise diagnoosimise põhimõtted

Immunodiagnostika on immunoloogia haru, mis uurib ja arendab immuunsüsteemi talitlusega seotud nakkuslike ja mittenakkuslike haiguste diagnoosimise meetodeid.

Paljud nakkushaigused on praeguseks läbi teinud olulisi muutusi, mis väljenduvad kergete, kustutatud ja asümptomaatiliste vormide osakaalu suurenemises, allergilise komponendi suurenemises ning seganakkuste sagenemises. See raskendab traditsioonilist haiguste diagnoosimist, mistõttu suureneb immuundiagnostika tähtsus, mille eesmärk on patogeeni antigeenide või spetsiifiliste immuunmuutuste otsimine patsiendi kehas.

Immunoreaktiivsus (immuunseisund, immuunprofiil) viitab immuunsüsteemi võimele tekitada immuunvastust teatud ajahetkel. Seda iseloomustab immunoglobuliinide kontsentratsioon, lümfotsüütide ja leukotsüütide arv, T- ja B-rakkude suhe ning funktsionaalsed näitajad, eelkõige immunokompetentsete rakkude võime reageerida stimulatsioonile.

15.7. Laboratoorsete uuringute kvaliteedikontroll

Mikrobioloogilise ja immunoloogilise labori töö oluliseks elemendiks on täpsete ja võrreldavate analüüsitulemuste saamine, mille jaoks on vajalik teostatavate uuringute kvaliteedi jälgimine. Kvaliteedikontroll võib olla sisemine ja välimine.

Laborisisene kvaliteedikontroll - kontrollimeetmete süsteem, mida selle labori töötajad viivad läbi eraldi laboris ja mille eesmärk on tagada labori töö sobiv kvaliteeditase.

Väline kvaliteedikontroll - kontrollimeetmete süsteem, mida viivad läbi ühtse föderaalse välise kvaliteedihindamise süsteemi (FSVOK) raames eksperdirühmad ja mille eesmärk on tagada laboriuuringute tegemise tehnoloogiliste protsesside õige korraldamine.

Laboratoorsete uuringute kvaliteedi välishindamise föderaalne süsteem koosneb osadest, millest igaühe sees on

Hinnatakse teatud tüüpi laboriuuringute kvaliteeti. FSVOC-i struktuur hõlmab ekspertgruppe välise kvaliteedikontrolli arendamiseks ja rakendamiseks erinevat tüüpi laborikatsete puhul.

Ülesanded enese ettevalmistamiseks (enesekontroll)

A.Nimetage mikrobioloogiline uurimismeetod, mis võimaldab teil kindlaks teha patogeeni tüübi:

1. Allergiline.

2. Mikroskoopiline.

3. Kultuuriline.

4. Bioloogiline.

B.Nimetage bakterioloogilise uurimismeetodi põhiülesanne.

B.Haiguse 7. päeval võeti viirusinfektsiooni kahtlusega patsiendilt seerum, milles tuvastati spetsiifilised viirusevastased antikehad. Hinnake saadud uurimistulemuse usaldusväärsust.

G.Nimetage labori tüüp, kuhu tuleks saata eriti ohtliku infektsiooni kahtlusega patsiendi materjal.

Kursuse töö

"Kliinilise viroloogia meetodid"

Sissejuhatus

Viirusnakkuste laboratoorseks diagnoosimiseks kasutatakse peamiselt elektronmikroskoopiat, tundlikke rakukultuure ja immunoloogilisi meetodeid. Reeglina valitakse üks meetod diagnoosi tegemiseks sõltuvalt viirusnakkuse staadiumist. Näiteks võivad tuulerõugete diagnoosimisel olla kasulikud kõik kolm lähenemisviisi, kuid mikroskoopia ja rakukultuuri tehnikate edukas kasutamine sõltub võimest koguda rahuldavaid proove haiguse suhteliselt varajases staadiumis.

Suurel määral sõltub viirusdiagnostika edukus saadud proovide kvaliteedist. Sel põhjusel peavad laboritöötajad ise olema otseselt seotud vajalike proovide kogumisega. Proovide omadusi ja meetodeid nende laborisse toimetamiseks kirjeldavad Lennett, Schmidt, Christ jt.

Enamikku laboridiagnostikas kasutatavaid reaktiive ja instrumente saab osta erinevatelt ettevõtetelt. Enamasti toodab sama reaktiivi korraga mitu ettevõtet. Sel põhjusel ei ole me märkinud üksikuid ettevõtteid, välja arvatud juhul, kui reaktiivi tarnib ainult üks ettevõte. Kõigil muudel juhtudel peaksite tutvuma tabelis näidatud tarnijate üldise loeteluga. 1.

Meie eesmärk ei olnud esitada kõikehõlmavat kirjeldust kõigist praegu saadaolevatest inimese viirusnakkuste diagnoosimise meetoditest. Kõigepealt kirjeldasime peamisi meetodeid. Iseseisva töökogemuse omandamisel saab neid põhivõtteid kasutada keerukamate probleemide lahendamiseks.

1. Elektronmikroskoopia

Viirusnakkuste elektronmikroskoopiliseks diagnoosimiseks võib kasutada kahjustatud koe õhukesi lõike. Kõige sagedamini kasutatakse elektronmikroskoopias väljaheiteid või vedelikku.

Tabel 1. Reaktiive ja seadmeid tarnivate ettevõtete loetelu

vesiikulid, mis iseloomustavad mõnda haigust, näiteks tuulerõugeid. Sellise materjali analüüsimisel saab viiruseid tuvastada negatiivse värvimise abil, mille tulemuseks on elektrontihe materjal, mis piiritleb virioni komponente. Meetod on efektiivne, kui viiruse kontsentratsioon on uuritavates proovides, näiteks väljaheites või vesikulaarvedelikus, kõrge. Juhtudel, kui viiruseosakeste sisaldus proovides on madal, saab viiruse tuvastamise tõenäosust suurendada viiruse kontsentreerimisega ultratsentrifuugimise teel või spetsiifiliste antikehadega agregeerimisega. Viimane meetod on mugav ka viiruste tuvastamiseks. Siin kirjeldame parvoviiruste spetsiifiliste antikehade tuvastamise näitel elektronmikroskoopilist meetodit rotaviirusnakkuse diagnoosimiseks ja immunoelektronmikroskoopia meetodit. Elektronmikroskoopia meetodeid kirjeldab täpsemalt Field.

2.1 Väljaheidete otsene elektronmikroskoopiline uurimine

1. Kastke Pasteuri pipeti ots väljaheitesse ja tõmmake 1 cm määrdumiseks piisavalt materjali.

2. Resuspendeerige väljaheite äige elektronmikroskoopilises negatiivses kontrastaines, kuni saadakse poolläbipaistev suspensioon. Negatiivne kontrastaine on 2% fosfovolframhappe lahus destilleeritud vees.

3. Elektronmikroskoopilise proovi saamiseks asetatakse tilk suspensiooni süsinik-formvari kilega kaetud elektronmikroskoopia võrele. Selle toimingu ajal hoitakse võrku õhukeste pintsettidega.

4. Ravim jäetakse 30 sekundiks õhku.

5. Liigne vedelik eemaldatakse, puudutades filterpaberiga klaasi serva.

6. Ravim kuivatatakse õhu käes.

7. Vajadusel inaktiveeritakse elujõuline viirus, kiiritades võre mõlemat poolt ultraviolettvalgusega intensiivsusega 440 000 μW-s/cm2. Sel juhul kasutatakse filtriga lühilaine ultraviolettlampi. Lamp peaks asuma võrgust 15 cm kaugusel; Kiiritusaeg mõlemal küljel on 5 minutit.

8. Rotaviiruse virioone saab iseloomustada ülekandeelektronmikroskoobi all suurendusega 30 000 kuni 50 000.

2.2 Immunoelektronmikroskoopia

Allpool kirjeldatud immunoelektronmikroskoopia meetod on vaid üks paljudest sarnastest immunoloogilistest meetoditest. Viirusspetsiifiliste antikehade uurimiseks kasutatakse lisaks meetodit, mis hõlmab seondumist A-valgu mikroskoopilise võrgustikuga. Viirusevastaste antikehade töökontsentratsioon määratakse katse-eksituse meetodil vahemikus 1/10 kuni 1/1000. Meie näidatud kontsentratsiooni kasutatakse tavaliselt tavatöös. Antikehade ja viirusega interaktsiooni optimaalsete tulemuste saamiseks tiitritakse parvoviirust sisaldavat seerumit samal viisil.

1. 10 µl inimese parvoviiruse antiseerumit lahjendatakse 100 korda PBS-ga. Lahust kuumutatakse veevannis temperatuurini 56 °C.

2. Sulata 10 ml 2% agaroosi PBS-is tavalisel viisil ja jahuta veevannis temperatuurini 56 °C.

3. Segage temperatuuril 56 °C 1 ml lahjendatud antiseerumit 1 ml 2% agaroosiga.

4. Viige 200 µl saadud segu 96 süvendiga mikrotiiterplaadi kahte süvendisse.

5. Agaroosil lastakse tarduda toatemperatuuril. Tabletti võib hoida 4°C juures mitu nädalat, kui see on kleeplindiga suletud.

6. Lisage agaroosi ja antiseerumi segu sisaldavasse süvendisse 10 µl parvoviirust sisaldavat seerumit.

7. Seerumitilgale asetatakse vähem läikivale poolele eelnevalt ettevalmistatud süsinik-formvari kattega elektronmikroskoopia võre.

8. Võrku hoitakse 2 tundi 37 °C juures niiskes kambris.

9. Võtke õhukeste pintsettidega võrk välja ja kandke seerumiga kokku puutunud võrgu pinnale tilk 2% fosfovolframhapet.

10. 30 s pärast pestakse liigne värv maha, preparaat kuivatatakse ja viirus inaktiveeritakse.

Agregeerunud viirusosakesi uuritakse ülekandeelektronmikroskoobi all suurendusega 30 000 kuni 50 000.

3. Viiruse antigeenide tuvastamine

Kudedes või koevedelikes leiduvaid viirusi saab tuvastada viirusspetsiifiliste valkude abil, kasutades antigeen-antikeha reaktsiooni. Antigeen-antikeha reaktsiooni produkti testitakse märgise suhtes, mis sisestatakse kas otse viirusevastastesse antikehadesse või viirusespetsiifiliste antikehade vastu suunatud antikehadesse. Antikehi saab märgistada fluorestseiini, radioaktiivse joodi või ensüümiga, mis lõhustab substraati, põhjustades värvimuutuse. Lisaks kasutatakse viiruse tuvastamiseks hemaglutinatsiooni reaktsiooni. Igapäevapraktikas kasutatakse kirjeldatud meetodeid peamiselt B-hepatiidi viiruse antigeenide tuvastamiseks verest ja erinevate viiruste antigeenide otsimiseks, mis põhjustavad erinevaid hingamisteede haigusi.

Praegu toodavad paljud ettevõtted erütrotsüütide, radioaktiivsete ja ensümaatilist diagnostikat, sealhulgas B-hepatiidi viiruse tuvastamiseks.Me ei pea otstarbekaks kirjeldada meetodeid selle diagnostikaga töötamiseks: piisab, kui järgida lisatud juhiseid. Allpool keskendume immunofluorestsentsmeetodile respiratoorse süntsütiaalviiruse tuvastamiseks ninaneelu sekretsioonides.

3.1 Hingamisteede süntsütiaalviiruse tuvastamine ninaneelu sekretsioonides immunofluorestsentsi abil

Gardner ja McQuillin kirjeldavad nina-neelu sekretsiooni preparaatide saamise meetodit. Laboratoorsetes tingimustes viiakse see operatsioon läbi kahes etapis. Kõigepealt valmistatakse klaasplaadil ninaneelu lima määrdumine. Saadud määrdeid võib fikseeritult säilitada -20°C juures mitu kuud. Teises etapis värvitakse respiratoorse süntsüütilise viiruse antigeeni tuvastamiseks määrded. Sel eesmärgil kasutatakse kaudse immunofluorestsentsi meetodit.

3.1.1 Ninaneelu sekretsiooni preparaatide valmistamine

1. Spetsiaalsete tangide lima pestakse maha 1-2 ml PBS-ga ja viiakse tsentrifuugitorusse.

2. Tsentrifuugige lauatsentrifuugis 10 minutit kiirusel 1500 p/min.

3. Supernatant kurnatakse.

4. Rakupellet resuspendeeritakse ettevaatlikult 2-3 ml PBS-s, kuni saadakse homogeenne suspensioon. Selleks kasutage laia kaelaga Pasteur pipetti.

5. Saadud suspensioon viiakse katseklaasi.

6. Lisage suspensioonile veel 2–4 ml PBS-i ja segage pipetiga. Suured lima klombid eemaldatakse.

7. Tsentrifuugige lauatsentrifuugis 10 minutit kiirusel 1500 p/min.

8. Supernatant visatakse ära, sete resuspendeeritakse sellises mahus PBS-is, et saadud suspensioon oleks toru seintest kergesti eraldatav.

9. Saadud suspensioon kantakse märgistatud slaidile.

10. Klaas kuivatatakse õhu käes.

Kinnitage atsetoonis 10 minutit temperatuuril 4 °C.

12. Pärast kinnitamist kuivatatakse klaas uuesti õhu käes.

13. Saadud preparaadid värvitakse kohe või säilitatakse -20 °C juures.

3.1.2. Värvimistehnika

1. Printige ja lahjendage müügil olev RSV antiseerum PBS-is soovitatud töökontsentratsioonini.

2. Kandke valmistatud preparaadile Pasteuri pipeti abil üks tilk antiseerumit.

3. Ravim asetatakse niiskesse kambrisse.

4. Ravimit inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.

5. Proove pestakse hoolikalt PBS-ga, et eemaldada spetsiaalses reservuaaris liigsed antikehad.

6. Proove pestakse kolmes PBS-i vahetuses, igaüks 10 minutit.

7. Kuivatage proovid, eemaldage liigne PBS filterpaberiga ja kuivatage õhu käes.