ELISA diagnostika: mis on olemus, antikehade määratlus, kuidas seda tehakse ja milliste haiguste korral on see efektiivne? ELISA - mis see on, ELISA vereanalüüsi tulemuste dekodeerimine

ELISA tuvastab paljude haiguste spetsiifilised antikehad või antigeenid. Tänu diagnostikatehnoloogiale tuvastatakse valgu päritolu ained. Raviarst selgitab, miks ELISA on positiivne ja mida see tähendab. Diagnoosi tegemiseks võetakse arvesse analüüsi tulemusi ja patsiendi ajalugu.

Mida see tähendab

Uurimismeetodit hakati rakendama mitukümmend aastat tagasi. Sellest ajast alates on tehnoloogia paranenud, tulemuste täpsus on suurenenud. Diagnostika eeliseks on kõrge tundlikkus. Samuti on puudus - tehnika hõlmab antud agendi otsimist, s.t. selle olemasolu kehas tuleb eeldada.

Võõrosake (antigeen) siseneb kehasse koos nakkusetekitaja (tekitaja). Antigeen võib olla ka kellegi teise vere osake, mis ei vasta rühmale. Selliste tegurite olemasolu põhjustab immuunvastuse. Keeruliste närviprotsesside tulemusena tekib immunoglobuliinide tootmine. Nad ühinevad võõraste molekulidega, luues immuunkompleksi. Sellisel kujul tunneb organism osakesed kergemini ära ja hävitab need immuunsüsteemi abiga. Iga mikroorganismi tüübi jaoks toodetakse spetsiifilisi antikehi.

Analüüsiks võetakse verd veenist. Seejärel eemaldatakse materjalist vormitud ühendid, mis võivad uuringut segada. Mõnikord võetakse bioloogilise materjalina proove limaskestast või tserebrospinaalvedelikust, mõnel juhul analüüsitakse lootevett. Laboris kasutatakse spetsiaalseid plaate, mille kaevudes on ettevalmistatud patogeensete mikroorganismide osakesed. Laborant asetab kogutud materjali sinna ja jälgib, kas tekivad immuunühendid.

Täpsete tulemuste saamiseks on vaja analüüsi teha tühja kõhuga. Viirusevastased ravimid ja antibiootikumid tuleb lõpetada 2 nädalat enne materjali võtmist.

Analüüs võimaldab teil kinnitada järgmisi haigusi:

• toksoplasmoos;
• erinevat tüüpi herpes;
• tsütomegaloviirus;
• salmonelloos;
• düsenteeria;
• helikobakteri infektsioon;
• leetrid;
• puukentsefaliit;
• punetised;
• reproduktiivsüsteemi haigused;
• hepatiit.

See on mittetäielik retseptide loetelu, see hõlmab ka tuulerõugeid, süüfilist ja muid haigusi, sealhulgas neid, mida põhjustavad mitmesugused kookid.

Vähemalt ühe immunoglobuliini tuvastamine näitab, et ELISA tulemus on positiivne:

1. IgM tuvastamine näitab nakkuspatoloogia ägedat staadiumi. See kinnitab IgA samaaegset olemasolu. Negatiivne tulemus võib mõnel juhul tähendada kroonilist haigust.
2. Positiivne IgA indikaator annab märku haigusest, mis esineb varjatud kujul, või kroonilise protsessi olemasolust.
3. IgG tuvastamine erinevatel juhtudel võib tähendada haiguse kroonilise vormi esinemist või viidata remissioonile.

Vorm võib sisaldada teavet ainult patogeeni olemasolu või puudumise kohta. Mõnel juhul on näidatud kvantitatiivne näitaja. Mõnikord on uuringu eesmärk antikehade kontsentratsiooni taseme määramine. Selleks määratakse ELISA positiivsuse koefitsient. See indikaator võimaldab teil määrata, kui kaua patoloogiline protsess kehas kestab.

Mida teha

Nakkushaiguste spetsialist tegeleb nakkushaiguste diagnoosimise ja raviga, seetõttu määrab enamikul juhtudel uuringu just see spetsialist.

Kui ELISA andis positiivse tulemuse, peate konsulteerima arstiga. Iseseisvalt järelduste tegemine, ravi läbiviimine on vastuvõetamatu. Üksinda on näitajatest raske aru saada, tulemuste ärakiri tuleb hankida spetsialistilt.

Vereanalüüsi näitajaid võivad mõjutada sellised tegurid nagu suitsetamine, alkoholi tarbimine ja teatud ravimite rühmade kasutamine. Arst võib tulemustes vigade kõrvaldamiseks määrata teise uuringu. Mõnikord määratakse diagnoosi kinnitamiseks täiendavad testid.

Ärge tehke positiivse testiga enneaegseid järeldusi. Kuid õigeaegne uuring võimaldab teil haigust tuvastada ja määrata vajaliku ravi.

Kokkupuutel

(ELISA) on laboratoorse vereanalüüsi meetod, mis põhineb spetsiaalsete rakkude - erinevate haiguste antikehade - otsimisel. Meetod võimaldab mitte ainult tuvastada patogeeni, vaid ka kindlaks teha, millises staadiumis patoloogiline protsess on. Viimane on patsiendi prognoosi ja edasise ravi seisukohalt väga oluline.

Meetodi eelised ja puudused

Kõigist kaasaegsetest diagnostikameetoditest on ELISA kõige uuenduslikum ja tehniliselt täpsem. Selle peamised eelised on järgmised:

1. Võimalus otsida patsiendi verest kõiki olemasolevaid nakkushaiguste antikehi.
2. Uurimismeetodi kõrge kättesaadavus. Tänapäeval saab ELISA analüüse teha igas keskmise suurusega laboris.
3. Meetodi spetsiifilisus ja tundlikkus peaaegu 100%.
4. Võimalus otsida antikehi ja antigeene, samuti tuvastada patoloogilise protsessi staadium ja jälgida selle dünaamikat tänu arvude võrdlemisele.

Sellised eelised teiste testide ees varjutavad täielikult analüüsi ühe ja ainsa puuduse: see suudab tuvastada antikehi, kuid mitte patogeeni ennast.

Analüüsi hindamise põhiterminid

Selleks, et mõista, mis on ELISA analüüs, mis see on ja kuidas seda tehakse, tuleb tutvuda spetsialistide kasutatavate põhimõistetega.

1. Antikeha- valk, mida toodavad inimese immuunsüsteemi rakud (B-tüüpi lümfotsüüdid). Nad reageerivad spetsiifilise reaktsiooniga võõrkeha või aine allaneelamisele. Antikehade teine ​​nimetus on immunoglobuliinid, need kuuluvad erinevatesse klassidesse: A, E, M, G. Need erinevad üksteisest massi, reaktsioonikiiruse, poolestusaja ja mitmete muude omaduste poolest. Tavaliselt sisaldab inimese veri peamiselt klassi G immunoglobuliine. Kui tekib mõni infektsioon, suureneb järsult immunoglobuliinide A ja M hulk. Immunoglobuliinid E on seotud allergiliste reaktsioonidega.
2. Antigeen- orgaanilise päritoluga ja suure molekulmassiga võõrkeha. Enamasti on need patogeenid või nende bioloogiliselt aktiivsed ained.
3. Antigeen-antikeha kompleks ehk immuunkompleks on otseselt võõraine ja immunoglobuliini kombinatsioon, mis tekitab immuunvastuse.

Meetodi olemus ja ulatus

Patsientidel tekib sageli küsimus: ELISA analüüs, mis see on, kuidas seda tehakse ja milleks see on ette nähtud? Meetodi kohta saate rääkida ligipääsetaval viisil, kirjeldades lühidalt selle etappe.

Ettevalmistav etapp. Laboriarst kasutab spetsiaalset 96 süvendiga plaati. Iga süvendi pinnale kantakse konkreetse patogeeni antigeen.

1. etapp Võetakse verd, mis seejärel kantakse tilkhaaval kaevu. Kaev käivitab reaktsiooni antigeeni ja veres oleva antikeha vahel.

2. etapp Kaevus on reaktsioon täies hoos immuunkomplekside tekkega. Selle tulemusena moodustub teatud värvi aine. Värvi intensiivsus sõltub iga konkreetse patogeeni antikehade hulgast patsiendi veres.

3. etapp Tulemuse hindamine fotomeetriliselt. Selleks kasutatakse spetsiaalset seadet, mida nimetatakse spektrofotomeetriks. See võrdleb materjali tihedust süvendis ja kontrollproovis. Lisaks genereerib seade matemaatilise analüüsi tulemuse.

ELISA tulemuste hindamine ja eesmärk

Tulemuse tõlgendamine sõltub mitmest olulisest nüansist:

1. Kaevu optiline tihedus.
2. Kaevuplaadi tootja (testisüsteemid).
3. Laboratoorium, kus uuring tehti.

Arvestades neid nüansse, ei tohiks kunagi võrrelda kahte erinevatest katsesüsteemidest või erinevatest laboritest saadud tulemust.

Teine oluline punkt, mis ELISA analüüsi mõjutab, on nn antikehade aviidsus. See parameeter iseloomustab antigeeni kogust, sideme tugevust antigeeni-antikeha kompleksis. Selle määratlus põhineb immuunkompleksi töötlemisel karbamiidiga valgu struktuuride lahendamiseks. See võimaldab hävitada nõrgad sidemed antigeeni ja antikeha vahel ning jätta alles ainult tugevad. Uuringu tähtsus aviidsuse seisukohalt seisneb selles, et selle abil saab välja selgitada nakatumise kestuse. See teave on rasedate naiste diagnoosimisel äärmiselt oluline.

ELISA vereanalüüs aitab:

1. Erinevate patogeenide antigeenide otsimiseks.
2. Hormonaalse tausta uurimine.
3. Autoimmuunhaiguse olemasolu testimiseks.
4. Vähimarkerite tuvastamiseks.

ELISA sordid

ELISA analüüsil on järgmised variandid:

1. Kaudne.
2. Otse.
3. Konkurentsivõimeline.
4. blokeerimismeetod.

Kuid tegelikult kasutatakse tänapäeval ainult meetodit, mida nimetatakse ELISA-ks (enzyme linked immunosorbent assay). See põhineb ülalkirjeldatud reaktsioonil, mille käigus moodustub antigeen-antikeha kompleks koos värvimuutusega süvendi pinnal.

Erilist tähelepanu väärib otseselt kvantitatiivne ELISA vereanalüüs. See ei ole analüüsi tüüp, vaid tulemuste hindamise viis. Tänu temale loendatakse antikehade arv ja määratakse nende klassid. Tulemus sõltub proovi optilisest tihedusest, testsüsteemist, millel ELISA tehti, ja ka laborist.

ELISA abil tuvastatud haigused

ELISA on vereanalüüs, mis võimaldab tuvastada tohutul hulgal erinevaid nakkushaigusi. Pealegi tuvastatakse võrdse täpsusega nii viirus- kui ka bakteriaalsed haigused. Näiteks immuunkomplekside moodustamise abil on võimalik tõestada järgmiste haiguste tekitajate antigeenide olemasolu:

Lisaks võimaldab ELISA tuvastada:

1. Vähimarkerid - TNF (kasvaja nekroosifaktor), PSA (eesnäärme-spetsiifiline antigeen), CEA (vähi-embrüonaalne antigeen), CA-125 (munasarja kasvaja marker)
2. Rasedushormoon on hCG (inimese kooriongonadotropiin).
3. Reproduktiivsüsteemi häired: naiste ja meeste reproduktiivsüsteemi hormoonid.
4. Kilpnäärme patoloogia.

Oluline on mainida, et HIV-i ELISA test on tänapäeval peamine viis selle ohtliku haiguse diagnoosimiseks.

ELISA materjal ja proovivõtu tehnika

ELISA tegemiseks võetakse patsiendilt tühja kõhuga verd. Lisaks saadakse verest seerum, mida kasutatakse vahetult analüüsiks. Lisaks saab ELISA-d teha tserebrospinaalvedeliku (CSF), emakakaela lima (emakakaela), lootevee ja isegi klaaskeha vedeliku (silmamuna) suhtes.

Enne vereloovutamist hoiatatakse patsienti, et ta ei tohi mingeid ravimeid võtta ning ravi antibiootikumide ja viirusevastaste ravimitega on soovitatav lõpetada vähemalt kaks nädalat enne vereproovi võtmist.

Tulemuste kättesaamise ja tõlgendamise tingimused

Laborist vastuse saamise aeg ei sõltu selle töö kiirusest, vaid haiguse staadiumist ja sellest, millised antikehad on juba verre ilmunud. Näiteks: immunoglobuliinid M ilmuvad umbes 2 nädalat pärast vereanalüüsi võtmist ja tähendavad, et protsess on primaarse infektsiooni staadiumis või on toimunud kroonilise infektsiooni ägenemine. Samal ajal tekivad esmase nakatumise ajal klasside M ja G antikehad. Veelgi enam, viimast saab tuvastada 4 nädala pärast.

IgA ilmneb 2-3 nädala pärast kas üksi või koos M-ga, mis viitab ägedale infektsioonile või koos G-ga, mis näitab kroonilist protsessi.

Sellised erinevad terminid antikehade ilmumiseks veres panevad patsiendi tulemust kaua ootama. Pärast ELISA analüüsi tegemist on vastuvõetav oodata rohkem kui kuu. Arsti poolt dekodeerimine ja tõlgendamine võtab samuti teatud aja.

Samoilikov Pavel Vladimirovitš Kliinilise laboratoorse diagnostika osakonna praktikant

Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool

Immunoanalüüsi meetodeid on meditsiinipraktikas laialdaselt kasutatud. Kõigis kaasaegse meditsiini valdkondades kasutatakse immuunanalüüsi, peamiselt diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel. Eriti oluline on, et need võimaldaksid tuvastada bioloogilisi komponente (hormoonid, ensüümid, neuropeptiidid, immuunsüsteemi tooted, antigeenid jne) madalal ja väga madalal kontsentratsioonil. Nende meetoditega tuvastatakse kõik tooted, mille vastu on võimalik antikehi saada.

Immuunanalüüs põhineb antigeeni (AG) ja antikeha (AT) interaktsioonil, kasutades ühe komponendi (ensüüm, radionukliid, fluorestsentsvärv ja teised) erinevaid märgistamisvõimalusi. Reaktsiooni hindamine toimub automaatselt spetsiaalse seadmega, mis võimaldab neid meetodeid standardida.

Olenevalt kasutatava märgise tüübist ja testi seadistamise tingimustest nimetatakse immuunanalüüsi ensüümi immuunanalüüsiks (ELISA), radioimmunoanalüüsiks (RIA), immunofluorestsentsanalüüsiks ja muudeks. Kui reaktsioonid on lavastatud ühes või mitmes etapis, nimetatakse neid otsesteks või kaudseteks. Oluline on keskkond, milles reaktsioon läbi viiakse. Kui reaktsioon viiakse läbi pinnale fikseeritud reagentidega, nimetatakse test tahkefaasiliseks testiks, näiteks ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs).

Selles artiklis käsitletakse ainult ensüümi immuunanalüüsi - meetodit, mida kasutatakse laialdaselt bioloogias ja meditsiinis, nii praktilises kui ka fundamentaalses mõttes.

ELISA ilmus 60. aastate keskel ja töötati algselt välja meetodina antigeeni tuvastamiseks histoloogilises preparaadis, samuti sademete joonte visualiseerimiseks immunodifusioonitestis ja immunoelektroforeesis ning seejärel hakati seda kasutama antigeenide ja antigeenide kvantitatiivseks määramiseks. antikehad bioloogilistes vedelikes. Meetodi väljatöötamises osalesid E. Engvall ja R. Pelman, samuti neist sõltumatult W. Van Veeman ja R. Schurs.

Joonis 1. ELISA põhiprintsiip.

1) Antigeenide tuvastamiseks. 2) Antikehade tuvastamiseks.

Meetod põhineb antikeha spetsiifilisel seondumisel antigeeniga, kusjuures üks komponentidest on konjugeeritud ensüümiga, reaktsiooni tulemusena vastava kromogeense substraadiga moodustub värviline saadus, mille kogust saab määratakse spektrofotomeetriliselt (joonis 1).

Antigeenide ja antikehade immobiliseerimise võimaluse avastamine erinevatel kandjatel, säilitades samal ajal nende seondumisaktiivsuse, on võimaldanud ELISA kasutamist laiendada erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades.

Monoklonaalsete antikehade ilmumine oli ELISA edasiarendus, mis võimaldas suurendada selle tundlikkust, spetsiifilisust ja tulemuste reprodutseeritavust.

Teoreetiliselt põhineb ELISA kaasaegse immunokeemia ja keemilise ensümoloogia andmetel, antigeeni-antikeha reaktsiooni füüsikalis-keemiliste seaduspärasuste tundmisel, aga ka analüütilise keemia põhiprintsiipidel. ELISA tundlikkuse ja selle kestuse määravad mitmed peamised tegurid: antigeeni-antikeha reaktsiooni kineetilised ja termodünaamilised omadused, reaktiivide suhe, ensüümi aktiivsus ja selle tuvastamismeetodite lahutusvõime. Üldiselt saab antigeen-antikeha reaktsiooni kirjeldada lihtsa skeemi abil:

+[AG]↔[ATAG]

Uurimisobjektide mitmekesisus alates madala molekulmassiga ühenditest kuni viiruste ja bakteriteni, samuti ebatavaliselt suur hulk ülesandeid, mis on seotud ELISA kasutamise erinevate tingimustega, määravad selle meetodi äärmiselt suure hulga variantide väljatöötamise. .

Iga ELISA variant sisaldab 3 kohustuslikku etappi:

1. uuritava ühendi äratundmise staadium sellele spetsiifilise antikeha poolt, mis viib immuunkompleksi moodustumiseni;

2. konjugaadi seose moodustumise staadium immuunkompleksi või vabade sidumissaitidega;

3. ensüümi märgise registreeritud signaaliks muutmise etapp.

ELISA meetodite klassifikatsioon põhineb mitmel lähenemisviisil:

1. ELISA esimeses etapis esinevate reaktiivide tüübi järgi eristatakse konkureerivaid ja mittekonkureerivaid meetodeid.

A) Konkureerivas ELISA-s sisaldab süsteem esimeses etapis nii analüüsitavat ühendit kui ka selle analoogi, mis on märgistatud ensüümiga ja konkureerib sellega spetsiifiliste seondumiskohtade pärast.

B) Mittekonkureerivate meetodite puhul on süsteemis esimeses etapis iseloomulik ainult analüüsitava ühendi ja sellele spetsiifiliste sidumiskeskuste olemasolu.

2. Kõik ELISA meetodid jagunevad homogeenseteks ja heterogeenseteks.

Kui ELISA kõik kolm etappi viiakse läbi lahuses ja põhietappide vahel puuduvad täiendavad moodustunud immuunkomplekside eraldamise etapid reageerimata komponentidest, kuulub meetod homogeensete hulka.

Homogeense ELISA, mida tavaliselt kasutatakse madala molekulmassiga ainete määramiseks, aluseks on ensüümi aktiivsuse pärssimine, kui see kombineeritakse antigeeni või antikehaga. Ensüümi aktiivsus taastub antigeen-antikeha reaktsiooni tulemusena.

Kui antikeha seondub ensüümi märgist sisaldava antigeeniga, inhibeeritakse ensüümi aktiivsust 95% kõrge molekulmassiga substraadi suhtes, mis on tingitud substraadi steerilisest välistamisest ensüümi aktiivsest keskusest. Antigeeni kontsentratsiooni suurenedes seondub rohkem antikehi ja säilib rohkem vabu antigeen-ensüümi konjugaate, mis suudavad hüdrolüüsida suure molekulmassiga substraati. Analüüs tehakse väga kiiresti, ühe määramise jaoks kulub 1 minut. Meetodi tundlikkus on üsna kõrge. Selle abil saate aine määrata pikomoolide tasemel.

Heterogeensete meetodite puhul on tüüpiline analüüs läbi viia kahefaasilises süsteemis, milles osaleb tahke faas - kandja ja immuunkomplekside eri faasides (moodustunud) reageerimata komponentidest eraldamise kohustuslik etapp (pesemine). immuunkompleksid on tahkel faasil ja reageerimata kompleksid on lahuses). Heterogeenseid meetodeid, mille puhul immuunkomplekside moodustumine esimeses etapis toimub tahke faasi alusel, nimetatakse tahkefaasi meetoditeks.

Meetodid klassifitseeritakse homogeenseteks-heterogeenseteks, kui 1. etapp - spetsiifiliste komplekside moodustumine toimub lahuses ja seejärel kasutatakse komponentide eraldamiseks tahket faasi immobiliseeritud reagendiga.

3. Vastavalt uuritava aine määramise põhimõttele:

A) Aine (antigeeni või antikeha) kontsentratsiooni otsene määramine sellega interakteeruvate sidumiskeskuste arvu järgi. Sel juhul on ensüümi märgis saadud spetsiifilises AG-AT kompleksis. Analüüdi kontsentratsioon on otseselt võrdeline registreeritud signaaliga.

B) Aine kontsentratsiooni määramine sidumissaitide koguarvu ja järelejäänud vabade seondumiskohtade erinevuse järgi. Sel juhul suureneb analüüdi kontsentratsioon ja salvestatud signaal väheneb, seega on sel juhul pöördvõrdeline sõltuvus salvestatud signaali suurusest.

Ensüümid.

Ensüümmärgistel on äärmiselt võimas katalüütiline toime, üks ensüümi molekul võib reageerida suure hulga substraadimolekulidega. Seega saab tühistes kogustes esinevat ensüümi tuvastada ja kvantifitseerida saaduste moodustumise ehk reaktsiooni kaudu, mida see katalüüsib. Ensüümide märgistusena kasutamise eeliseks on ka arvukate funktsionaalrühmade (sulfhüdrüül-, karboksüül-, türasiinijäägid jne) olemasolu molekulis, mille kaudu saab ligandimolekule kovalentselt siduda.

ELISA-s kasutatavatel ensümaatilistel markeritel peaksid olema järgmised omadused:

– ensüümi kõrge aktiivsus ja stabiilsus analüüsitingimustes, modifitseerimise ajal ja konjugatsioonis antikehade või muude valkudega;

– tundlike substraatide olemasolu ja ensümaatilise reaktsiooni produktide või substraatide määramise meetodi lihtsus;

– substraadisüsteemide kohandamise võimalus edasiseks tugevdamiseks;

- ensüümi ja selle inhibiitorite puudumine uuritavas bioloogilises vedelikus.

ELISA abil saab kasutada vähemalt 15 erinevat ensüümi. Ülaltoodud nõuete kohaselt on suurimaks kasutuseks mädarõika peroksidaas (HRP), aluseline fosfataas (AP) ja β-D-galaktosidaas (tabel 1). Kõik kolm on stabiilsed ja katalüüsivad väga tundlikke reaktsioone. Lisaks saab nende ensüümide poolt katalüüsitavate reaktsioonide saadusi olenevalt kasutatavast substraadist tuvastada mitte ainult kolorimeetriliste meetoditega, vaid ka fluorestsentsmeetoditega. Teisi ensüüme kasutatakse palju harvemini. See on seletatav nende madalama spetsiifilise aktiivsusega võrreldes HRP ja AP-ga.

Substraadid.

Substraadi valiku määrab eelkõige märgisena kasutatav ensüüm, kuna ensüümi-substraadi reaktsioon on väga spetsiifiline.

Põhinõuded aluspinnale:

– meetodi kõrge tundlikkuse tagamine ensüümi tuvastamisel konjugaadis;

– ensüümi-substraadi reaktsiooni täpselt määratud (näiteks värviliste) produktide moodustumine;

– aluspind peab olema ohutu, odav, ligipääsetav ja mugav kasutada.

Tabel 1.

Ensüüme ja nende substraate kasutatakse ELISA-s enim.

Sagedamini kasutatakse kromogeenseid substraate, mis hävitamisel moodustavad värvilise aine. Paljutõotav on kõrge energiaga substraatide kasutamine - fluorestseeruvad, kemoluminestsents. Selliste substraatide kasutamine võimaldab teoreetiliselt tõsta ELISA tundlikkust kahe suurusjärgu võrra.

Antigeenid ja antikehad.

ELISA-s kasutatavad AG ja AT peaksid olema kõrgelt puhastatud ja väga aktiivsed. Lisaks peaks AG-l olema kõrge antigeensus, optimaalne tihedus ja antigeensete determinantide arv, võõras ja homogeensus. Paljud sünteetilised ja rekombinantsed viiruste ja bakterite antigeenid on end ELISA-s kasutades hästi tõestanud. See suurendas oluliselt meetodi spetsiifilisust ja reprodutseeritavust, minimeerides ristreaktsioone.

ELISA üks olulisemaid reaktiive on antikehad. ELISA tundlikkus sõltub kasutatavate antikehade kontsentratsioonist, aktiivsusest ja spetsiifilisusest. Kasutatavad antikehad võivad olla polü- või monokliinsed, erineva klassi (IgG või IgM) ja alamklassiga (IgGl, IgG2), anti-allotüüpsed või anti-idiotüüpsed. Madala AT afiinsuse korral viib AG-AT kompleksi lagunemine seotud AG eemaldamiseni süsteemist. Meetodi tundlikkust ja spetsiifilisust suurendab monoklonaalsete antikehade kasutamine. Sel juhul on võimalik tuvastada uuritavates proovides AG (AT) madalaid kontsentratsioone.

Konjugaadi moodustumine

Konjugaat on ensüümmärgisega märgistatud antigeen või antikeha. Konjugaadi moodustamine on ELISA üks olulisi etappe.

Konjugaadi moodustamisel valitakse selline optimaalne meetod ensüümi märgistuse sisestamiseks nii, et konjugaadi mõlemad komponendid säilitaksid oma bioloogilise aktiivsuse: ensüüm - võime suhelda substraadiga ja antigeen või antikeha - antigeensus ja antigeeniga seondumine. tegevust vastavalt. Märgistatud kõrgelt puhastatud antigeeni olemasolu võimaldab kasutada konkureerivaid meetodeid. Sel juhul saab lõppfaasis mõõta immobiliseeritud antikehadega seondumata konjugaadi aktiivsust, mis väldib pesemisprotseduuri ja muudab analüüsi mugavamaks. Antigeenid on aga oma füüsikalis-keemiliste omaduste ja struktuuri poolest mitmekesised, mistõttu on võimatu välja töötada universaalseid meetodeid antigeeniga konjugaadi saamiseks. Sel juhul on antigeen-ensüümi konjugaadi saamine eraldi väljakutse. Märgistatud antikehade valmistamine ELISA jaoks on metoodiliselt paremini kättesaadav.

Ensüümi konjugeerimine immunokeemiliselt aktiivsete valkudega toimub erinevate meetoditega: keemiline ristsidumine, ensüümi molekuli kovalentne sidumine AG või AT-ga ja ühendite moodustumine mittekovalentsete sidemete kaudu, näiteks siis, kui ensüüm ja AG või AT viiakse läbi immunoloogiliselt antigeeni-antikeha interaktsiooni kaudu.

Kõige laialdasemalt kasutatavad kovalentsed meetodid konjugaatide valmistamiseks. Sidumisreaktsiooni valiku määrab nendes valgusmolekulides saadaolevate funktsionaalrühmade tüüp. Glutaraldehüüdi, naatriumperjodaati jne kasutatakse reagentidena, mida kasutatakse ensüümi viimiseks antigeeni- ja antikehamolekulidesse.

Konjugaatide saamiseks glutaaraldehüüdi abil on olemas ühe- ja kaheetapilised meetodid. Võib moodustada erineva suurusega konjugaate, millel on vähenenud ensümaatiline aktiivsus (15–60% vabast ensüümist). Saadud suuremõõtmeline konjugaat võib steeriliselt takistada uuritava aine määramist. Suhteliselt madala molekulmassiga konjugaadid koosnevad Fab fragmendist ja ühest ensüümi molekulist.

Kaheetapilise sünteesi tulemusena, mis seisneb esmalt ristsiduva ainega modifitseeritud ensüümi etapiviisilises valmistamises, selle eraldamises ja seejärel selle järgnevas interaktsioonis antigeeniga (antikehaga), moodustuvad ensüümi molekulid. moodustuvad homogeensed koostised, mis sisaldavad 1-2 ensüümi molekuli immunoglobuliini molekuli kohta ning säilitavad kõrge ensümaatilise ja immunoloogilise aktiivsuse. Selliste konjugaatide hulk on aga väike (mädarõika peroksidaasi puhul 5–10%).

Suurima praktilise rakenduse on leidnud immunoperoksidaasi konjugaatide saamise meetod, mis põhineb ensüümi süsivesikute komponendi oksüdeerimisel naatriumperjodaadiga (peroksidaasi seondumine konjugaadiga ulatub 70-90% ensüümi esialgsest kogusest).

Usaldusväärsel konjugaadil peavad olema järgmised omadused:

Kõrge antikehade tiiger ja kõrge afiinsus antigeeni suhtes, nii et seda saab kasutada suures lahjenduses ja seega vähendada mittespetsiifilist seondumist;

Piisav spetsiifilisus tööaretuses;

Monomeersete vormide ülekaal polümeersete üle, sest polümeersed vormid kipuvad plastiga mittespetsiifiliselt kleepuma, mille tulemuseks on reaktsiooni kõrge tausttase;

Optimaalne molaarsuhe ensüümi ja antikehade vahel (optimaalne suhe on umbes 1:1);

Konjugaadi piisav ensümaatiline aktiivsus. Selle omaduse määravad peamiselt konjugatsiooni tingimused ning ensüümi ja antikeha molekulide suhe konjugaadis.

tahke faas

ELISA jaoks võib tahke faasina kasutada erinevaid materjale: polüstüreeni, polüvinüülkloriidi, polüpropüleeni ja muid aineid. Tahkeks faasiks võivad olla katseklaasi seinad, 96 süvendiga ja muud plaadid, pallid, helmed, aga ka nitrotselluloos ja muud membraanid, mis aktiivselt valke absorbeerivad.

Antigeeni või antikehade immobiliseerimine tahkel faasil on võimalik kolmel viisil:

– passiivne adsorptsioon, mis põhineb tugevatel hüdrofoobsetel interaktsioonidel valkude ja sünteetilise pinna vahel;

– kovalentne kinnitumine tahke faasi külge;

– immunokeemiline jne (mittekovalentne ja mitteadsorptsioonkinnitus).

Valkude passiivset adsorptsiooni kasutatakse laialdaselt ELISA läbiviimisel tiitrimisplaatidel, nitrotselluloosmembraanidel. Passiivne adsorptsioon järgib küllastuse põhimõtet ja korreleerub adsorbeeritud aine molekulmassiga. Erinevat tüüpi membraanide (nitrotselluloos, nailon jne) adsorptsioonipind on 100-1000 korda kõrgem kui plastil.

Polüsahhariididel ja kõrgelt glükosüülitud valkudel on sageli madal afiinsus polüstüreeni suhtes. Nende immobiliseerimiseks on vaja muid meetodeid, näiteks kovalentset kinnitamist glutaaraldehüüdiga. Kovalentne kinnitus on efektiivne, kui tahke faasina kasutatakse hüdrofiilseid helmeid (agaroos) ja polüstüreenhelmeid.

Immunokeemilised meetodid põhinevad eelnevalt adsorbeeritud "lõksu" antikehade kasutamisel antigeeni või antikehade immobiliseerimiseks. Immunokeemiliselt immobiliseeritud antigeen on 10 korda aktiivsem kui passiivselt adsorbeeritud antigeen. Võib kasutada lektiine või bakterite immunoglobuliini siduvaid valke, mis on kergesti adsorbeeruvad plastile või muudele hüdrofoobsetele pindadele, nagu konkanavaliin A (Con A) või stafülokoki valk A. Con A on võimeline immobiliseerima HIV viiruse gp 120 valku.

Tahke faasi pinnal olevad vabad kohad, mis ei ole adsorbeeritud ainega seondunud, võivad testi ajal fikseerida teisi molekule, sealhulgas konjugaate, mis viib taustsignaali suurenemiseni. Et vältida mittespetsiifilist seondumist pärast immobiliseerimist alusmaterjali tahkele faasile, töödeldakse ainetega, mis on testi jaoks neutraalsed. Kõige populaarsemad blokeerivad ained on veise seerumi albumiin (BSA), kaseiin jne. Blokeeriva aine valik ja selle etapi tingimused sõltuvad tahke faasi tüübist ja süsteemi tundlikkusest.

Praegu kasutatakse tohutul hulgal erinevaid ELISA sorte ja modifikatsioone. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) erinevad variandid on laialt levinud.

Tahkefaasiline ELISA pakuti välja 1971. aastal. Tahkefaasilise ELISA põhiprintsiibid, olenemata modifikatsioonist, on järgmised:

1. Reaktsiooni 1. etapis adsorbeeritakse antigeenid või antikehad tahkele faasile. Sel juhul on tahke faasiga mitteseotud reagendid kergesti eemaldatavad pesemisega.

2. Uuritavat proovi inkubeeritakse sensibiliseeritud süvendites. Positiivse kontrolli süvendid sisaldavad standardseid reaktiive. Sel juhul moodustuvad immuunkompleksid tahke faasi pinnal. Seondumata komponendid eemaldatakse pesemise teel.

3. Antikeha-ensüümi või antigeen-ensüümi konjugaadi lisamisel ja sidumisel immobiliseeritud immuunkompleksiga jääb ensüümi aktiivne sait kättesaadavaks järgnevaks interaktsiooniks substraadiga. Substraadi inkubeerimine süvendites immobiliseeritud konjugaadiga viib värvireaktsiooni tekkeni. Selle reaktsiooni saab peatada soovitud etapis, värvumise raskust saab hinnata visuaalselt või optilise tiheduse järgi.

Tahkefaasianalüüsi mis tahes variandi oluline etapp on seondumata reaktiivide mahapesemise protseduur. Oluline on mitte ainult loputada tahkele faasile kinnitatud komponente, vaid eemaldada reaktiivid kogu kihi sügavusest. Need on analüüsi kõige aeganõudvamad ja töömahukamad etapid. Proove saab pesta automaatselt spetsiaalse seadmega – pesumasinaga või käsitsi, mitme kanaliga pipetiga. ELISA läbiviimiseks vajate:

- kasutatud polüstüreentabletti või muid tahke faasi valikuid;

- pesulahus;

– konjugaat (ensümaatiliselt märgistatud antigeenid või antikehad);

– kasutatud substraatide segu;

- seiskamislahus (Stop reagent – ​​lahus reaktsiooni peatamiseks);

- positiivseks ja/või negatiivseks kontrolliks kasutatud proovid;

– standardantigeen (kalibreerimiskõvera koostamiseks);

– ühe- ja mitmekanalilised pipetid;

– pesumasin (seib);

– optiline seade uuritava lahuse optilise tiheduse määramiseks (ELISA lugeja, kõiki süvendeid järjestikuliselt fotomeetriv lugeja);

- 5-100 µl uuritud bioloogilist materjali.

Otsene ELISA

1. Antigeenid või antikehad (testmaterjal) adsorbeeritakse paneelide süvenditesse. Eespool märgiti, et antigeenide võime adsorbeeruda erinevat tüüpi plastidel on oluliselt erinev, olenevalt sellest, millisesse aineklassi (valgud, süsivesikud või lipoproteiinid) nad kuuluvad. Tihti on otseses ELISA-s tahkele faasile immobiliseeritud antigeeniks rakud ja muud osakeste antigeenid.

Kontroll. Kontrollina kasutatakse süvendeid adsorbeeritud positiivse kontrollprooviga, mis sisaldab tingimata soovitud antigeeni, ja negatiivse kontrollprooviga, mis ilmselt ei sisalda testitavat antigeeni. Puhastatud standardantigeeni juuresolekul viiakse reaktsioon läbi mitmes lahjenduses, nii et saab koostada kalibreerimiskõvera.

2. „Blokeerige tahkele faasile jäänud vabad sidumissaidid kaseiini BSA-ga jne (et vältida konjugaadi mittespetsiifilist sorptsiooni tahkel faasil).

3. Süvenditesse lisatakse ensüümiga märgistatud antikehad või antigeenid (konjugaat) ja inkubeeritakse. Konjugaadi seondumine tahke faasiga toimub ainult siis, kui süsteemi mõlemad komponendid on komplementaarsed. Pärast konjugaadiga inkubeerimist pestakse süvendid, eemaldades nii konjugaadi sidumata osa.

4. Seejärel lisatakse süvenditesse kasutatud ensüümi spetsiifiline substraat ja inkubeeritakse. Kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumise tase, peatatakse ensüümi reaktsioon.

5. Reaktsiooni arvestamine. Esiteks võetakse reaktsiooni tulemusi visuaalselt arvesse. Tulemuste täpsemaks kajastamiseks hinnatakse värvimise intensiivsust ELISA lugejaga koos sobiva valgusfiltriga. Vastavalt analüüsi tulemustele joonistatakse graafik optilise tiheduse sõltuvusest kontsentratsioonist (joonis 2).

Joonis 2. Otsene ELISA.

a) antigeeni tuvastamiseks; b) antikehade tuvastamiseks.

Seda ELISA varianti kasutatakse tavaliselt spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks. Standardantigeen adsorbeeritakse paneelide süvenditesse ja inkubeeritakse patsiendilt saadud seerumi või muu bioloogilise materjali proovidega (tserebrospinaalvedelik, sülg jne). Tahkel faasil oleva antigeeniga seotud spetsiifilised antikehad tuvastatakse antiglobuliini konjugaati kasutades. Sõltuvalt analüüsi eesmärgist kasutatakse erinevaid antiglobuliinireaktiive, mis tuvastavad kõigi isotüüpide või immunoglobuliinide üksikute klasside ja alamklasside spetsiifilisi antikehi. Meetodi peamine eelis on konjugaadi universaalsus. Sama konjugaati saab kasutada inimese antikehade tuvastamiseks paljude erinevate antigeenide suhtes mis tahes proovis. Reaktsioon on metoodiliselt lihtne.

Kaudse ELISA peamised etapid antikehade tuvastamiseks:

1. Antigeen adsorbeeritakse tahkele faasile, seejärel pestakse seondumata komponentidelt maha.

2. Blokeeri tasuta sidumissaidid. Pestud.

3. Uuritav materjal lisatakse süvenditesse, inkubeeritakse ja seejärel pestakse. Paralleelselt asetatakse positiivsete ja negatiivsete kontrollidega proovid.

4. Lisage antiglobuliini konjugaat töölahjenduses, inkubeerige, peske seondumata komponendid maha.

5. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Kui positiivsetes kontrollisüvendites on saavutatud optimaalne värvumise tase, peatatakse reaktsioon stopplahuse lisamisega.

6. Mõõtke reaktsioonisaaduse kogus ELISA lugejal (joonis 3).

Optimaalsete analüüsitingimuste korral on meetod väga spetsiifiline ja tundlik. See võimaldab tuvastada uuritud patsientide seerumis nanogrammides antikehi. Rahuldavate tulemuste saamiseks on vajalik reaktiivide ja metoodikate standardimine. Seda ELISA varianti saab kasutada ka monoklonaalsete antikehade testimiseks.

Selle ELISA variandiga tuvastatud antigeenidel peab olema mitu antikeha siduvat epitoopi või korduvad, ruumiliselt eraldatud epitoobid, millel on sama spetsiifilisus.

Selle ELISA variandi läbiviimisel inkubeeritakse uuritava prooviga tahkele faasile adsorbeeritud väga spetsiifilisi polü- või monoklonaalseid antikehi. Pärast pesemisprotseduuri lisatakse süvenditesse ensüümiga märgistatud antikehad (konjugaat) samale antigeenile ja seejärel viiakse läbi kõik muud reaktsiooni etapid. Spetsiifilise kompleksi moodustumise efektiivsus analüüsi igas etapis sõltub antigeeni-antikeha reaktsiooni seondumiskonstandist.

Analüüsi peamised etapid:

1. Monoklonaalsed antikehad või afiinsuspuhastatud polüklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.

2. Uuritav proov viiakse paneelide süvenditesse, positiivne kontrollproov ja negatiivne kontrollproov asetatakse paralleelselt erinevatesse lahjendustesse. Inkubeeritakse ja pestakse.

3. Süvenditesse sisestatakse ensüümiga märgistatud monoklonaalsed või polüklonaalsed antikehad (konjugaat). Pesemine toimub pärast inkubeerimist.

4. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Reaktsioon peatatakse, kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumine.

5. Tulemuste arvestus ELISA lugejal.

Meetodi peamine eelis on selle kõrge tundlikkus, mis ületab teiste ELISA skeemide võimalused (joon. 4).

Joonis 3. Kaudne ELISA antikehade tuvastamiseks.

See analüüsivõimalus põhineb märgistatud (konjugaat) ja märgistamata (test) antikehade konkureerimisel tahkel faasil adsorbeeritud antigeeniga seondumisel. Tahke faasi külge kinnitatud ensüümi hulk väheneb proportsionaalselt vabade antikehade sisaldusega segus. Antigeeni määramiseks kasutatakse sama võimalust, kuid sel juhul konkureerib soovitud antigeen märgistatud standardantigeeniga seondumisel tahke faasi pinnale immobiliseeritud antikehadega.

Võistlusmeetod nõuab minimaalset arvu toiminguid, vähest reaktiivide tarbimist ja seda on lihtne automatiseerida. Antikehade tuvastamiseks konkureeriva ELISA läbiviimisel on parem kasutada märgistatud monokliinseid antikehi, seejärel konkureerib konjugaat uuritava prooviga tahkele faasile adsorbeeritud antigeeni ühe epitoobi pärast. Seda ELISA varianti kasutatakse erinevate ühendite, näiteks inimese immunoglobuliinide, vähi-embrüonaalse antigeeni, insuliini jne määramiseks. See võimaldab tuvastada antikehi nakkusetekitajate diagnostiliselt oluliste epitoopide vastu.

Antigeeni tuvastamise analüüsi peamised etapid (joonis 5):

1. Detekteeritava antigeeni suhtes spetsiifilised monoklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.

2. Lisage paneelide süvenditesse ensüümiga märgistatud antigeen ja uuritav proov teadaolevas kontsentratsioonis. Viige läbi inkubeerimine ja pesemine. Paralleelselt asetatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollid külgnevatesse süvenditesse. Kalibreerimise loomiseks, kasutades standardset märgistamata antigeeni erinevates lahjendustes.

3. Lisage substraat, inkubeerige, peatage reaktsioon, kui positiivse kontrolli süvendites tekib optimaalne värvumine.

4. ELISA lugeja reaktsiooni arvestamine.

Sel juhul on antigeeni kogus uuritavas proovis pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

Selles ELISA variandis seostub uuritavas proovis olev antigeen ensüümiga märgistatud monoklonaalsete antikehadega ja inhibeerib nende interaktsiooni tahkele faasile immobiliseeritud standardantigeeniga. Konjugaadile spetsiifilise antigeeni isegi mikrokoguste olemasolu proovis pärsib märgistatud antikehade seondumist immobiliseeritud antigeeniga. Inhibeerimise aste on otseselt võrdeline antigeeni sisaldusega lahuses. Kvantitatiivseks analüüsiks koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades standardantigeeni seerialahjendusi. Antigeeni tuvastamise inhibeeriva ELISA peamised etapid (joon. 6).

1. Adsorbeerige standardantigeen paneelide süvenditesse. Valige tiitrimise teel märgistatud antikehade töölahjendus.

Joonis 4. "Sandwich" - ELISA variant.

2. Konjugaati eelinkubeeritakse töölahjenduses uuritava proovi, standardantigeeni ja positiivse kontrollproovi lahjendustega.

3. Segu kantakse paneelide süvenditesse. 100% sidumise kontrollimiseks lisatakse mitmesse süvendisse ainult märgistatud antikehi, ilma inhibeeriva antigeenita. Paneele inkubeeritakse ja seejärel pestakse.

4. Lisa substraat.

5. Salvestage tulemused.

Määratava antigeeni kontsentratsioon uuritavas proovis on pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

ELISA abil saab määrata mitte ainult lahustuva antigeeni või antikeha, vaid ka erinevaid valke tootvaid rakke.

1983. aastal kohandati ELISA tehnoloogiat lümfoidrakkude tuvastamiseks, mis sekreteerivad antikehi või antigeene (nt tsütokiine) in vitro. Meetodit nimetatakse ELISPOTiks (enzymatic immunoassay või spot method). Meetodi põhiprintsiip:

1. Polüstüreeni süvendi pinnale (kasutades 24 süvendiga rakukultuuri paneele) adsorbeeritakse antigeenid või antikehad, mis toimivad „püüdvate“ reagentidena.

2. Lisatakse uuritud lümfoidrakud, kultiveeritakse mitu tundi 37°C juures, andes neile võimaluse hõivata teatud koht ja täita sekretoorset funktsiooni. Selliste rakkude poolt sekreteeritud antikehad või antigeenid püütakse kinni tahkele faasile adsorbeeritud reaktiividega.

3. Rakud eemaldatakse, kasutades rakke lüüsiva pesuvahendiga pesulahust.

4. Sekretoorsete saaduste kogunemiskohad näidatakse ensüümiga seotud antikehade lisamisega (antiglobuliini reaktiiv).

5. Lisatakse substraadi-agaroosi segu (kasutatud substraadid peaksid agaroosis lahustuma ja moodustama lahustumatud reaktsiooniproduktid), tahke faasi pinnale tekivad pruunid või sinised laigud (olenevalt kasutatavatest ensüümidest ja substraatidest), paljastades piirkonnad, kus rakud asuvad. asusid.

Saadud laigud loendatakse mikroskoobi all, see on sekreteerivate rakkude arv.

Tahke faasina saab kasutada nitrotselluloosmembraani Sel juhul on mitmeid eeliseid: tänu NCM suurele adsorptsioonivõimele on vaja oluliselt väiksemat kogust “püüdva” reagendina kasutatavat antigeeni, lisaks agaroosi ei ole vaja substraadile lisada.

Määrates samaaegselt sekreteerivate rakkude arvu ja sekreteeritava antigeeni või antikeha koguhulga süvendis, mis on võimalik erineva substraadi kasutamisel, on võimalik määrata sekreteeritava aine kogust ühe raku järgi.

See meetod on leidnud laialdast rakendust adsorbeeritud antikehade poolt püütud antigeeni sekreteerivate rakkude arvu hindamiseks, seda kasutatakse tsütokiine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on üksikute ELISA variantide tundlikkus väga kõrge ja võimaldab teoreetiliselt tuvastada üksikuid antigeenimolekule, kuid praktikas piiravad tundlikkust mitmed tegurid: ensüümi aktiivsus, signaali intensiivsus ja signaali arvestusmeetodid. . Signaalivõimendussüsteemid võimaldavad tõsta erinevate ELISA variantide tundlikkust. Mõelge mõnele neist süsteemidest:

Põhineb avidiini ja biotiini koostoimel.

Biotiini koensüümi molekulid (m.m. 244 Da) konjugeeritakse antikehadega, kasutades biotinüül-N-hüdroksüsuktsimiidi. Väikest biotiini molekuli on lihtsam kinnitada immunoglobuliini või muu valgu külge, ilma et see rikuks selle immuun- või ensümaatilisi omadusi. Ensüüm on sel juhul seotud munavalge glükoproteiini avidiiniga. Avidiini seondumisafiinsus biotiini suhtes on väga kõrge (kompleksi dissotsiatsioonikonstant on 10-15 mol), avidiini-ensüümi konjugaat on kindlalt fikseeritud antigeen-antikeha-biotiini kompleksil. Pärast sobiva substraadi lisamist määratakse reaktsiooniprodukt spektrofotomeetriliselt või luminestsentsi intensiivsuse järgi.

Üks avidiini molekul koosneb neljast identsest subühikust, on võimeline interakteeruma nelja biotiini molekuliga, mis võimaldab seda kasutada kahe biotiini sisaldava ühendi ühendava molekulina. Sel juhul biotinüleeritakse ka ensüüm ja avidiin toimib sillana, ühendades kaks biotiinijääke sisaldavat molekuli. Saadud antigeen-antikeha-biotiini kompleksile lisatakse vaba avidiin, millele järgneb biotinüülitud ensüüm. Salvestage reaktsioon.

Avidiini valku saab mittespetsiifiliselt sorbeerida teistele molekulidele; seetõttu kasutatakse üha enam teist biotiini siduvat valku, streptavidiini, mida leidub bakteris Streptomyces avidinii. Streptavidiin moodustab ka biotiiniga tugeva kompleksi ja koosneb neljast identsest subühikust.

Avidiini-biotiini kompleksi kasutamine võimaldab oluliselt tõsta ELISA tundlikkust, kuna konjugaadi sünteesi käigus võib ühe AT molekuliga seonduda kümneid biotiini molekule. Konjugaatide (antikehad ja ensüümid biotiiniga) saamine on üsna lihtne ning sellega kaasnevad minimaalsed muutused nende immunoloogilises ja ensümaatilises aktiivsuses. Ensüümide konjugaate biotiiniga saab kasutada universaalsete reagentidena.

Kemoluminestsentsreaktsioonide kasutamine.

Kemiluminestsentsreaktsioone saab kasutada signaali saamiseks ELISA-s, suurendades samal ajal meetodi tundlikkust ja vähendades analüüsi aega. Mädarõika peroksüdaasi kasutatakse ELISA-s laialdaselt märgisena, selle tuvastamiseks saab kasutada ka erinevaid kemoluminestsentsreaktsioone. Kemiluminestsentsreaktsioonid põhinevad luminooli võimel vesinikperoksiidiga oksüdeerimisel hõõguda. Otseses analüüsis tekitab ensümaatiline reaktsioon vesinikperoksiidi ja oksüdeerib luminooli; seda reaktsiooni katalüüsib mädarõika peroksidaas. Signaali võimendamiseks kasutatakse erinevaid ühendeid, näiteks lutsiferiini, fenoole, sel juhul suurendatakse luminestsentsi intensiivsust 10-100 korda, mõnel juhul 500 korda (võimendatud kemoluminestsentsanalüüs). Luminestsentssignaal on väga stabiilne, selle tase saavutab maksimumi 30 sekundiga (võrdluseks: värvireaktsioon OPD-ga kui indikaatoriga areneb täielikult välja alles 30 minutiga).

Kaudsel analüüsil luminooli või selle derivaatidega antikeha märgistatakse. Sellist vabas olekus olevat märgist on võimalik valguse vabanemisega vesinikperoksiidiga oksüdeerida. Kui see on moodustanud kompleksi, kaotab see oksüdeerumisvõime.

Põhineb kaskaadsüsteemidel.

ELISA tundlikkuse suurendamiseks võib kasutada ensüümikaskaadsüsteeme. Sel juhul annab esimene antikehaga seotud ensüüm teise ensüümsüsteemi jaoks redutseeritava substraadi. Teine ensüümsüsteem võib olla substraattsükliline või redoksütsükliline. Sel juhul võivad fosfoglükoisomeraas, aldolaas, aluseline fosfataas olla ensüümi märgisena. Reaktsiooni lõppsaadus määratakse visuaalselt või spektrofotomeetriliselt.

ELISA võimendussüsteemid saavutavad kõrge tundlikkuse. Selliseid ELISA süsteeme kasutatakse hormoonide taseme määramiseks (kilpnääret stimuleeriv, progesteroon jne).

ELISA on leidnud laialdast rakendust erinevates meditsiini ja bioloogia valdkondades tänu meetodi suhtelisele lihtsusele ja kõrgele tundlikkusele. ELISA-t on edukalt kasutatud:

Nakkushaiguste massdiagnostika (erinevate spetsiifiliste antigeenide või nendevastaste antikehade tuvastamine);

Hormoonide ja ravimite taseme tuvastamine ja määramine bioloogilistes proovides;

Spetsiifilise antigeeni vastaste antikehade isotüübi määramine (IgG, IgM ja teised);

Immuunkomplekside tuvastamine;

Kasvaja markerite tuvastamine;

Vere seerumi valkude (ferritiin, fibronektiin jne) määramine;

Üldine IgE ja spetsiifiliste IgE antikehade määramine;

Müoklonaalsete antikehade sõeluuring;

Tsütokiinide määratlused bioloogilistes vedelikes.

Meetodi tundlikkus

ELISA on asendanud varem kliinilises praktikas laialdaselt kasutatud aglutinatsiooni, sadestamise ja RIA meetodid. Võrreldes ülaltoodud meetoditega on ELISA vähem töömahukas ja vähem aeganõudev ning mugav suure hulga sama tüüpi analüüside tegemiseks.

ELISA ühendab immunokeemilise analüüsi ainulaadse spetsiifilisuse ensüümi märgistamise kõrge tundlikkusega. Meetodi tundlikkus (tundlikkuse all tähendab minimaalset tuvastatavat antikehade või antigeeni kogust) määratakse järgmiste teguritega: antikehade afiinsus, eelistatav on monoklonaalsete antikehade kasutamine; ensüümi spetsiifiline aktiivsus; signaali intensiivsus; signaali tundlikkus. Erinevad ELISA variandid erinevad oma tundlikkuse poolest. Tahkefaasi ELISA eraldi variandid võimaldavad tuvastada proovis üksikuid molekule. ELISA keskmine tundlikkus on 10-9 - 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Immunoloogia. Moskva ülikooli kirjastus, 1998

Kishkun A.A. Immunoloogilised uuringud ja nakkushaiguste diagnoosimise meetodid kliinilises praktikas. Meditsiiniuudiste agentuur, 2009

Kondratieva I.A. Immunoloogia töötuba. Õpik gümnaasiumile. Akadeemia, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Immunoloogilised uurimismeetodid. Rahu, 1988

Roit A, Brostoff D, Meil ​​​​D. Immunoloogia. Rahu, 2000

Sokolov E.I. Kliiniline immunoloogia. Meditsiin, 1998

Frimel G. Immunoloogilised meetodid. Meditsiin, 1987

Khaitov R. M. Immunoloogia. Meditsiin, 2000

Shigina Yu.V. Immunoloogia: õpik. Kirjastus RIOR, 2007

Yarilin A.A. Immunoloogia alused. Meditsiin, 1999