Mida tähendab ifa hiv 1 2. Kaasaegsed HIV-nakkuse diagnoosimise meetodid. Video: kaasaegne ensüümi immuunanalüüs

Tänapäeval on maailmas kõige levinum AIDS – retroviiruste alamperekonna viirus, neid nimetatakse ka lentiviirusteks ehk "aeglasteks". Tõepoolest, inimkehas hakkavad nad aktiivsust näitama suhteliselt pika aja pärast, umbes 10 aastat hiljem.

Esineb esimest ja teist tüüpi immuunpuudulikkus. Kuid võime julgelt rääkida esimest tüüpi viiruse laienemisest. Vereringesse sattudes ja immuunsuse eest vastutava rakuga liitudes hakkab viirus kiiresti paljunema. Kuigi selle äratundmise eest vastutav CD4 molekul tuvastab salakavala vaenlase, suudab see nakatada kogu keha. Seetõttu, mida varem see diagnoositakse, seda suurem on tõenäosus, et patsient saab õigeaegset ravi ja elab kauem.

Kui inimesel on põhjust end AIDSi suhtes testida, tuleks seda teha kohe. Kõige sagedamini on sellise diagnoosi aluseks immuunpuudulikkuse vastaste antikehade määramine veres - valgud, mis tekivad reaktsioonina viiruse esinemisele ja hakkavad moodustuma 1,5–6 kuu jooksul alates viiruse esinemisest. võimalik infektsioon. Seetõttu on pärast seda perioodi otstarbekam läbida diagnostika.

Antikehade kogus määratakse testiga, mida nimetatakse ensüümi immuunanalüüsiks (ELISA). Seda meetodit usaldatakse, see on suhteliselt täpne ja väga tundlik, need arvud on üle 99,5%. Farmaatsiaturg pakub mitmeid diagnostilisi testide komplekte ELISA jaoks: Combibest HIV, Anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV, CombiBest anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV 1 2 d 0172. Need testimissüsteemid kuuluvad kolmandasse. põlvkond. Nende reaktiivide puuduseks on see, et nad ei avasta alati haigust varases staadiumis. Inimene on juba viirusekandja, ta on potentsiaalselt ohtlik partneritele, kuid veres pole veel antikehi.

Peamiselt on komplektid varustatud mitmete testidega 12*8 ehk 192 HIV-vastase testi jaoks. Ei ole soovitatav neid iseseisvalt kasutada. Ravimite kirjelduses on kirjas, et nende peamine eesmärk on tuvastada mõlemat tüüpi AIDSi vastaste antikehade hulk. Ja ka kõigi AIDS-i klasside antikehade määramiseks. Kui antikehad puuduvad, siis haigust ei diagnoosita.

Neljanda põlvkonna testid "näevad" lisaks antikehadele ja AIDS-i antigeenidele, suudavad nad tuvastada infektsiooni varem kui kolmanda põlvkonna vahendid. Võrdluseks: HIV-antigeen on veres alates 5. päevast ja esimesed antikehad tekivad mitte varem kui kuu aega hiljem. CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (komplekt 1) ja CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (komplekt 2) kuuluvad 4. põlvkonna testidesse. Nende reaktiivide komplekti kasutades tuvastatakse inimese seerumi või plasma uurimisel 1., 2. ja p24 antigeeni vastased antikehad. Paljud riigid kasutavad täpselt 4 põlvkonna ELISA testimist, mida nimetatakse ka antigeeniks/antikehaks, lühendatult AGAT.

Testimine toimub anonüümselt.

Patendi RU 2283497 omanikud:

Leiutis käsitleb biotehnoloogia ja meditsiini valdkonda. Ensüüm-immuunanalüüsi testimissüsteem inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) esimest ja teist tüüpi, esimest tüüpi O rühma antikehade spektri tuvastamiseks ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse esimese tüübi p24 antigeeni tuvastamiseks sisaldab immunosorbendipõhist süsteemi inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel, mis esindavad gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), HIV antigeeni 1 p24 vastaseid antikehi , ja tuvastamisreagendid, samas kui ülaltoodud HIV-antigeenid ja HIV-antikehad sorbeeritakse plaatide erinevatesse süvenditesse ensüümi immuunanalüüsi jaoks ning sorptsiooniks kasutatakse 96-süvendiga kokkupandavaid või mittekokkupandavaid polüstüreenplaate. Leiutis tagab tulemuste hindamise tundlikkuse suurendamise, lihtsustamise ja subjektiivsuse välistamise. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 ill.

Leiutis käsitleb biotehnoloogia ja meditsiini valdkonda. Kasutamine: inimese immuunpuudulikkuse viiruse 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeeni valkude kõigi klasside spetsiifiliste antikehade diferentseeritud tuvastamine.

Põhiolemus: ensüümi immuunanalüüsi testimissüsteemi saamine kõigi klasside antikehade spektri tuvastamiseks üksikute valkude ja HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide suhtes vereseerumis (plasmas), immunoglobuliinides ja veretoodetes, et tuvastada. HIV 1 ja 2 antikehade spekter, HIV 1 rühm O, HIV 1 p24 antigeeni tuvastamine ning HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide antikehade positiivsete või ebamääraste sõeluuringute tulemuste kinnitamine.

LEIUTISE KIRJELDUS

HIV-nakkuse laboratoorne diagnostika põhineb kolmel valdkonnal: a) HIV ja selle komponentide indikatsioon; b) HIV-vastaste antikehade tuvastamine; c) immuunsüsteemi muutuste määramine. Olemasolevate laboridiagnostika meetodite hulgas on kõige levinumad seroloogilised meetodid - viiruse antigeenide antikehade tuvastamine.

HIV-nakkuse antikehade tuvastamiseks kasutatakse peamiselt ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) ja immunoblotanalüüsi (IB). ELISA põhineb viiruse antigeenide immobiliseerimisel plaatidel, mis seovad patsiendi antikehi ning antigeeni-antikeha kompleksi tuvastamiseks kasutatakse mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud hiire monoklonaalseid antikehi inimese immunoglobuliinide G ja M vastu. Meetod on üsna spetsiifiline ja tundlik ning võimaldab tuvastada viirusspetsiifilisi antikehi 95% patsientidest. Ülejäänud 5% juhtudest esinevad infektsiooni varases staadiumis, kui vereseerumis on veel vähe antikehi, või haiguse lõppfaasis, kui organism ei suuda enam antikehi sünteesida järsu vereseerumis ammendumise tõttu. immuunsüsteem. Võimalikud on ka valepositiivsed ELISA tulemused, peamiselt autoimmuun- ja onkoloogiliste haigustega patsientidel, samuti Eshptein-Barri viiruse põhjustatud infektsioonide korral. Sel juhul on antikehade ristreaktsioon reumatoidfaktori, Epstein-Barri viiruse või antigeensete determinantide suhtes, mis on sarnased peamise histo-sobivuskompleksi klassi 1 ja 2 (HLA-4 ja DQW3) kuuluvate valkudega ja millel on võime seonduda HIV-antigeenidega. esineb. Rasedatel ja eakatel on sageli näha valepositiivseid tulemusi. Ebausaldusväärsete tulemuste põhjuseks võivad olla ka hemolüüs, lipeemia, seerumite bakteriaalne saastumine.

Sellega seoses on välja pakutud mitmeid meetodeid ja neid kasutatakse antikehade tuvastamise tulemuste spetsiifilisuse testimiseks. Nendest meetoditest on kõige sagedamini kasutatav reaktsioon "immuunblot" modifikatsioonis "Western Blot". Meetodi olemus on järgmine: esimeses etapis eraldatakse HIV-valgud molekulmassi järgi polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil. Sellele järgneb elektroforeetiline ülekanne polüakrüülamiidgeelilt nitrotselluloosmembraani pinnale. Sel viisil ülekantud antigeenid tuvastatakse membraanil kaudse analüüsi abil: membraani inkubeeritakse uuritava materjaliga; sisalduvad antikehad seonduvad HIV-antigeenidega, mis on kantud nitrotselluloosmembraanile, seejärel inkubeeritakse membraaniribasid konjugaadiga; kui moodustub antigeen-antikeha kompleks, kinnitub konjugaat sellele, pärast konjugaadist pesemist ja substraadiga inkubeerimist toimub nende nitrotselluloosi lõikude värvumine, kus toimub antigeen-antikeha-konjugaadi kompleksi moodustumine. Joonisel on näiteid positiivsete, nõrgalt positiivsete ja negatiivsete immunobloti tulemuste kohta.

HIV-1 ja HIV-2-ga nakatunud inimeste seerumis leitakse antikehad järgmiste valkude (p) ja glükoproteiinide (gp) vastu: Tabel A.

Tabelis B on toodud WHO ja Venemaa AIDSi ennetamise ja tõrje keskuse soovitatud immuunblotanalüüsi tulemuste hindamise kriteeriumid.

WHO kriteeriumide alusel loetakse seerumid positiivseks, kui IB-meetodil tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV-1 ümbrise valgu vastu. Kui toimub reaktsioon ainult ühe ümbrisvalguga (gp160, gp120, gp41), kombinatsioonis reaktsiooniga teiste valkudega või ilma selleta, peetakse tulemust kaheldavaks. Venemaa Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi AIDSi ennetamise ja tõrje föderaalse teadus- ja metoodikakeskuse andmetel on seerumeid võimalik positiivseks tõlgendada isegi ainult ühe kattevalgu vastaste antikehade olemasolul.

Antigeeni p24 vastaste antikehade tuvastamine võib näidata serokonversiooni alguse perioodi, kuna selle valgu vastased antikehad ilmuvad esimesena. Positiivsed reaktsioonid gag- ja pol-valkudega ilma reaktsioonita env-valkudega võivad kajastada varase serokonversiooni staadiumit, samuti viidata HIV-2 nakkuse või mittespetsiifilise reaktsiooni olemasolule.

Immunoblotanalüüsi kasutamisel HIV diagnoosimise ekspertmeetodina on mitmeid olulisi puudusi:

1. HIV 1 antigeeni p24 tuvastamise kinnitamise võimatus HIV-antigeeni ja antikehi samaaegselt määravate testide kasutamise korral, mistõttu on ebasobiv (mõttetu) sõeltestide kasutamine antigeeni ja antikehade samaaegseks tuvastamiseks HIV-ile (Vene Föderatsiooni Tervishoiuministeeriumi korraldus nr 292 30.07.2001: "vereülekandejaamades doonorite uurimiseks on vaja kasutada testisüsteeme, mis tuvastavad nii antigeeni kui ka HIV-vastaseid antikehi").

2. Ainult IgG klassi antikehade tuvastamine. 3. ja 4. põlvkonna testidega (IgG ja IgM antikehade tuvastamine) saadud positiivseid tulemusi on võimatu täielikult kinnitada.

3. Testi skoori tõlgendamise subjektiivsus, eriti "kahtlaste" ja "ebakindlate" tulemuste korral ning serokonversiooni algfaasis (nendel juhtudel on tuvastatavad ribad nitrotselluloosmembraanidel hägused, palja silmaga vaevu nähtavad ja erinevate isikute hinnangul esineb sageli lahkarvamusi).

4. Analüüsi tulemuste automatiseeritud kvantitatiivse hindamise võimatus.

5. Madalam tundlikkus võrreldes ELISA-ga.

6. Säilitamise haprus (säilitamise ajal tuhmuvad nitrotselluloosmembraani ribad ega saa olla objektiivseks kinnituseks HIV avastamisele või mitteavastamisele vastuolulistel juhtudel).

7. Raskused reaktsiooni seadistamisel ja säilitamisel (nitrotselluloosmembraani ribad on väga haprad ja sageli purunevad).

8. IS-komplektide kõrge hind.

Tuntud reaktiiv, mis on komplekt sama patogeeni, sealhulgas HIV, antigeenide ja antikehade samaaegseks määramiseks (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Samas ei avalikustata testisüsteemi, mis võimaldaks diagnoosida HIV-nakkust erinevates etappides.

Käesoleva leiutise eesmärgiks on saada testimissüsteem, mille abil on võimalik kinnitada HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antikehade sõeltestide positiivseid või kahtlasi tulemusi, kasutades teste samaaegseks antigeenid ja antikehad.

Kavandatav tehniline lahendus saavutatakse ensüümi immuunanalüüsi testimissüsteemiga inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) esimest ja teist tüüpi antikehade spektri tuvastamiseks, O rühma esimese tüübi ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeeni p24 tuvastamiseks. esimest tüüpi p24, mida iseloomustab see, et see sisaldab immunosorbenti, mis põhineb inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel, milleks on gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), HIV-antigeeni 1 p24 vastased antikehad ja tuvastamisreagendid, kusjuures ülaltoodud HIV-antigeenid ja HIV-antikehad adsorbeeritakse ensüümi immuunanalüüsi jaoks plaatide erinevatesse süvenditesse.

Lisaks kasutatakse sorptsiooniks 96 süvendiga polüstüreenist kokkupandavaid või mittekokkupandavaid plaate ensüümi immuunanalüüsi jaoks.

Käesoleva leiutisega saavutatud tehniline tulemus on HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide antikehade positiivsete tulemuste kinnitamise võimalus, kõrge tundlikkus, tulemuste automatiseeritud tõlgendamise võimalus, mis välistab hindamine, testi sooritamise lihtsus, väiksem kui olemasolevate kuludega IS komplektidega.

See tehniline lahendus erineb teadaolevatest:

1. Kasutage immunoloogiliste reaktsioonide jaoks tahke faasi kandeplaadina.

2. p 24 HIV antikehade ja HIV antigeenide komplekti samaaegne kasutamine sorbendina.

Leiutist illustreerib järgmine näide.

Väljatöötatud testimissüsteemi "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" toimeained on:

Immunosorbent – ​​HIV-1 struktuurvalkudele sarnased rekombinantsed antigeenid: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) ja monoklonaalne hiire antikehad HIV 1(p24) antigeeni vastu, mis on adsorbeeritud eraldi polüstüreenist kokkupandava plaadi ribadele.

Immunosorbentide valmistamiseks:

1. HIV-1 gp41 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 109.

3. HIV-1 p24 – E. Coli tüve nr AHIV 105 poolt toodetud valk.

4. HIV-1 p31 - valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 108.

5. HIV-2 p36 – E. Coli tüve nr AHIV 106 poolt toodetud valk.

Konjugaat 1, lüofiliseeritud või vedel, hiire monoklonaalsed antikehad HIV1 p24 antigeeni vastu, konjugeeritud biotiiniga.

1. Konjugaat 2, lüofiliseeritud või vedel, - HIV-1 struktuurvalkudega sarnaste rekombinantsete antigeenide segu: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 ( po1); HIV-2: biotiiniga konjugeeritud gp36 (env);

2. Konjugaadid 3, 4 - lüofiliseeritud või vedel - mädarõika peroksüdaasiga märgistatud streptavidiin;

Eeluuringute käigus valiti testsüsteemi disain, töötati välja selle komponentide valmistamise tehnoloogia ning optimeeriti ensüümi immuunanalüüsi läbiviimise tingimused.

ELISA seadistamisel testsüsteemis "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1" lisatakse plaadi süvenditesse p24 adsorbeeritud antikehadega 25 μl konjugaati-1 ja adsorbeeritud antigeenidega süvenditesse - 25 µl konjugaati-2. Reaktsiooniskeem on näidatud allpool. Järgmisena lisatakse igasse süvendisse 25 μl uuritavat proovi. Samal ajal muutub antigeenidega süvendite värvus oranžist roosaks ja antikehadega süvendis rohelisest halliks. Segu inkubeeritakse 45 minutit 37 °C juures loksutil (või 1 tund temperatuuril 37 °C termostaadis). Seejärel lisatakse ilma pesemata tableti süvenditesse 50 μl konjugaati-3 antigeeni p24 määramiseks ja 50 μl konjugaati-4 antikehade määramiseks. Pärast 20-minutilist inkubeerimist 37 °C juures loksutil (või 30-minutilist 37 °C juures termostaadis) plaati pestakse ja arendatakse substraadiseguga. Reaktsiooni koguaeg 1 tund 25 minutit (või 1 tund 50 minutit). Uuritavas proovis sisalduv p24 antigeen seondub p24 vastaste monoklonaalsete antikehadega ja spetsiifilised antikehad moodustavad plaadil rekombinantsete antigeenidega kompleksi. Saadud immuunkompleks anti-p24 koos p24-ga tuvastatakse anti-p24-biotiini konjugaatidega, seejärel streptavidiin-peroksidaasiga ja Ag-HIV immuunkompleksid At-HIV-ga tuvastatakse Ag-biotiini konjugaadiga, seejärel streptavidiin-peroksidaasiga. .

Reaktsiooni seadistamise skeem.

Tulemusi arvestatakse spektrofotomeetriliselt kahel lainepikkusel: 450/620-680 nm, seade on seatud "õhk". Arvestagem tulemusi ühel lainepikkusel 450 nm.

Analüüsi tulemusi võetakse arvesse, kui optilise tiheduse (OD) keskmised väärtused K-ga kaevudes ei ole suuremad kui 0,2, K+-ga kaevudes - mitte vähem kui 1,0. OP kriitik. arvutatakse valemiga:

OP kriitik. gp41 = vrd. väärtus OP K-(gp41)+0,15

OP kriitik. gp120 = vrd. väärtus OP K-(gp120)+0,15

OP kriitik. p24 = vt. väärtus OP K-(р24)+0,15

OP kriitik. p31 = vrd. väärtus OP K-(31)+0,15

OP kriitik. gp36 = vrd. väärtus OP K-(gp36)+0,15

OP kriitik. Ag p24 = vrd. väärtus OD kuni- (Ag p24)+0,04

kus 0,15 ja 0,04 on tootja juures statistilise töötlemise meetodil kehtestatud koefitsiendid. Testisüsteemi väljatöötamise käigus kasutati järgmist:

1. Tervete doonorite vereseerumi proovid (n=610).

2. Erinevate HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega (ARI, kopsupõletik, tonsilliit, herpeetiline ja tsütomegaloviirusnakkus, süüfilis, klamüüdia, viirushepatiit A, B ja C (n=224)) patsientide vereseerumiproovid.

3. Erinevate mittenakkushaigustega patsientide vereseerumi proovid - vigastused, südame-veresoonkonna haigused, onkoloogia (n=35).

4. Rasedate naiste vereseerumi proovid (n=40).

5. Vere seerumi proovid, ELISA seropositiivsed ja immunoblotiga kinnitatud (n=428).

6. Seerumiproovid positiivse tulemusega, mis on saadud HIV 1,2 antikehade ja p24 antigeeni samaaegseks määramiseks ensüümi immuunanalüüsi testisüsteemides ning määramatu immunobloti tulemus (n=123).

7. Seerumite sisemine paneel, mis sisaldab ja ei sisalda HIV 1.2 antikehi, testitud Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi registreeritud ensüümi immuunanalüüside ja immunobloti abil (n=21).

8. Standard "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Prantsusmaa, kat. 72217, mis on viiruse lüsaadist saadud antigeen.

9. Ettevõtte sisestandard. Proov, mis sisaldab p 24 antigeeni kontsentratsioonis 200 pg/ml, mis on saadud viiruse lüsaadist ja tiitritud vastavalt "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" firmale "BIO RAD", Prantsusmaa, kat. nr 72217.

10. Standardne seerumite paneel, mis sisaldab inimese immuunpuudulikkuse viiruse esimest tüüpi (HIV 1) antikehi – OSO 42-28-212-93-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

11. Standardne seerumite paneel, mis sisaldab inimese immuunpuudulikkuse viiruse teist tüüpi (HIV 2) antikehi - OSO-42-28-216-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

12. Standardpaneel seerumitest, mis ei sisalda inimese immuunpuudulikkuse viiruse antikehi esimest ja teist tüüpi (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

P24 antigeeni tuvastamise testimissüsteemi tundlikkuse hindamine viidi läbi ettevõtte sisestandardi "HIV I ANTIGEEN STANDARD" ja "BIO RAD" abil. Sisestandardit kasutades valmistati 4 järjestikust 2-kordset lahjendust vahemikus 40 pg/ml kuni 5 pg/ml, kasutades lahjendina normaalset doonori plasmat, mis ei sisaldanud HIV 1, 2 vastaseid antikehi. Tundlikkuse kriteeriumiks võeti väikseim tuvastatava antigeeni kogus. Saadud andmed on toodud tabelis 1.

Spetsiifiliste antikehade tuvastamise testimissüsteemi tundlikkuse hindamiseks kasutati standardseid proovide paneele, mis sisaldasid inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV 1, 2) antikehi (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-28-216- 02P (HIV 2) p.003).

Saadud andmed on toodud tabelites 3, 4.

Testisüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" diagnostilist efektiivsust võrreldi testsüsteemidega "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV". 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostics of HIV Uniform II Ag/Am" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1.2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Sel eesmärgil testiti sisepaneelilt võetud seerumiproove kõigis näidatud testides. Tabelis 5 esitatud tulemused näitavad "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" kõrget diagnostilist efektiivsust.

Testsüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" tundlikkuse uuringud viidi läbi ka patsientide vereseerumiga, mille immunoblotis kinnitati HIV-positiivne. Nendest seerumitest testiti kokku 428 proovi. Erinevate HIV valkude ja p24 antigeeni vastaste antikehade tuvastamiseks on saadud mitmeid võimalusi. Tulemused on toodud tabelis 6.

HIV 1 positiivsete proovide testimisel ilmnes gp36 (env HIV 2) suhtes positiivne reaktsioon 3% seerumitest. MP/OPcrit nendes proovides ei ületanud 2,0. Meie andmed HIV 1 (gp41) ja HIV 2 (gp36) välisümbrise valkude ristreaktiivsuse kohta on kooskõlas kirjanduse andmetega.

Tulemuste tõlgendamine

"DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" HIV-positiivsete seerumite ning standard- ja sisepaneelide proovide testimise analüüs võimaldas välja töötada kriteeriumid selle testi tulemuste tõlgendamiseks. Soovitatavad kriteeriumid on toodud tabelis 7.

Nende kriteeriumide alusel tuvastati kõik HIV-positiivsed seerumiproovid (n=428) positiivsetena uuringus "DS-ELISA-HIV-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1". HIV-vastaseid antikehi sisaldava standardpaneeli 16 proovist 1 määrati 14 positiivseks ja 2 määramatuks. Kõik 8 proovi standardpaneelist, mis sisaldasid HIV 2 antikehi, olid positiivsed. Sisepaneeli 10 proovist, mis sisaldasid HIV-vastaseid antikehi, 1 tuvastati 7 positiivsena ja 3 määramatuna.

Testsüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" tundlikkuse uuringud viidi läbi ka patsientide vereseerumiga, mille tulemus oli positiivne ensüümi immuunanalüüsi testisüsteemides, mis tuvastavad samaaegselt antikehi ja p24 antigeeni, ja immunoblotis määramatu. Kokku testiti 123 sellist proovi. Andmed on toodud tabelis 8.

Määramatu immunobloti tulemusega (n=123) seerumite testimisel "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" andis 72 proovi (58,5%) positiivset tulemust. Neist 26 seerumit (21,1%) on positiivsed ainult p24 suhtes, 20 (16,3%) - ainult antikehade suhtes, 16 (13%) - p24 suhtes, millel on ühe valgu vastased antikehad, 10 (8,1%) - p24-l. antikehad kahe või enama valgu vastu. Seega ainuüksi antikehade testimine (p24 ei tuvastata) annaks positiivse tulemuse 30 proovi (24,4%). P24 antigeeni tuvastamine testis võimaldas määrata positiivseks veel 42 proovi (34,1%).

Katsesüsteemi spetsiifilisuse hindamiseks kasutati standardset seerumite paneeli, mis ei sisaldanud HIV 1, 2 antikehi (n=20); vereseerumi proovid tervetelt doonoritelt (n=610), vereseerumi proovid erinevatelt HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega patsientidelt (n=224); erinevate mittenakkushaigustega patsientide vereseerumi proovid - vigastused, südame-veresoonkonna haigused, onkoloogia (n=35); rasedate naiste vereseerumi proovid (n=40). Kokku testiti 929 proovi. Tervete doonorite vereseerumite üks proov andis valepositiivse tulemuse – tuvastati gp41 ja p24 vastased antikehad. 7 tervete doonorite vereseerumi proovi ja 2 HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega patsientide vereseerumi proovi andsid p24 valepositiivse tulemuse.

Katsesüsteemi spetsiifilisuse hindamiseks kasutati standardset negatiivsete proovide paneeli (OSO 42-28-214-94-02p, lk 009). Spetsiifilisus oli 100%.

Seega on läbiviidud uuringud näidanud, et normaalsete doonorite ja erinevate nakkushaigustega patsientide vereseerumi proovide uurimisel on testisüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" spetsiifilisus 99%. ja somaatilised haigused.

Saadud andmed näitavad väljatöötatud testimissüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" kõrget diagnostilist efektiivsust. Testisüsteemi saab kasutada antikehade tuvastamiseks HIV 1. ja 2. tüüpi üksikute valkude ja HIV1 p24 antigeeni vastu, et kinnitada positiivne sõeluuringu tulemus antikehi tuvastavate testisüsteemidega või testsüsteemidega, mis tuvastavad samaaegselt antikehi ja HIV1 p24 antigeeni. Testimissüsteemi saab kasutada alternatiivse immunoblot-testina positiivsete tulemuste kinnitamiseks, samuti HIV ja p24 antigeeni vastaste antikehade dünaamika uurimiseks infektsiooni erinevates staadiumides.

TESTI EELISED

1. Kinnitav ensüümi immuunanalüüsi plaadi formaat

2. Kinnitav test, mis ühendab HIV 1, 2 antikehade spektri ja HIV 1 p24 antigeeni

3. Kõigi Ig klasside antikehade tuvastamine

4. Tundlikkus p24 tuvastamisel ei ole väiksem kui 5 pg/ml

5. Vähendab määramatuid tulemusi võrreldes immunoblotiga

6. Analüüsi aeg - 1 tund 25 minutit (immunoblot - 3 kuni 20 tundi)

7. Kõikide komponentide ja näidiste sisestamise visuaalne hindamine.

1. ELISA testisüsteem inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) esimest ja teist tüüpi antikehade spektri identifitseerimiseks, O rühma esimest tüüpi ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse esimest tüüpi p24 antigeeni p24 tuvastamiseks; mida iseloomustab see, et see sisaldab immunosorbenti, mis põhineb immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antikehadel HIV 1 antigeenile p24 ja tuvastavad reaktiivid, samal ajal kui ülaltoodud HIV antigeenid ja HIV antikehad adsorbeeritakse ensüümi immuunanalüüsi jaoks plaatide erinevatesse süvenditesse.

2. ELISA testsüsteem vastavalt nõudluspunktile 1, mida iseloomustab see, et sorptsiooniks kasutatakse 96 süvendiga polüstüreenist kokkupandavaid või mittekokkupandavaid plaate ensüümi immuunanalüüsi jaoks.

Käesolevas aruandes esitatakse HIV-vastaste antikehade määramise tulemused 40 823 inimese vereseerumis, sealhulgas sünnituseelsete kliinikute, polikliinikute, linnahaiglate, aga ka riskipatsientide (narkomaanid, haiged, kes on haigestunud) uurimisele ja ravile spetsialiseerunud meditsiinikeskuste patsiendid. viirushepatiit B, C ja suguhaigused). Uuringud viidi läbi 2005. aastal nimelises Sünnitusabi ja Günekoloogia Uurimisinstituudi immunoloogia laboris. ENNE. Ott Venemaa Meditsiiniteaduste Akadeemiast, kellel on ELISA meetodite kasutamise kogemus erinevate nakkushaiguste diagnoosimisel üle 15 aasta.

Vereseerumi proovide esmaseks uurimiseks kasutati CombiBest anti-HIV-1 + 2 testsüsteemi (ZAO Vector-Best, Novosibirsk), mis tuvastab kogu HIV-1 ja HIV-1 spetsiifilised antikehad uuritud inimese proovides. seerum või vereplasma 2 (immunoglobuliinide klassid A, G ja M). Selles diagnostikakomplektis kasutatakse rekombinantseid HIV-valke nii immobiliseerimiseks tablettide süvendites kui ka konjugaadina mädarõika peroksüdaasiga. Seerumite analüüsi tulemusi hinnati vastavalt testimissüsteemi juhiste soovitustele: negatiivsed (ei sisaldanud HIV-1 ja HIV-2 antikehi) loeti testitavateks proovideks, mille optiline tihedus (OD) ELISA ei ületanud ODcrit väärtust.

Laboris läbivaatamisel leiti, et 40 823 seerumiproovist 40 222 (98,5%) olid ELISA suhtes negatiivsed ja 601 (1,5%) testitud proovist peeti algselt positiivseks. Iga 601 seerumi kordusanalüüsi tulemusena järgmisel päeval kahes korduses (tableti kaks süvend) tuvastati 440 (73,2%) proovi positiivsena ja 161 (26,8%) negatiivsena. Vastavalt Tervise- ja Sotsiaalarengu Ministeeriumi soovitustele külmutati 440 skriiningpositiivset seerumit, mis viidi täiendavateks kinnitavateks uuringuteks haigla nr. S.P. Botkina. Need uuringud viidi läbi ELISA testsüsteemidega „ECOlab-Vironostics HIV 1.2 Ag/Ab“ („ECOlab“, Elektrogorsk), „Genscreen Plus“ HIV Ag-Ab” (BioRad, USA), samuti immunoblotkomplektid. Kinnitustestide 440 seerumi analüüsi tulemused viisid järeldusele, et 323 (73,4%) proovi on positiivsed ja 102 (23,2%) on negatiivsed. 15 uuritud proovi kohta (3,4%) saadi ebamäärane analüüsitulemus.

Tuleb märkida, et nendest 323 positiivsest seerumist 314 (97,2%) OD väärtused, mis saadi meie laboris nende esmase testimise käigus, kasutades CombiBest anti-HIV-1+2 testisüsteemi, jäid vahemikku 0,900 kuni 1,780 ja 9 puhul. (2,8%) proovid - 0,500-0,900. OD väärtused, mis saadi 52 proovi (51%) 102 negatiivse seerumi skriinimisel, jäid vahemikku 0,195 kuni 0,400; 40 (39,2%) proovi puhul - 0,401–0,800; 10 (9,8%) proovi - üle 0,800.

Nii selgus tehtud töö tulemusena, et vereseerumi esmane uuring HIV-nakkuse seroloogiliste markerite olemasolu tuvastamiseks, kasutades CombiBest anti-HIV-1+2 testsüsteemi, on kõrge efektiivsusega. Positiivseid sõeluuringu tulemusi kinnitasid täiendavad uuringud referentlaboris 73% juhtudest ja valepositiivseid tulemusi registreeriti ainult 0,25% 40 823 analüüsitud seerumist.

Üldine teave uuringu kohta

HIV (inimese immuunpuudulikkuse viirus) on retroviiruste perekonda kuuluv viirus, mis nakatab inimese immuunsüsteemi rakke (CD4, T-helpers). Põhjustab AIDS-i.

HIV-1 on kõige levinum viiruse tüüp, mida leidub kõige sagedamini Venemaal, USA-s, Euroopas, Jaapanis ja Austraalias (tavaliselt alatüüp B).

HIV-2 on haruldane tüüp, levinud Lääne-Aafrikas.

Inimese immuunpuudulikkuse viiruse diagnoosimiseks kasutatakse kombineeritud neljanda põlvkonna testsüsteemi, mis suudab tuvastada HIV-nakkuse juba 2 nädalat pärast viiruse sattumist verre, samas kui esimese põlvkonna testsüsteemid teevad seda alles 6-12 nädala jooksul. pärast nakatumist.

Selle kombineeritud HIV testi eeliseks on, et tänu HIV-1 p24 vastaste antikehade kasutamisele reagentidena tuvastatakse spetsiifiline p24 antigeen (viiruse kapsiidivalk), mida saab selle testiga tuvastada juba 1-4 nädalat pärast nakatumist. st isegi enne serokonversiooni, mis vähendab oluliselt "akna perioodi".

Lisaks tuvastab selline HIV-test verest HIV-1 ja HIV-2 vastaseid antikehi (kasutades antigeen-antikeha reaktsiooni), mida toodetakse piisavas koguses, et testimissüsteem saaks määrata 2-8 nädala pärast alates hetkest. infektsioonist.

Pärast serokonversiooni hakkavad antikehad seostuma p24 antigeeniga, mille tulemuseks on positiivne HIV antikehade test ja negatiivne p24 test. Kuid mõne aja pärast tuvastatakse veres korraga nii antikehad kui ka antigeen. Lõplikus staadiumis võib HIV-i antikehade AIDSi test anda negatiivse tulemuse, kuna antikehade tootmise mehhanism on häiritud.

HIV-nakkuse etapid

1. Inkubatsiooniperiood ehk “seronegatiivse akna periood” on aeg nakatumise hetkest kuni viiruse vastaste kaitsvate antikehade tekkeni veres, mil HIV-antikehade testid on negatiivsed, kuid inimene võib juba viirust edasi kanda. teised inimesed. Selle perioodi kestus on 2 nädalat kuni 6 kuud.
2. Äge HIV-nakkuse periood tekib keskmiselt 2-4 nädalat pärast nakatumist ja kestab ligikaudu 2-3 nädalat. Selles etapis võivad mõnedel inimestel viiruse aktiivse replikatsiooni tõttu tekkida mittespetsiifilised gripilaadsed sümptomid.
3. Varjatud staadium on asümptomaatiline, kuid selle käigus väheneb järk-järgult immuunsus ja suureneb viiruse hulk veres.
4. AIDS (omandatud immuunpuudulikkuse sündroom) on HIV-nakkuse viimane staadium, mida iseloomustab immuunsüsteemi tõsine allasurumine, aga ka kaasuvad haigused, entsefalopaatia või vähk.

Vaatamata sellele, et HIV-nakkus on ravimatu, on tänapäeval olemas väga aktiivne retroviirusevastane ravi (ART), mis võib oluliselt pikendada HIV-nakkusega inimese eluiga ja parandada selle kvaliteeti.

Sellel testil on eriti kõrge diagnostiline väärtus, kui HIV-nakkus tekkis vahetult enne testimise aega (2-4 nädalat).

Milleks uuringuid kasutatakse?

Analüüsi kasutatakse HIV varajaseks diagnoosimiseks, mis aitab vältida viiruse edasist edasikandumist teistele inimestele, samuti õigeaegselt alustada retroviirusevastast ravi ja ravida haigusi, mis soodustavad HIV-nakkuse progresseerumist.

Millal on uuring planeeritud?

• Ebaselge etioloogiaga püsivate sümptomitega (2-3 nädalat): subfebriili temperatuur, kõhulahtisus, öine higistamine, järsk kaalulangus, lümfisõlmede turse.
• Korduva herpesinfektsiooni, viirushepatiidi, kopsupõletiku, tuberkuloosi, toksoplasmoosiga.
• Kui patsient põeb sugulisel teel levivaid haigusi (süüfilis, klamüüdia, gonorröa, genitaalherpes, bakteriaalne vaginoos).
• Kui patsient on olnud kaitsmata vaginaalses, anaalses või oraalseksis mitme seksuaalpartneriga, uue partneriga või partneriga, kelle HIV-staatuses patsient pole kindel.
• Kui patsiendile tehti vereülekande protseduur (kuigi sellisel viisil nakatumise juhud on praktiliselt välistatud, kuna verd testitakse hoolikalt viirusosakeste esinemise suhtes ja seda kuumtöötletakse spetsiaalselt).
• Kui patsient on süstinud ravimeid mittesteriilsete instrumentidega.
• Raseduse/raseduse planeerimise ajal (AZT raseduse ajal, keisrilõige, et vältida viiruse ülekandumist lapsele sünnikanalist läbimise ajal ja rinnaga toitmata jätmine, vähendavad HIV-i emalt lapsele edasikandumise riski 30% võrra kuni 1%).
• Juhuslik süstimine nakatunud verd sisaldava süstla või muu esemega (nt meditsiiniline instrument) (sellistel juhtudel on nakatumise tõenäosus äärmiselt väike).