Sadestamise reaktsioon geelis, RPG (geelsadestamise test). Seroloogilised reaktsioonid Reaktsiooni komponendid

/ 34
Halvim Parim

Sadestamisreaktsioonid põhinevad antigeen-antikeha komplekside moodustumisel ja sadestamisel. Reaktsioonis osalevad lahustuvad antigeenid: sadestuvad ained (mikroorganismide, kudede, kemikaalide ja ravimite tooted). Antikehad (pretsipitiinid), ühinedes lahustuvate antigeenidega, põhjustavad nende agregatsiooni, mis väljendub selgete vedelike hägususes või sette (sademe) moodustumises. Diagnostilised sadestavad seerumid toodetakse kõrge antikehade tiitriga. Need saadakse laboriloomade immuniseerimisel vastava antigeeniga. Sadestava seerumi tiiter on minimaalne antigeeni kogus, mida antud seerum suudab sadestada.

Sadestamisreaktsiooni võib läbi viia vedelas ja tahkes keskkonnas (agar või geel).

Sadestamise reaktsioon vedelas keskkonnas (ringsadestamine). Reaktsioon viiakse läbi kitsastes katseklaasides, millesse lisatakse sadestav antiseerum, mille peale kantakse ettevaatlikult läbipaistev antigeenilahus. Kui reaktsioon on positiivne, ilmub mõne minuti pärast kahe vedeliku piirpinnale sadenemisrõngas. Väikese koguse reaktiividega saab reaktsiooni läbi viia kapillaarides (mikrosadestamine).

Sadestamise reaktsioon agaris. Reaktsiooni olemus seisneb selles, et agari erinevatesse süvenditesse paigutatud antigeenid ja antikehad difundeeruvad üksteise suunas ja moodustavad interaktsioonil kompleksi, mis sadestub sadestusjoone kujul.

Ouchterlony topeltradiaalne immunodifusioon. Reaktsioon viiakse läbi agar-geelplaatidel. Antigeeni ja antiseerumi lahused asetatakse üksteisest teatud kaugusele lõigatud süvenditesse. Immunoreagendid difundeeruvad geelis ja kokku puutudes moodustavad komplekse, mis sadestuvad sadestusjoonte kujul. See meetod võimaldab teil korraga uurida mitut immunoreagendi proovi. Näiteks võib antiseerumiga süvendi ümber asetada mitu süvendit erinevate antigeenide lahustega või vastupidi.

Mikroobide toksilisuse määramise meetod sadestamisreaktsioonis. Immunodifusiooni põhimõte geelis on meetodi aluseks, mille abil uuritakse bakterite toksilisust (toksiini tootmise võimet). Näiteks difteeriatoksiini tuvastamiseks asetatakse agariga Petri tassi keskele antitoksilise seerumiga immutatud filterpaberi riba. Uuritavad bakterikultuurid inokuleeritakse läheduses. Kui nad eritavad toksiini, siis antitoksiinidega suhtlemisel moodustuvad kolooniate ja pabeririba vahele sademejooned.

Geeli immunodifusioon on Mancini sadestamisreaktsiooni aluseks, mida kasutatakse immunoglobuliinide klasside määramiseks vereseerumis (vt immunoglobuliinid).

Sadestamisreaktsioone kasutatakse; bakterite, inimese ja looma kudede antigeenide määramine; teatud nakkushaiguste diagnoosimine; valguliikide määramine kohtumeditsiinis; liha-, kala- ja jahutoodete lisandite tuvastamine sanitaarpraktikas.

Sadestamisreaktsioonis sadestatakse spetsiifiline immuunkompleks, mis koosneb lahustuvast antigeenist (lüsaat, ekstrakt, hapteen) ja spetsiifilisest antikehast elektrolüütide juuresolekul.

Selle reaktsiooni tulemusena tekkinud hägust rõngast või sadet nimetatakse sademeks. See reaktsioon erineb peamiselt aglutinatsioonireaktsioonist antigeeniosakeste suuruse poolest.

Sadestamisreaktsiooni kasutatakse tavaliselt antigeeni määramiseks mitmete infektsioonide (siberi katk, meningiit jne) diagnoosimisel; kohtumeditsiinis - vere, sperma jm liigi määramiseks; sanitaar- ja hügieeniuuringutes - toodete võltsimise tuvastamisel; tema abiga tehakse kindlaks loomade ja taimede fülogeneetiline seos. Reaktsiooni jaoks vajate:

1. Antikehad (pretsipitiinid) - kõrge antikehade tiitriga (mitte madalam kui 1:100 000) immuunseerum. Sadestava seerumi tiiter määratakse selle antigeeni kõrgeima lahjenduse järgi, millega see reageerib. Seerumit kasutatakse tavaliselt lahjendamata või lahjenduses 1:5–1:10.

2. Antigeen - valgu või lipoidse polüsahhariidi iseloomuga lahustunud ained (täisantigeenid ja hapteenid).

3. Isotooniline lahus.

Peamised meetodid sadestamisreaktsiooni läbiviimiseks on: ringsadestamisreaktsioon ja sadestamisreaktsioon agaris (geelis).

Tähelepanu! Kõik sadestamisreaktsioonis osalevad komponendid peavad olema täiesti läbipaistvad.

Rõngasadestamise reaktsioon. Lisage Pasteuri pipeti abil sadestamistorusse 0,2-0,3 ml (5-6 tilka) seerumit (seerum ei tohiks sattuda tuubi seintele). Samas mahus antigeen kantakse ettevaatlikult seerumile, valades seda õhukese Pasteuri pipetiga mööda katseklaasi seina. Katseklaasi hoitakse kaldus asendis. Kui see on korralikult kihistatud, peaks seerumi ja antigeeni vahel olema selge piir. Ettevaatlikult, et vedelik ei seguneks, asetage katseklaas alusele. Kui reaktsioon on positiivne, moodustub antigeeni ja antikeha kokkupuutepinnal hägune "rõngas" - sade (vt joonis 48).

Reaktsiooniga kaasneb hulk kontrolle (tabel 18). Reaktsiooni koostisosade katseklaasi lisamise järjekord on väga oluline. Te ei saa seerumit antigeenile (kontrollis - isotoonilisele lahusele) asetada, kuna seerumi suhteline tihedus on suurem, vajub see katseklaasi põhja ja vedelike vaheline piir ei ilmne.

Tabel 18. Ringsadestamise reaktsiooni seadistamise skeem

Märge. + "rõnga" olemasolu; - "rõnga" puudumine.

Tulemused registreeritakse 5-30 minuti pärast, mõnel juhul tunni pärast, nagu alati alustades kontrollidest. "Rõngas" teises katseklaasis näitab immuunseerumi võimet astuda spetsiifilisse reaktsiooni vastava antigeeniga. 3-5 katseklaasis ei tohiks olla "rõngaid" - puuduvad üksteisele vastavad antikehad ja antigeenid. "Rõngas" 1. katseklaasis - positiivne reaktsiooni tulemus - näitab, et testitav antigeen vastab võetud immuunseerumile, "rõnga" puudumine ("rõngas" ainult 2. katseklaasis) näitab nende ebaühtlust - negatiivset reaktsiooni tulemus.

Sadestamise reaktsioon agaris (geel). Reaktsiooni eripära on see, et antigeeni ja antikeha interaktsioon toimub tihedas keskkonnas, st geelis. Saadud sade annab söötme paksuses häguse triibu. Riba puudumine näitab reaktsiooni komponentide lahknevust. Seda reaktsiooni kasutatakse laialdaselt biomeditsiinilistes uuringutes, eriti difteeria tekitaja toksiinide moodustumise uurimisel.

Kontrollküsimused

1. Mis on peamine erinevus aglutinatsiooni- ja sadestamisreaktsioonide vahel?

2. Miks ei saa sadestamisreaktsioonis kasutada häguseid koostisosi?

Harjutus

1. Seadistage rõngassadestamise reaktsioon ja visandage tulemus.

2. Uurige antigeeni ja antikeha interaktsiooni olemust agar-sadestamisreaktsioonis, visandage tulemus (saa õpetaja käest tass).

Lüüsireaktsioon (immuuntsütolüüs)

Immuunlüüs on rakkude lahustumine antikehade mõjul koos komplemendi kohustusliku osalemisega. Reaktsiooni jaoks vajate:

1. Antigeen – mikroobid, punased verelibled või muud rakud.

2. Antikeha (lüsiin) - immuunseerum, harvem patsiendi seerum. Bakteriolüütiline seerum sisaldab antikehi, mis osalevad bakterite lüüsis; hemolüütiline - hemolüsiinid, mis soodustavad punaste vereliblede lüüsi; spiroheetide lüüsimiseks on vaja spiroketolüsiine, rakke - itolüsiine jne.

3. Täiendada. Merisigade seerum sisaldab kõige rohkem komplementi. Seda seerumit (mitu looma segu) kasutatakse tavaliselt täiendusena. Värske (natiivse) komplement on ebastabiilne ja kergesti hävib kuumutamisel, loksutamisel või ladustamisel, mistõttu seda ei saa kasutada kauem kui kaks päeva pärast kättesaamist. Komplemendi säilitamiseks lisatakse sellele 2% boorhapet ja 3% naatriumsulfaati. Seda komplementi võib säilitada temperatuuril 4 °C kuni kaks nädalat. Kõige sagedamini kasutatakse kuiva komplementi. Enne kasutamist lahustatakse see isotoonilises lahuses esialgse mahuni (näidatud etiketil).

4. Isotooniline lahus.

Hemolüüsi reaktsioon(Tabel 19). Reaktsiooni jaoks vajate:

1. Antigeen - pestud lamba erütrotsüütide 3% suspensioon kiirusega 0,3 ml erütrotsüütide setet ja 9,7 ml isotoonilist lahust.

2. Antikeha - hemolüütiline seerum (hemolüsiin) lamba erütrotsüütide vastu; tavaliselt valmistatakse tootmises, lüofiliseeritakse ja tiiter on märgitud etiketile.

Hemolüsiini tiiter on seerumi kõrgeim lahjendus, mille juures toimub 3% punaste vereliblede suspensiooni täielik hemolüüs komplemendi juuresolekul. Hemolüüsireaktsiooni jaoks võetakse hemolüsiini kolmekordse tiitriga, st lahjendatakse 3 korda vähem kui enne tiitrit. Näiteks seerumi tiitri 1:1200 korral lahjendatakse seerum 1:400 (0,1 ml seerumit * ja 39,9 ml isotoonilist lahust). Liigne hemolüsiin on vajalik, kuna osa sellest võivad teised reaktsioonikomponendid adsorbeerida.

* (Te ei tohiks võtta alla 0,1 ml seerumit - mõõtmise täpsus kannatab.)

3. Komplement lahjendatakse 1:10 (0,2 ml komplementi ja 1,8 ml isotoonilist lahust).

4. Isotooniline lahus.

Tabel 19. Hemolüüsi reaktsiooni skeem

Tulemuste arvestus. Kui reaktsioon viiakse läbi õigesti, toimub 1. katseklaasis hemolüüs - selle sisu muutub läbipaistvaks. Kontrollides jääb vedelik häguseks: 2. katseklaasis ei ole hemolüüsi tekkeks piisavalt komplementi, 3. katsutis pole hemolüsiini, 4. katsutis pole ei hemolüsiini ega komplementi, 5. katsutis teeb antigeen. ei vasta antikehadele,

Vajadusel tiitritakse hemolüütilist seerumit vastavalt järgmisele skeemile (tabel 20).

Enne tiitrimist valmistage seerumi esialgne lahjendus 1:100 (0,1 ml seerumit ja 9,9 ml isotoonilist lahust), millest tehakse vajalikud lahjendused, näiteks:

Nendest lahjendustest lisage 0,5 ml seerumit tiitrimiskatseklaasidesse, nagu on näidatud tabelis. 20.

Tabel 20. Hemolüütilise seerumi (hemolüsiini) tiitrimisskeem

Tabelis toodud näites. 20, hemolüütilise seerumi tiiter on 1:1200.

Värske hemolüütilise seerumi kasutamisel tuleb see inaktiveerida, et hävitada selles sisalduv komplement. Selleks kuumutatakse seda 30 minutit temperatuuril 56 ° C veevannis või termostaadiga inaktivaatoris. Viimane meetod on parem: see välistab vadaku ülekuumenemise, st selle denatureerimise. Denatureeritud seerumid ei sobi testimiseks.

Bakteriolüüsi reaktsioon. Selles reaktsioonis lüüsib komplement baktereid sobiva (homoloogse) seerumi juuresolekul. Reaktsiooniskeem on põhimõtteliselt sarnane hemolüüsi reaktsiooniskeemiga. Erinevus seisneb selles, et pärast kahetunnist inkubeerimist külvatakse kõik katseklaasid Petri tassidele katsesse võetud mikroorganismi jaoks soodsa söötmega, et selgitada välja, kas see on lüüsitud. Kui katse viiakse läbi õigesti, peaksid 2–5 katseklaasi (kontrollid) olevad kultuurid näitama rikkalikku kasvu. Kasvu puudumine või nõrk kasv inokulatsioonis 1. katseklaasist (katse) näitab mikroobide hukkumist, st et nad on antikehaga homoloogsed.

Tähelepanu! Bakteriolüüsi reaktsioon tuleb läbi viia aseptilistes tingimustes.

Kontrollküsimused

1. Mis juhtub punaste verelibledega, kui isotoonilise naatriumkloriidi lahuse asemel kasutatakse destilleeritud vett? Mis on selle nähtuse aluseks?

2. Milline reaktsioon tekib, kui erütrotsüüdid interakteeruvad homoloogse immuunseerumiga komplemendi puudumisel?

Harjutus

Seadistage hemolüüsi reaktsioon. Salvestage ja visandage tulemus.

Sademete reaktsioon- RP (alates lat. praecipito- sade) - see on lahustuva molekulaarse antigeeni kompleksi moodustumine ja sadestumine antikehadega hägususe kujul, nn. sade. See moodustub antigeenide ja antikehade segamisel samaväärsetes kogustes; ühe neist liig vähendab immuunkompleksi moodustumise taset. Erinevalt aglutinatsioonireaktsioonist on sadestamisreaktsiooni antigeeniks lahustuvad ühendid, mille osakeste suurus läheneb molekulide suurusele. Need võivad olla valgud, valkude kompleksid süsivesikute ja lipiididega, bakteriekstraktid, erinevad disaadid või mikroobide puljongikultuuride filtraadid. Sadestamisreaktsioonis osalevaid antikehi nimetatakse sademeteks. Saadud peeneks dispergeeritud antigeen-antikeha kompleks tuvastatakse sadestamisreaktsiooni teatud faaside määramise meetoditega.
Ringi sadestamise reaktsiooni pakkus esmakordselt välja Ascoli. Seda kasutatakse siberi katku, katku, tulareemia ja meningiidi diagnoosimiseks. Meetod on lihtne ja kättesaadav.
Spetsiifiline immuunsadestamise seerum valatakse kitsastesse sadestamistorudesse ja antigeen kantakse sellele väga hoolikalt kihiti. Näiteks siberi katku diagnoosimisel võetakse antigeeniks nahatükid, vill, surnud looma nahk jne.Need keedetakse, vedelik filtreeritakse ja kasutatakse antigeenina. Rõnga - sademe - ilmumine kahe vedeliku piiril näitab vastava antigeeni olemasolu.
Agargeeli sadestamisreaktsioon ehk difusioonsadestamise meetod võimaldab üksikasjalikult uurida veeslahustuvate komplekssete antigeensete segude koostist. Reaktsiooni seadistamiseks kasutage geeli (poolvedel või paksem agar). Iga komponent, mis moodustab antigeeni, difundeerub erineva kiirusega vastava antikeha suunas. Seetõttu paiknevad geeli erinevates osades erinevate antigeenide ja vastavate antikehade kompleksid, kus moodustuvad sadestumisjooned. Iga rida vastab ainult ühele antigeen-antikeha kompleksile. Sadestamisreaktsioon viiakse tavaliselt läbi toatemperatuuril.
Immunoelektroforeesi meetod on viimastel aastatel mikroobide antigeense struktuuri uurimisel laialt levinud. Antigeenikompleks asetatakse süvendisse, mis asub plaadile valatud agargeeli keskel. Seejärel lastakse agargeelist läbi elektrivool, mis põhjustab kompleksis sisalduvate erinevate antigeenide liikumist läbi elektrivooluvälja sõltuvalt nende elektroforeetilisest liikuvusest. Pärast elektroforeesi lõppu lisatakse plaadi servas asuvasse kaevikusse spetsiifiline immuunseerum ja asetatakse niiskesse kambrisse. Antigeeni-antikeha kompleksi moodustumise kohtadesse ilmuvad sademejooned.

Sademete reaktsioonid pane katseklaasides (tsükli sadenemise reaktsioon), geelides, toitainekeskkonnas jne. Lai sai jaotuse Sadestamisreaktsiooni tüübid poolvedelas agaris või agaroosgeelis: topeltimmunodifusioon vastavalt Ouchterlonyle. radiaalne immunodifusioon, immunoelektroforees ja jne

Radiaalne immunodifusioonireaktsioon. Sulatatud agargeeliga immuunseerum valatakse ühtlaselt klaasile. Pärast geelis tahkumist tehakse süvendid, millesse antigeen asetatakse erinevates lahjendustes. Antigeen, difundeerudes geeli, moodustab antikehadega süvendite ümber rõngakujulised sadetsoonid (joonis 13.7). Sadestusrõnga läbimõõt on võrdeline antigeeni kontsentratsiooniga. Reaktsiooni kasutatakse erinevate klasside immunoglobuliinide, komplemendisüsteemi komponentide jms sisalduse määramiseks veres.

Immunoelektroforees- elektroforeesi ja immunosadestamise kombinatsioon: antigeenide segu viiakse geeli süvenditesse ja eraldatakse geelis elektroforeesi abil. Seejärel sisestatakse elektroforeesitsoonidega paralleelsesse soonde immuunseerum, mille antikehad, difundeerudes geeli, moodustavad antigeeniga kokkupuutepunktis sadenemisjoone.

Immuunelektronmikroskoopia- sobivate antikehadega töödeldud mikroobide, kõige sagedamini viiruste elektronmikroskoopia. Immuunseerumiga töödeldud viirused moodustavad immuunagregaate (mikrosademeid). Virioonide ümber moodustub antikehade "korolla", mis on kontrastiks fosfovolframhappe või muude elektron-optiliselt tihedate preparaatidega.

123. Sadestamisreaktsioon geelis mikroorganismide mürgisuse määramiseks, mehhanism, valmistamise meetodid.

Sadestumise reaktsioon (RP)- see on lahustuva molekulaarse antigeeni kompleksi moodustumine ja sadestumine antikehadega hägususe kujul, mida nimetatakse sademeks. See moodustub antigeenide ja antikehade segamisel samaväärsetes kogustes; ühe neist liig vähendab immuunkompleksi moodustumise taset.

1946. aastal pakkus J. Oudin välja lihtsa difusioonimeetodi, mille puhul üks sadestamisreaktsiooni komponentidest, tavaliselt seerum, on geelis ja teine ​​– antigeen – laotatakse esimese peale lahuse kujul. .

Antigeen, difundeerudes geeli, moodustab selles valged sademejooned koos antikehadega, mis on külgvalgustuse all selgelt nähtavad. 1948. aastal töötas J. Ouchterlonyu välja veelgi lihtsama ja mugavama kahemõõtmelise vastudifusiooni meetodi, mis võimaldab erinevaid antigeene ja seerumeid vahetult võrrelda. See meetod on väga väärtuslik ka ristreaktsioonide uurimisel.

Ouchterloni reaktsiooni seadistamiseks kasutage füsioloogilises lahuses valmistatud 1% agarit, mis valatakse 0,5 cm kihiga Petri tassidesse Pärast kõvenemist lõigatakse agariplaadist välja augud läbimõõduga 5-6 mm - üks tassi keskel, 4-5 - piki ümbermõõtu keskosast 1-2 cm kaugusel. Kesksesse süvendisse valatakse diagnostiline sadestav seerum ning perifeersetesse süvenditesse valatakse homoloogsete ja võrreldavate antigeenide lahus. Tulemused registreeritakse pärast 24-, 48- ja 72-tunnist inkubeerimist toatemperatuuril.

Antikehad ja antigeenid difundeeruvad üksteise suunas ning piirkondades, kus tekivad nende ekvivalentsed kontsentratsioonid, tekivad kaarjad sademeribad. Kui kahest kõrvuti asetsevast süvendist pärinevad sademete ribad ühinevad, näitab see mitme antigeense komponendi olemasolu uuritavas vedelikus. Bakterite, näiteks difteeria toksilisuse määramiseks kasutatakse sageli Ouchterlohni difusioonivastast reaktsiooni.

Geeli sadestamise meetodi edasiarendus on immunoelektroforees. See termin viitab meetodile, mis ühendab antigeenide segu elektroforeetilise eraldamise ja Ouchterloni vastudifusiooni samal agargeeliplaadil. Sadestav seerum valatakse geeli sisse lõigatud soonde paralleelselt elektroforeetilise eraldamise suunaga.

Reaktsiooni tulemusena moodustunud sademete jooned on antigeenifraktsioonide elektroforeetilise liikumise suunas pikenenud kaarekujulised. Immunoelektroforees võimaldab määrata kuni 30 komponenti sisaldavate lahustuvate antigeenide komplekssegude koostist ja on seetõttu väärtuslik diagnostiline meetod.

Sademete reaktsioon(RP) nimetatakse sademeks Ag lahusest (pretsipitinogeenist), kui see puutub kokku immuunseerumi (pretsipitiini) ja elektrolüüdiga.

RP abil on võimalik tuvastada antigeeni lahjendustes 1:100 000 ja isegi 1:1 000 000, st nii väikestes kogustes, mida keemiliselt ei tuvastata.

Pretsipitinogeenid on valk-PS iseloomuga ultramikroskoopilised osakesed: ekstraktid mikroorganismidest, elunditest ja kudedest, patumaterjal; bakterirakkude lagunemissaadused, nende lüsaadid, filtraadid. Sademed on kuumakindlad, mistõttu nende saamiseks materjal keedetakse.

RP kasutab vedelat läbipaistvat Ag-d.

Sadestavad seerumid saadakse tavaliselt küülikute hüperimmuniseerimisel mitmekuuliste tsüklitena, süstides neile bakterisuspensioone, puljongikultuuride filtraate, autolüsaate, mikroorganismide soolaekstrakte ja vadakuvalke.

Tootja RP Ascoli. Kitsasse katseklaasis väikese koguse lahjendamata sadestava seerumiga, hoides seda kaldus asendis, kantakse pipetiga aeglaselt piki seina sama kogus Ag-d.

Kahe vedeliku segunemise vältimiseks asetatakse katseklaas ettevaatlikult vertikaalselt. Kui reaktsioon on katseklaasis positiivne, tekib 5–10 minuti pärast seerumi ja uuritava ekstrakti piirile hallikasvalge rõngas. Reaktsiooniga kaasneb tingimata seerumi ja antigeeni kontroll.

Ascoli reaktsiooni kasutatakse siberi katku, tulareemia ja katku Ag tuvastamiseks.

Seda on kasutatud ka kohtumeditsiinis valgu tüübi, eelkõige vereplekkide määramiseks sanitaarpraktikas liha, kala, jahutoodete võltsimise ja piima lisandite tuvastamisel. Selle RP puuduseks on sademe (rõnga) ebastabiilsus, mis kaob isegi õrna raputamise korral. Lisaks ei saa seda kasutada sademe moodustumisel osalevate Ag-de kvantitatiivse koostise määramiseks.

Ouchterlony sademete reaktsioon. Reaktsioon viiakse läbi Petri tassidel agargeeli süvendites.

Geelina kasutatakse hästi pestud läbipaistvat agarit. Ag ja seerum lisatakse agargeelile nii, et neid sisaldavad süvendid oleksid teatud kaugusel. Üksteise poole difundeerudes ja omavahel kombineerides moodustavad antikeha ja antigeen 24–48 tunni pärast valge triibu kujul immuunkompleksi.

Kompleksse sadestava aine juuresolekul tekivad mitmed ribad. Sel juhul liidetakse seroloogiliselt seotud antigeenide ribad kokku ja erinevate ribad ristuvad, mis võimaldab määrata uuritavate ainete antigeense struktuuri üksikasju.

Kasutatakse laialdaselt eksotoksiine tootvate viiruste ja bakterite põhjustatud haiguste diagnoosimiseks.

3.Kaudne hemaglutinatsioonireaktsioon (IRHA). Seda kasutatakse polüsahhariidide, valkude, bakteriekstraktide, mükoplasmade, riketsia ja viiruste tuvastamiseks, mille immuunkomplekse aglutiniinidega ei ole tavapärase klassikalise RA korral näha, või antikehade tuvastamiseks patsientide seerumis nende kõrge hajutusega ainete ja väikeste mikroorganismide suhtes.

RNGA nakkushaiguste serodiagnostikaks. Kasutades RNGA-d antikehade tuvastamiseks patsientide seerumis, valmistatakse ette ERYTROCYTE ANTIGEN DIAGNOSTICS.

Sademete reaktsioon.

Selleks töödeldakse punaseid vereliblesid 15 minutit tanniinilahusega lahjenduses 1:20 000–1:200 000, mis annab neile stabiilsuse ja suurendab adsorptsioonivõimet. Seejärel segatakse need teadaoleva antigeeniga ja inkubeeritakse 2 tundi temperatuuril 37° C. Antigeeni suhtes sensibiliseeritud punaseid vereliblesid pestakse 2-3 korda isotoonilise naatriumkloriidi lahusega ja lisatakse seerumile, lahjendatakse ja valatakse süvenditesse. paneelidest.

Kontrolliks on puutumata ja antigeeniga laetud erütrotsüütide suspensioon, mis lisatakse seerumitele, mis annavad ilmselgelt positiivseid ja negatiivseid reaktsioone.

Reaktsioonitulemusi võetakse arvesse 2 tundi pärast inkubeerimist termostaadis ja hinnatakse plussidega: “++++” - punased verelibled katavad kaevu ebaühtlaste servadega vihmavarju kujul; “–” – punaste vereliblede kogunemine “nupu” kujul

Seotud Informatsioon:

Otsi saidilt:

Rõngasadestamise reaktsioon

Ringiretseptori test on üks lihtsamaid seroloogilisi meetodeid. Seda tehakse kitsastes sademetorudes. Kõigepealt valatakse kõikidesse katseklaasidesse võrdselt mitmes lahjenduses (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) võetud selge antigeeni lahus.

Antigeenide ja antikehade kombinatsioon toimub reaktiivide kokkupuute piiril. Selle interaktsiooni tulemusena moodustub positiivsetel juhtudel (kui antigeen ühtib antikehaga) mõne aja pärast opalestseeruva ringi kujul sade.

Reaktsioon on leidnud laialdast rakendust meditsiinipraktikas siberi katku antigeeni tuvastamiseks loomade villast, nahkadest ja lihast (Ascoli reaktsioon); teiste nakkushaiguste patogeenide tuvastamiseks patsientidelt saadud patoloogilises materjalis või keskkonnaobjektidel, samuti kohtuarstlikul läbivaatusel valgu, eelkõige verevalgu või muude bioloogiliste vedelike tüübi määramiseks.

Ouchterlony immunodifusioon

Sadestamisreaktsiooni võib läbi viia agargeelis.

Meetod põhineb sellel, et antigeenide ja antikehade osakesed oma erineva suuruse tõttu difundeeruvad geelis erineva kiirusega ja selle tulemusena liiguvad erinevatele kaugustele. See võimaldab eraldada üksikuid antigeenisüsteeme juhtudel, kui need on segus, ning seetõttu on võimalik uurida bakterite ja komplekssete valkainete, seerumite ja loomsete kudede antigeenset struktuuri.

Ouchterlony pakkus välja selge ja tõhusa geelisadestamise meetodi.

Petri tassidele tehakse agariga väikesed augud, mis lõigatakse üksteisest teatud kaugusele. Ühte neist valatakse antigeen, teistesse seerum. Reaktsioonikomponendid difundeeruvad geelis üksteise suunas ja moodustavad nähtava sadestumisjoone, kus antigeenid vastavad sellele spetsiifiliste antikehade optimaalsele kontsentratsioonile. Kuna reagendid difundeeruvad süvenditest kontsentriliselt, saab teha mitu analüüsi, asetades antikeha süvendi ümber mitu erinevat antigeene (või sama antigeeni erinevaid lahjendusi) sisaldavaid süvendeid.

Ouchterlony reaktsioon võimaldab teadaoleva seerumi põhjal teha järelduse antigeeni olemuse kohta ja vastupidi, teadaoleva antigeeni põhjal määratakse antikehade olemus.

Meetodi eeliseks on see, et see võimaldab võrrelda komplekssete segude antigeenseid komponente ja hinnata nende sarnasusi või erinevusi. Antigeenide ühisuse võrdlemiseks valmistage süvenditega agar: ühte valatakse antiseerum ja teise valatakse võrreldavad antigeenid. Kui antigeenid on erinevad, paiknevad sademete ribad erinevalt.

Immunoelektroforees

Viimastel aastatel on delikaatsete immunoloogiliste uuringute jaoks kasutatud immunoelektroforeesi meetodit. Meetodit kirjeldas esmakordselt P.

Grabar ja K. A. Williams 1953. See on kombinatsioon agargeeli elektroforeesist klaasplaatidel koos immunodifusiooniga. Esiteks eraldatakse elektroforeetiline antigeen, mis sageli on valgu või muude molekulide segu. Selleks viiakse antigeen agaris eelnevalt lõigatud süvendisse ja agarplaat asetatakse mõneks ajaks konstantse elektrivoolu tsooni.

Molekulide erineva liikumiskiiruse tõttu jaguneb antigeen selle komponentideks. Pärast seda viiakse sadestav immuunseerum soonde, mis on lõigatud vooluvooluga paralleelses suunas.

Antigeen ja antiseerum difundeeruvad geelis üksteise suunas.

Sademed

Iga antigeen tekitab kaarekujulise sadestumistsooni koos vastavate antikehadega. Nende joonte arv, asukoht ja kuju annavad aimu algse antigeenisegu koostisest.

Flokulatsiooni reaktsioon

Meetodi pakkus välja Ramon 1924. aastal.

See põhineb asjaolul, et toksiini segu antitoksilise seerumiga annab teatud tingimustel hägusust ja sadet. Sellisel juhul toimub reaktsioon varem neis katseklaasides, kus antitoksiini kogus vastab annusele, mis selle toksiinikoguse täielikult neutraliseerib.

Seega, kui toksiini tugevus on teada, saab määrata antitoksiini koguse tundmatus testitavas seerumis. Selleks valmistage testitavast seerumist mitu lahjendust, lisage igale lahjendusele võrdne kogus teadaolevat toksiini ja seejärel jälgige, millises katseklaasis flokulatsioon (lahuse hägusus) toimub kõigepealt. Esialgne flokulatsioon määratakse. Seejärel tehakse arvutus.

Näiteks on vaja määrata difteeriavastaste antikehade kontsentratsioon uuritavas seerumis. Reaktsioonis kasutatakse difteeriatoksiini, mis sisaldab 50 Lf 1 ml-s (Lf on minimaalne toksiini kogus, mille neutraliseerib 1 antitoksiline ühik (AU) antiseerumit).

Oletame, et esialgset flokulatsiooni täheldati katseklaasis, mis sisaldas 0,2 ml seda seerumit ja 2 ml teadaolevat toksiini aktiivsusega 100 Lf (50 Lf x 2).

See tähendab, et 0,2 ml seerumit neutraliseeris selle toksiini. Seetõttu sisaldab 0,2 ml seerumit 100 AE ja 1 ml selles seerumis vastab antikehade kontsentratsioon 500 AE-le (100 AE x 5).

Sarnasel meetodil saab flokulatsioonireaktsiooni kasutada vastupidisel eesmärgil – toksoidide immuniseerivate omaduste määramiseks.

Selleks on vaja standardset antitoksilist seerumit.

Neutraliseerimisreaktsioon

Reaktsiooni kasutatakse bakteriaalse toidumürgituse diagnoosimisel uuritavas materjalis leiduvate bakteriaalsete toksiinide määramiseks. Lisaks saab seda kasutada teatud keskkonnaobjektidel toksiine tootvate patogeensete bakterite sisalduse uurimiseks, näiteks pinnase uurimiseks teetanuse või gaasigangreeni patogeenide esinemise suhtes.

On teada, et homoloogse antitoksilise seerumiga segatud toksiin ei avalda oma toksilist toimet, kuna toksiin neutraliseeritakse. Toksiini interaktsioonireaktsioon antitoksiiniga on reeglina rangelt spetsiifiline, seetõttu on toksiini tüübi määramiseks neutraliseerimisreaktsiooni läbiviimiseks vaja igale tüübile ja tüübile spetsiifilisi diagnostilisi seerumeid. toksiini. Kui eeldatakse mitme toksiini esinemist uuritavas materjalis, võib samaaegselt kasutada 2–3 või enama antitoksilise seerumi segu.

Neutraliseerimisreaktsioon võimaldab teil määrata patogeeni toksiini tüübi ja tüübi.

Testitav materjal võib olla väidetavalt mürgistuse põhjustanud toiduainete filtraat, väljauhtumised nõudest, kus need tooted asusid jne.

Esmalt neutraliseeritakse kahtlustatav toksiin. Selleks lisatakse katseklaasi koos uuritava materjaliga (katseklaas) antitoksiline diagnostiline seerum (sisaldab soovitud toksiini antikehi); võrdne kogus füsioloogilist lahust lisatakse teise katseklaasi (kontroll).

Pärast lühiajalist inkubeerimist manustatakse katseklaaside sisu kahele valgete hiirte rühmale (eksperimentaal- ja kontrollhiirtele).

Neutraliseerimisreaktsiooni tulemusi võetakse arvesse kohe pärast kontrollloomade surma. Sel juhul näitab koos uuritava materjaliga antitoksilist seerumit saanud loomade ellujäämise fakt manustatud seerumile vastava toksiini olemasolu selles.

Neutraliseerimisreaktsiooni eeliseks on saadud tulemuste kõrge usaldusväärsus.

Oma tundlikkuse ja vastuse saamise kiiruse poolest jääb see aga alla mõnele teisele uurimismeetodile.

Lüüsi reaktsioonid

Lüüsireaktsioonideks nimetatakse tavaliselt korpuskulaarsete antigeenide lahustumist antud antigeeni suhtes spetsiifiliste antikehade mõjul komplemendi juuresolekul.

Immuunreaktsioonidest, mis põhinevad bakterite ja teiste korpuskulaarsete antigeenide lüüsi nähtusel, kasutatakse peamiselt bakteriolüüsi ja hemolüüsi reaktsioone.

Bakteriolüüsi reaktsioon

Reaktsioon toimub nii in vitro kui ka in vivo. Viimast nimetatakse V.I. reaktsiooniks. Isaev-Pfeiffer.

Need teadlased on näidanud, et kui merisead on eelimmuniseeritud koolera antigeenidega, siis hilisem väga virulentse Vibrio cholerae kultuuri kõhuõõnde süstimine ei põhjusta loomade nakatumist, kuna patogeen lahustub kõhuõõnde all. spetsiifiliste antikehade mõju.

Järgnevalt I.

I. Mechnikov tõestas, et sarnane Vibrio cholerae lahustumine immuunseerumi mõjul toimub katseklaasis, kui põhikomponentidele lisatakse komplemendi allikaks olev värske seerum. Bakterite lahustumist spetsiifiliste antikehade toimel komplemendi juuresolekul nimetatakse bakteriolüüsi reaktsiooniks.

Bakteriolüüsireaktsiooni käivitamisel valmistatakse esmalt testitava seerumi 10-kordsete lahjenduste seeria. Seejärel lisatakse igasse katseklaasi sama kogus (1-2 tilka) mikroobide suspensiooni. Segule lisatakse komplement. Pärast inkubeerimist 37 °C juures inokuleeritakse segu igast katseklaasist toitainekeskkonda, et määrata elujõuliste bakterite olemasolu või puudumine.

Reaktsiooni saab kasutada antikehade määramiseks teadaoleva mikroorganismi abil või mikroobi tüübi määramiseks diagnostilise immuunseerumi abil.

Bakterioloogide praktilises töös kasutatakse seda reaktsiooni harva, peamiselt koolera ja kooleralaadsete vibrioonide eristamiseks.

Hemolüüsi reaktsioon

Hemolüüsi mehhanism on sarnane bakteriolüüsi mehhanismiga.

Reaktsioonis kasutatavad punased verelibled on antigeen. Antikehade allikaks on erütrotsüütide vastane seerum (näiteks kui reaktsioonis kasutatakse lamba erütrotsüüte, siis vajalik spetsiifiliste erütrotsüütide vastaste antikehadega seerum saadakse lamba erütrotsüütidega immuniseeritud küülikutelt).

Merisea vereseerumit kasutatakse lüüsireaktsioonides kõige sagedamini komplemendina, kuna see sisaldab oluliselt rohkem komplementi kui teiste loomade seerumid.

Juhtudel, kui antikehad komplemendi juuresolekul hävitavad punaseid vereliblesid, väljub neist hemoglobiin ja punaste vereliblede häguse suspensiooni reageeriv segu muutub läbipaistvaks punaseks vedelikuks (lakitud veri).

Seda reaktsiooni nimetatakse hemolüüsiks. Laboratoorses praktikas kasutatakse seda komplemendi sidumise reaktsioonis komplemendi adsorptsiooni indikaatorina.

Seotud Informatsioon:

Otsi saidilt:

Loengu konspekt: ​​Mikrobioloogia õppeaine ja lühiajalugu. Mikroorganismide üldised omadused ja asukoht looduses.

sademete reaktsioon

Veterinaarmikrobioloogia ja selle ülesanded

mir.zavantag.com > Bioloogia > Loeng

1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15

7 8 9 10 11 12 13 14 15

Sarnased:

Lisage oma veebisaidile nupp:
Kooli materjalid
mir.zavantag.com

Sademete reaktsioon

Sadestumine ja aglutinatsioon on üsna sarnased reaktsioonid, mis erinevad peamiselt AG füüsikaliste omaduste põhjal.

Esimesel juhul on see lahustuv, teisel - korpuskulaarses vormis. RP aluseks on sademe moodustumine AG-AT reaktsiooni käigus. RP on väga spetsiifiline ja tundlik.

Reaktsiooni koostisosad:

1. lahustuv AG või hapteen (pretsipitogeen);

2. AT - sadestavad seerumid (immuunset sadestav seerum; saadakse küülikute immuniseerimisel antigeenide sobivate lahustega);

Sademete reaktsioon

isotooniline naatriumkloriidi lahus või agargeel.

RP seadistamise meetodid:

1) RP lahustes - lk.

ring sademed;

2) RP geelis.

Ringsadestamisreaktsioon viiakse läbi kitsastes sadestamistorudes, millesse valatakse sadestavad seerumid.

Seejärel valatakse sademelahus. Kui reaktsioon on positiivne, ilmub koostisainete liidesele hägune sademete ring. Selle RP staadiumis meetodi näiteks on Ascoli termosadestamisreaktsioon, mida kasutatakse siberi katku patogeeni termostabiilse hapteeni tuvastamiseks, ekstraheeritakse loomaorganitest, nahast, ja villa ekstraheerimise teel keetmise teel.Üks RP sortidest geelis (Ouchterlony reaktsioon) võimaldab määrata difteeriabatsilli toksilisust antitoksilise seerumi abil.

Antitoksilise difteeriavastase seerumiga immutatud filterpaberi riba asetatakse Petri tassi koos toitesöötmega ja nakatatakse katsekultuuridega paberiribaga risti olevate triipude kujul. Inkubeerida 37 PS juures 24 tundi. Toksigeense kultuuri juuresolekul tekivad toksiini ja antitoksiini interaktsiooni kohas sadestamisjooned Geelis toimuvat sadestumisreaktsiooni nimetatakse immunodifusiooniks.

Sageli forees geelis - immunoelektroforees. Meetodi põhimõte: uuritav antigeen fraktsioneeritakse elektroforeetiliselt. saadud fraktsioone analüüsitakse topeltdifusiooniga, kasutades antiseerumit.

Ascoli test tehakse siberi katku diagnoosimiseks, et tuvastada siberi katku batsillide antigeen. Sadestamisreaktsiooni läbiviimiseks peab teil olema: sadestamine - hapteen B.

Antrachis (koeekstrakt), sade (sadenev siberi katku seerum) ja soolalahus.

Termosadestamise valmistamine.

1. Täitke 8 kolb, mis sisaldab 1 g purustatud nahka või 1 ml B. antilgas kultuuri, 10 ml füsioloogilise lahusega.

2. Asetage kolb 30–45 minutiks keeduvanni.

3. Filtreerige läbi asbestimaterjali. Filtraat peab olema täiesti läbipaistev. Sadestamisreaktsiooni jaoks lahjendatakse filtraati 100 korda või rohkem.

Rõngasadestamise reaktsiooni seadistamine.

1) 0,3 ml sadestavat seerumit, tervena või lahjendatuna 1:5, 1:10, valatakse sadestamistorusse.

2) Pretsipitinogeen kantakse ettevaatlikult piki katseklaasi seina.Reaktsioon loetakse positiivseks, kui kahe vedeliku piirile moodustub mitte hiljem kui 5-15 minuti jooksul hägune sadeneva valgu ring.

Sadestamisreaktsiooni seadistamisel kasutatakse järgmisi juhtseadiseid:

a) antigeen ja soolalahus;

b) spetsiifiline seerum ja füüsikaline.

c) antigeen ja mittespetsiifiline seerum.

Kõigis kontrolltorudes ei tohiks olla hägusust.Sadestamisreaktsiooni jaoks kasutatakse spetsiaalseid sademetorusid kõrgusega 40-60 mm ja läbimõõduga 4-5 mm Kitsates torudes sadestumine toimub palju kiiremini ja ilmneb selgemalt kui Tavalised torud pestakse ja kuivatatakse põhjalikult, nii et nende klaas on täiesti läbipaistev ja kuiv.

Sademete reaktsioon(RP) nimetatakse sademeks Ag lahusest (pretsipitinogeenist), kui see puutub kokku immuunseerumi (pretsipitiini) ja elektrolüüdiga. RP abil on võimalik tuvastada antigeeni lahjendustes 1:100 000 ja isegi 1:1 000 000, st nii väikestes kogustes, mida keemiliselt ei tuvastata.

Pretsipitinogeenid on valk-PS iseloomuga ultramikroskoopilised osakesed: ekstraktid mikroorganismidest, elunditest ja kudedest, patumaterjal; bakterirakkude lagunemissaadused, nende lüsaadid, filtraadid. Sademed on kuumakindlad, mistõttu nende saamiseks materjal keedetakse. RP kasutab vedelat läbipaistvat Ag-d.

Sadestavad seerumid saadakse tavaliselt küülikute hüperimmuniseerimisel mitmekuuliste tsüklitena, süstides neile bakterisuspensioone, puljongikultuuride filtraate, autolüsaate, mikroorganismide soolaekstrakte ja vadakuvalke.

Tootja RP Ascoli. Kitsasse katseklaasis väikese koguse lahjendamata sadestava seerumiga, hoides seda kaldus asendis, kantakse pipetiga aeglaselt piki seina sama kogus Ag-d. Kahe vedeliku segunemise vältimiseks asetatakse katseklaas ettevaatlikult vertikaalselt. Kui reaktsioon on katseklaasis positiivne, ilmub 5–10 minuti pärast seerumi ja uuritava ekstrakti piirile hallikasvalge rõngas. Reaktsiooniga kaasneb tingimata seerumi ja antigeeni kontroll.

Ascoli reaktsiooni kasutatakse siberi katku, tulareemia ja katku Ag tuvastamiseks. Seda on kasutatud ka kohtumeditsiinis valgu tüübi, eelkõige vereplekkide määramiseks sanitaarpraktikas liha, kala, jahutoodete võltsimise ja piima lisandite tuvastamisel. Selle RP puuduseks on sademe (rõnga) ebastabiilsus, mis kaob isegi õrna raputamise korral. Lisaks ei saa seda kasutada sademe moodustumisel osalevate Ag-de kvantitatiivse koostise määramiseks.

Ouchterlony sademete reaktsioon. Reaktsioon viiakse läbi Petri tassidel agargeeli süvendites. Geelina kasutatakse hästi pestud läbipaistvat agarit. Ag ja seerum lisatakse agargeelile nii, et neid sisaldavad süvendid oleksid teatud kaugusel. Üksteise poole difundeerudes ja omavahel kombineerides moodustavad antikeha ja antigeen 24–48 tunni pärast valge triibu kujul immuunkompleksi. Kompleksse sadestava aine juuresolekul tekivad mitmed ribad. Sel juhul liidetakse seroloogiliselt seotud antigeenide ribad kokku ja erinevate ribad ristuvad, mis võimaldab määrata uuritavate ainete antigeense struktuuri üksikasju. Kasutatakse laialdaselt eksotoksiine tootvate viiruste ja bakterite põhjustatud haiguste diagnoosimiseks.

3.Kaudne hemaglutinatsioonireaktsioon (IRHA). Seda kasutatakse polüsahhariidide, valkude, bakterite ekstraktide, mükoplasmade, riketsia ja viiruste tuvastamiseks, mille immuunkomplekse aglutiniinidega ei ole tavapärase klassikalise RA korral näha, või antikehade tuvastamiseks patsientide seerumis nende kõrge hajutusega ainete ja väikeste mikroorganismide suhtes.

RNGA nakkushaiguste serodiagnostikaks. Kasutades RNGA-d antikehade tuvastamiseks patsientide seerumis, valmistatakse ette ERYTROCYTE ANTIGEN DIAGNOSTICS. Selleks töödeldakse punaseid vereliblesid 15 minutit tanniinilahusega lahjenduses 1:20 000–1:200 000, mis annab neile stabiilsuse ja suurendab adsorptsioonivõimet. Seejärel segatakse need teadaoleva antigeeniga ja inkubeeritakse 2 tundi temperatuuril 37° C. Antigeeni suhtes sensibiliseeritud punaseid vereliblesid pestakse 2-3 korda isotoonilise naatriumkloriidi lahusega ja lisatakse seerumile, lahjendatakse ja valatakse süvenditesse. paneelidest. Kontrolliks on puutumata ja antigeeniga laetud erütrotsüütide suspensioon, mis lisatakse seerumitele, mis annavad ilmselgelt positiivseid ja negatiivseid reaktsioone.

Reaktsioonitulemusi võetakse arvesse 2 tundi pärast inkubeerimist termostaadis ja hinnatakse plussidega: “++++” - punased verelibled katavad kaevu ebaühtlaste servadega vihmavarju kujul; “–” – punaste vereliblede kogunemine “nupu” kujul

SADEMISE REAKTSIOON GEELIS, RPG
(geeli sadenemise test)

Meetod antigeenide ja antikehade tuvastamiseks, mis põhineb komponentide difusioonil läbi agari (agaroos) geelikihi ja nähtava sademe moodustumisel piirkondades, kus tekivad nende ekvivalentsed kontsentratsioonid.

Kõige sagedamini kasutatav meetod on O. Uchterloni poolt 1948. aastal välja pakutud topelt (vastu)difusioon, mille puhul antigeenid ja seerumid sisestatakse geelplaadile lõigatud vastandlikesse süvenditesse; teatud aja möödudes moodustuvad geeli paksusesse sademeribad, mis vastavad sama spetsiifilisusega antigeenide ja antikehade arvule. Lisaks võimaldab meetod võrrelda mitut antigeeni omavahel, kasutades teatud standardset seerumit: kui need on identsed, ühinevad nende moodustunud sademeribad pidevaks jooneks ja vastupidi, ribad ristuvad, kui võrreldavatel antigeenidel on erinevusi ( niinimetatud "spurdi" fenomen). Teine RPG eelis on see, et antigeenide segusid saab eraldada erinevate difusioonikiirustega ja tuvastada individuaalselt; Samal põhjusel võib eraldada ka sadenemise inhibiitorid, kui need sisalduvad uuritavas materjalis. Meetodi puuduseks on selle madal tundlikkus ehk eraldusvõime. RPG-d kasutati 60ndatel ja 70ndatel laialdaselt testina B-hepatiidi viiruse antigeenide ja nende vastaste antikehade tuvastamiseks, eelkõige selle reaktsiooni abil e-antigeeni olemasolu või